一种裂殖壶菌CRISPR/Cas9基因编辑系统及其应用的制作方法

本发明涉及基因工程领域，尤其是一种涉及裂殖壶菌（schizochytriumsp.）crispr/cas9基因编辑系统及其应用。
背景技术：
：裂殖壶菌是一种高产dha的海洋真菌，因其生长速率快，发酵产生的油脂中不饱和脂肪酸成分简单，dha含量高而成为研究的热点。裂殖壶菌主要通过pks和fas两种途径来分别合成饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸，目前通过菌种选育、培养基优化和发酵调控来提高裂殖壶菌中不饱和脂肪酸的含量已经陷入瓶颈，需要对裂殖壶菌胞内脂肪酸合成途径的关键酶及调控因子进行深入研究，而裂殖壶菌遗传转化体系是研究代谢机制的重要手段。因此，亟需一个高效且可以实现多重编辑的工具，来实现裂殖壶菌体内多重基因编辑。crispr/cas9系统是一种新兴基因编辑工具，具有脱靶率低、操作简便、可实现多重编辑等优点而被广泛应用。目前，针对裂殖壶菌的基因改造，国内外学者主要采用同源重组的方法进行基因的过表达或者敲除，比如专利201710327363.x基于同源重组的方法，将用来自希瓦氏菌pks酶中的酰基转移酶功能域替换裂殖壶菌pks酶中的酰基转移酶功能域，提高了菌种中的epa含量；专利201710747980.5和专利201710078025.7同样采用同源重组技术分别在裂殖壶菌中过表达丙二酸单酰转移酶基因和敲除酮基合成酶，最终调控了菌种的油脂积累和脂肪酸合成，但是同源重组的方法，效率不高。近年来，crispr/cas技术在基因编辑方面的成就十分显著，被广泛应用于基因编辑领域。crispr/cas系统是存在于细菌和古菌中的防御系统，用以免疫噬菌体以及外源dna的入侵。crispr/cas系统由重复的间隔序列（clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats）和crispr相关基因（cas）组成。根据菌种的不同，重复的间隔序列由多个21~48bp回文重复序列和26~72bp重复序列间非重复间隔序列组成。当外源dna第一次入侵细菌时，cas核酸酶可在sgrna的引导下与外源序列结合并切割dna双链，产生新的间隔序列并插入至已有的间隔序列中。若相同dna再次入侵，cascade复合体识别，结合和剪切之，特异性降解外源dna。但是目前，crispr/cas9的基因编辑方法在裂殖壶菌中未广泛应用，为提高裂殖壶菌的基因编辑效率，本发明构建了裂殖壶菌的crispr/cas9基因编辑系统，并成功敲除了裂殖壶菌尿嘧啶合成途径的酶，得到一株尿嘧啶缺陷型的菌株，为后续的裂殖壶菌在合成生物学中的应用提供了技术指导。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种基于crispr/cas9的应用于裂殖壶菌（schizochytriumsp.）的高效基因编辑系统，有效解决该重要产油微生物遗传改造困难的问题。为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：一种应用于裂殖壶菌的crispr/cas9基因编辑系统，在pbs-zeo质粒中引入调控元件得到，所述调控元件包括裂殖壶菌pa8047启动子调控的cas9蛋白、裂殖壶菌内源性核定位信号、终止子ta8047和由裂殖壶菌pu6-2启动子调控的sgrna转录盒。所述的pa8047启动子的核苷酸序列如seqidno：1所示；所述的ta8047终止子的核苷酸序列如seqidno：2所示。pa8047启动子和ta8047终止子为经筛选获得的裂殖壶菌内源性启动子，属于中等强度启动子，能够良好表达cas9序列。所述的cas9蛋白的核苷酸序列如seqidno：3所示，所述的裂殖壶菌内源性核定位信号的核苷酸系列如seqidno：4所述。所述sgrna转录盒包括pu6-2启动子、sgrna识别的靶序列以及grnascaffold(grna支架)；进一步的，所述pu6-2启动子的核苷酸序列如seqidno：5所示；所述sgrnascaffold的核苷酸序列如seqidno：6所示。进一步的，所述系统还包括sv40核定位信号（pkkkrkv），所述sv40核定位信号与裂殖壶菌内源性核定位信号分别连接cas9蛋白的两端，可提高效率。本发明还提供了上述crispr/cas9基因编辑系统的构建方法，步骤如下：（1）将pa8047启动子、裂殖壶菌内源性核定位信号、cas9蛋白基因、终止子ta8047进行融合与原始载体pbs-zeo进行重组连接构建载体pbs-cas9。（2）将步骤（1）构建好的重组载体pbs-cas9单酶切后与裂殖壶菌pu6-2启动子调控的sgrna转录盒重组连接构建crispr/cas9重组载体；（3）将步骤（2）构建好的crispr/cas9重组载体转至e.colidh5α感受态细胞，提取转化子质粒dna并验证；挑取验证正确的转化子进行液体富集，培养后大量提取重组载体质粒dna，此即本发明所述的crispr/cas9基因编辑系统。所述步骤（3）中，将构建好的crispr/cas9重组载体通过热激法转化至大肠杆菌dh5α感受态细胞中。所述培养方式如下：单菌落挑取于50mllb液体培养基中，200rpm、37℃振荡培养，过夜培养12小时，利用axygene质粒小提试剂盒提取后得到重组载体质粒dna。本发明还提供了crispr/cas9基因编辑系统在裂殖壶菌基因编辑中的应用，将构建好的质粒转化入裂殖壶菌感受态细胞中，取孵育液涂布于抗性筛选平板倒置培养，挑取转化子于单菌落于裂殖壶菌种子培养基中进行富集，富集后的阳性克隆菌株进行提取基因组dna，pcr验证获得基因敲除的重组菌株。本发明的基因编辑系统在初次构建完成后，如需改变敲除的目的基因，只需通过更换系统中的sgrna识别的靶序列即可实现。本发明具有如下有益效果：（1）将敲除载体涉及的所有调控元件（cas9表达启动子pa8047，cas9基因、终止子ta8047、sgrna转录盒启动子pu6-2、sgrna识别靶序列n20，以及grnascaffold的转录盒子）构建于同一载体，操作方便快捷；构建的crispr/cas9基因编辑体系设计简单、成本低。（2）采用裂殖壶菌内源性的启动子来控制cas9蛋白和sgrna的表达，可提高表达效果；（3）设计采用内源性的核定位信号引入到载体中，更加有效地将cas9蛋白引入到细胞核进行切割。此外还可增加通用型的sv40核定位信号，辅助定位，提高效率。（4）筛选的cas9表达启动子pa8047、终止子ta8047能够良好表达cas9序列，属于中等强度启动子，不会因为过度表达导致cas9表达过多而产生细胞毒性。（5）本发明基于crispr/cas9系统获得了尿嘧啶缺陷性的裂殖壶菌菌株，为后续该菌株的基因改造提供了优良的实验材料。附图说明图1为本专利构建的裂殖壶菌crispr基因敲除质粒骨架图。图2为原始菌和敲除菌在5-foa和尿嘧啶缺陷平板上的生长情况。图3为原始菌和敲除菌的形态图。具体实施方式为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利、并不用于限定本发明。以下实施例以敲除裂殖壶菌oprt酶编码基因pyrf基因为例，构建基因敲除系统及基因敲除重组菌。本发明中的生物材料来源如下：裂殖壶菌（schizochytriumsp.)hx-308，已公开于本实验室在先申请的专利cn104974944b中，保藏编号为cctccno.m209059；质粒pbs-zeo，已公开于本实验室在先申请的专利cn104974944b中；质粒puc-cas9，将密码子优化后的cas9序列连接至puc57质粒构建而成，具体构建方式可参照《分子克隆实验指南》；其中cas9序列为委托基因公司合成的含密码子优化的cas9序列，其核苷酸序列如seqidno：3所示；质粒puc-ffucas9-htbnls-hph已公开于本实验室在先发表的文章acssynth.biol.2019,8,445−454中。实施例1一种crispr/cas9基因编辑系统及其构建方法根据如图1质粒图构建cas表达载体，以裂殖壶菌内源性启动子p4（即pa8047）引导cas9表达，裂殖壶菌内源性启动子u6-2引导sgrna序列表达，内源性核定位信号e-nls为例表述如下：（1）将cas9表达启动子pa8047、nls、cas9基因、终止子ta8047与pbs-zeo连接；以裂殖壶菌基因组dna为模板，采用引物pbs-lb-ucprof/pro-cas9r，egfp-terf/egfp-ter-rb-pbsr，cas9-nlsf/e-nlsr分别扩增启动子pa8047、终止子ta8047和nls，采用引物40aaednls-dcas9f/cas9-egfpr以质粒puc-cas9为模板扩增cas9基因，将上述四个片段纯化回收，使用一步克隆酶将上述四个片段重组至已双酶切（bgiii/ecori）回收的pbs-zeo载体中，连接产物通过热激法转化至大肠杆菌dh5α感受态细胞中。挑取阳性克隆经菌落pcr及测序验证后，表明cas9表达元件构建成功，获得重组载体pbs-cas9。（2）sgrna转录盒启动子pu6-2、sgrna识别靶序列n20，以及grnascaffold重组至pbs-cas9载体。以裂殖壶菌基因组dna为模板，采用引物u6-2f/u6-2r扩增启动子pu6-2，以puc-ffucas9-htbnls-hph质粒为模板，采用引物grna-u62f/u6-2grnar扩增grnascaffold片段，人工合成sgrna识别靶序列n20，将pcr片段纯化回收后，与单酶切（noti）的pbs-cas9载体进行连接，连接产物利用热激法转化至大肠杆菌dh5α感受态细胞中。挑取阳性克隆经菌落pcr及测序验证后，表明sgrna表达盒构建成功，进一步测序确认后，获得重组载体pbs-cas9-grna1（u6-2）（如图1）。步骤（1）（2）连接体系和条件为：来自南京诺唯赞有限公司的onestepcloningkit试剂盒，酶切后的载体nbp*0.02ng、片段nbp*0.02ng，exnasemultis2ul、5×cemultisbuffer4ul、ddh2oupto20ul，37℃，反应30min。此系统在初次构建后，如需改变敲除的目的基因，只需要通过更换系统中的n20序列即可，具体操作方法如下：更换n20序列是，以设计好的目标位点的基因序列为模板，合成1条引物，利用合成引物与引物u6-2grnar直接以pbs-cas9-grna1（u6-2）质粒为模板进行扩增，扩增完成引物直接重组连入pbs-cas9质粒，进而引导cas9蛋白对基因组中的新的目的基因的特异性切割。如需改变引导cas9蛋白表达的启动子，直接更换cas9前方序列重新整合至载体即可；如需改变引导grna表达的启动子，直接更换grna前方序列重新整合至载体即可；如需比较不同核定位信号，只需更换cas9序列的n和c端处核定位信号序列即可。本发明所使用的引物见下表：表1主要引物及核苷酸序列引物名称序列信息（5’-3’）seqidpbs-lb-ucprofttttggtcatgcatgagatcagatctgtttacaccacaatatatcctgcca7pro-cas9rgtacttcttgtccatcttggccttgtcttgtttcctgc8cas9-nlsfagacaaggccaagatggacaagaagtactcgattggc9e-nlsrcaccttgtaaatgtacgaggagtag1040aaednls-dcas9facaaggtgatggacaagaagtactcgattggc11cas9-egfprcccttggagaccatgactttacgttttttcttcggcgaacc12egfp-terfaaaaacgtaaagtcatggtctccaagggcgagg13egfp-ter-rb-pbsrataagcttgatatcgaattctgacaggatatattggcgggtaaaccggaaa14u6-1fagctccaccgcggtggcggccgctgacgtcgattttattggcagt15u6-1rctgcgtgggcgagagtgggtaactcttacttatatagtataagc16grna-u61fttacccactctcgcccacgcagaccagcgagt17u6-1grnartccactagttctagagcggccgcaaaaaaagcaccgactcggtgcc18u6-2fagctccaccgcggtggcggccgctgacgtcgattttattggcagt19u6-2rctgcgtgggcgagagtgggtaactcttacttatatagtataagc20grna-u62fttacccactctcgcccacgcagaccagcgagt21u6-2grnartccactagttctagagcggccgcaaaaaaagcaccgactcggtgcc22oprtfatcctctgcagcggagtcgaga23oprtrttcggcttgtacgcggcggcca24p1-t-fttagtccgacttggccttggttacttgtagagctcgtcca25p1-t-rggtttgaattctcggtaccaccgcgtaatacgact26p2-p-fgctttagatcttctcatcttggtcatcttgc27p2-p-rtcctcgcccttggagaccatcttttcacgagctgttgtgg28p3-p-fgctttagatctgctcgagaccgagctctcctcct29p3-p-rgcccttggagaccatcttcggttcttctcgctgc30p4-p-fggtttagatctatgtccagtggaggcagagagcc31p4-p-rcccttggagaccatcttggccttgtcttgtttcctgc32实施例2不同核定位信号对敲除效率的影响按照实施例1的方法更换不同的内源性核定位信号序列，考察不同核定位信号组合对敲除效果的影响，基因组编辑效果根据阳性克隆数获得。结果如表2所示。（实施例中内源性定位信号连接cas9蛋白n端，sv40连接c端）表2不同核定位信号的基因组编辑效果核定位信号基因组编辑效果e-nls++sv40+e-nls+sv40+++可见，利用裂殖壶菌内源性核定位信号序列的编辑效率高于传统的sv40序列，且将两种核定位信号共同使用可大幅度增加编辑效率。实施例3不同启动子控制cas9蛋白和sgrna表达对敲除效率的影响按照实施例1的方法，以表1中的引物序列获得p1-p4四种启动子（seqidno：33-36），以启动cas9蛋白的表达，考察其对敲除效果的影响，表达量通过rna测序或rt-pcr方法获得，基因组编辑效果根据阳性克隆数获得。结果如表3所示。表3不同启动子基因组编辑效果不同的启动子表达量基因组编辑效果p1277.11++p2132.56+p337302.13+p4914.51+++u6-1-+u6-2-+++可见，利用中等强度启动子p4（即pa8047）启动cas9蛋白的表达，编辑效率最高；u6-2启动子的有利于sgrna的表达。实施例4基于crispr/cas9的裂殖壶菌pyrf基因敲除将实施例1构建成功的pyrf基因敲除载体转化入裂殖壶菌hx-308感受态细胞中（吸取感受态细胞与载体dna混合物至2min预冷的电转杯中，冰浴静置10min，电压1.65kv进行电击，迅速加入1ml裂殖壶菌种子培养基中混匀，孵育，30℃、170rpm、复苏4h）；取适量孵育液涂布于1.0g/l浓度的5-foa抗性筛选平板，28℃倒置培养，48h后挑取转化子于单菌落与裂殖壶菌种子培养基（50ml）中进行富集，富集后的阳性克隆菌株进行提取基因组dna，以optr-f/oprtr引物进行pcr验证，获得pyrf基因敲除的重组菌株mt10-1，mt9-2。该菌株呈现出尿嘧啶缺陷性状，证明重组菌中尿嘧啶基因被破坏（如图2，3）。以上所述实施例仅表达了本发明的一种实施方式，其描述较为具体和详细上述实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。序列表<110>南京工业大学<120>一种裂殖壶菌crispr/cas9基因编辑系统及其应用<130>xb20102901<160>36<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>800<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1tttgtttcttacatcaattcattcgttcgctcacgcactccttctttattactattagaa60ggcgcgcacacccgcacacccacactctctccccacacccgccccagcgcgcgcgcaaag120agctagagtgaagaagggagagggggggcagagagagagaaagaaaccaaagaaaaagaa180ggaaagaaagaaagaaagaaagaaagaaagaaagaaagaaaacaaaacaaaggatggtaa240aagaagtcccctccactctactccactccactcctctccactccactccactccactcct300ctccactcctcgccactcagctgctctccagtccgctcgacgctgcgctctctccagtct360cgggtctcgccgtgtccgcaggcgcacgcggcgcagcacgcggctctgtgcgcggccccg420tcttctctggcgccgcccgcagggaggctccctctgctccgcaggaagggaggaaggtgc480tcgcgcggcccgcgctctctcctctctcctttcctctctgtgtctgctgctcgcttgggt540gaacttttttttaaactttgttacctttgcacccatttcccgctcgcctcggctgtttct600cgcctccggggccagagagagaggcggcctctgcacgcagcaaacaccattcgagggcca660gcaggcagtcccgtgcagaacgagaccggccgtgctttcgccttgctttgcgttgccagg720aacagcagcagcagcagcaagagcaagagcaagagcaacggcagcaggtttaccttcgga780ggaccagaaccagagaaacc800<210>2<211>1189<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2atggtctccaagggcgaggagctctttaccggcgtcgtccctattctcgtcgagctcgac60ggcgacgtcaacggccacaagttttccgtctccggcgagggcgagggcgacgccacctac120ggcaagctcaccctcaagtttatttgcaccaccggcaagctccccgtcccttggcctacc180ctcgtcaccaccctcacctacggcgtccagtgcttttcccgctaccccgaccacatgaag240cagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgagggctacgtccaggagcgcaccattttc300ttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtcaagtttgagggcgacaccctc360gtcaaccgcattgagctcaagggcatcgactttaaggaggacggcaacattctcggccac420aagctcgagtacaactacaactcccacaacgtctacatcatggccgacaagcagaagaac480ggcatcaaggtcaacttcaagatccgccacaacattgaggacggctccgtccagctcgcc540gaccactaccagcagaacacccctattggcgacggccctgtcctcctccccgacaaccac600tacctctccacccagtccgccctctccaaggaccctaacgagaagcgcgaccacatggtc660ctcctcgagtttgtcaccgccgccggcattaccctcggcatggacgagctctacaagtaa720atggtaaacccggtttttgtacttttctgactttttcactcctctctcttgctccttttg780tctttttgctgattgtttgagcctgaggcgagttattggtgactggaccttgtgtgcctt840gttttgcccccttcttgttttcaagggtgatcaagccgaagcagagctgatttttgcttg900ggtccacaaccaagatcgaggatggaggatggcgcgccctcggaggacgtcttgcgcgag960agcggcggcagcgcagggggcctcgtgaccgtggtgctggatatgaacgaagctctttgg1020gcgcaagtgtcggccaagggcggcgaggacaacgtgacgctcgcgagcgccctcagcagc1080gtggtggtctttctcaacgccgtgcagctcatggaccgtgaaagcgaggtctgtgtcgtg1140gcagagtgccccgacggcactgcgcgcgtacttgctcgtggtgtttccg1189<210>3<211>4131<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3atggacaagaagtactcgattggcctcgatatcggcaccaacagcgtcggttgggcggtg60atcacggacgagtacaaggtccccagcaagaagttcaaggtcctcggcaatacggatcgc120cattcgattaagaaaaaccttatcggcgccctcctctttgatagcggcgagacggccgag180gcgacccgcctcaaacgcaccgcccgccgtcgctacacccgtcgtaagaaccgcatctgc240tacctccaagagatcttttcgaatgagatggccaaggtggacgactcgtttttccaccgc300cttgaggagtcgttcctcgtcgaggaggataagaagcacgagcgccatccgattttcggt360aatatcgtcgacgaggtggcgtaccacgagaaatatcccaccatctaccacctccgcaag420aaactcgtggactcgacggacaaggcggacctccgcctcatctacctcgcgctcgcccac480atgattaaattccgcggccatttcctcatcgagggcgatcttaaccccgacaacagcgac540gtggacaagctcttcatccagctcgtccagacgtacaaccaactctttgaggagaacccc600attaatgcctcgggcgtggatgcgaaggccatcctttcggcgcgtctcagcaagagccgc660cgcctcgaaaatcttatcgcccagctccccggtgagaaaaagaacggtctcttcggcaac720cttattgcgctttcgcttggcctcacccccaacttcaaatcgaatttcgacctcgcggag780gacgccaagctccagctctcgaaggacacgtacgatgatgacctcgacaaccttctcgcc840cagatcggtgaccagtacgccgacctcttcctcgcggccaaaaaccttagcgac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