CD4阳性细胞特异性基因传递载体及其应用的制作方法

本发明涉及分子药物学分子医学领域，特别是涉及cd4阳性细胞特异性基因传递载体及其应用。

背景技术：

cd4⁺t细胞(即cd4阳性细胞)是一类具有重要作用的免疫细胞，在许多疾病的发生与发展中，发挥重要作用，如hiv感染/艾滋病、多种癌症、自身免疫性疾病和过敏性疾病。此外，cd4⁺t细胞通过与cd8⁺t细胞、b细胞和树突状细胞等不同免疫细胞相互作用，在免疫应答的协调方面发挥关键作用。因此，cd4⁺t细胞不仅是了解基础免疫学的重要靶细胞，而且也是基因治疗和免疫治疗的重要靶细胞。

到目前为止，对cd4⁺t细胞的基因改造主要基于慢病毒载体(lvs)体外导入。然而，体外基因转移需要经过细胞的分离、长期扩增和再融合等操作，以上操作可能改变细胞的特性，降低其在体内的持久性，并导致不良反应。因此，非常有必要开发一种cd4⁺t细胞特异性基因传递载体，无论是局部还是全身给药的情况下，均可以起到将治疗基因递送到cd4⁺t细胞中。

理想的基因载体需要具备几种特点：安全性高、不影响目的基因的表达、制备过程简单、价格低廉、能够长期稳定表达目的基因、具有靶向作用可将目的基因传递至靶细胞内、可调控目的基因在靶细胞内特异性表达等。因此，设计和开发安全、高效及靶向的基因载体是基因治疗领域的研究重点。在众多病毒载体中，腺相关病毒(aav)由于高安全性及低免疫原性等优势，成为基因治疗最具前景的基因递送载体。

重组腺相关病毒(recombinantadeno-associatedvirus，raav)是人们利用dna重组技术，对野生型aav进行改造生产出来的可在人体内进行基因递送的载体。raav的衣壳由三种分子量大小不同的衣壳蛋白(vp)组成，每一个raav颗粒中含有5个vp1、5个vp2和50个vp3。vp1、vp2和vp3均由aav病毒的同一个cap基因编码而成，羧基端完全一致。但由于转录起点不同，vp1比vp2在氨基端多37个氨基酸，vp2比vp3在氨基端多65个氨基酸。衣壳蛋白的氨基酸组成决定了raav的宿主细胞类型。当raav进入人体后，通过aav病毒衣壳与细胞表面受体的相互作用进入细胞内部，在转基因表达框内启动子及增强子的调控下实现目的基因的表达，从而达到基因治疗的目的。近年来，raav载体在许多人类疾病的基因治疗中占据了中心地位。截至目前为止，已有176个raav药物处于临床试验研究阶段，极具应用前景。

尽管raav载体在基因治疗的临床应用上取得了成功，但作为cd4⁺t细胞的基因递送系统仍面临着重大挑战。天然血清型aav可以转导多种细胞和组织，但对cd4⁺t细胞几乎不具有转导能力，必须进行适当改造。现有技术表明，将特异性靶向cd4阳性细胞的适体与sirna结合，可以靶向转染cd4⁺t细胞，且有效敲低cd4⁺t细胞内相关基因的表达水平，在人源化小鼠体内有效防止hiv的感染。还有研究表明，直接将可靶向结合cd4阳性细胞的darpin序列融合进aav衣壳蛋白，所得到的aav载体可以靶向递送至cd4⁺t细胞。但是，采用文献方法对raav载体进行表面靶向配体修饰，特异性靶向cd4阳性细胞的适体的修饰效率不理想，darpin序列融合后会极大地降低raav载体的生产效率，很难作为可临床应用于cd4⁺t细胞的体内靶向基因递送载体。

技术实现要素：

基于此，本发明提供了cd4阳性细胞特异性基因传递载体及其应用。本发明提供的具备靶向cd4⁺t细胞的新型raav载体，能够用于制备hiv感染导致的艾滋病、人类t淋巴细胞白血病病毒1型(htlv-1)感染导致的成人t细胞白血病(atl)等恶性疾病的基因治疗药物或基因编辑药物。

为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

本发明提供了一种cd4阳性细胞特异性基因的传递载体，所述传递载体为在重组腺相关病毒的衣壳蛋白中插入一个七肽的重组腺相关病毒；所述七肽的氨基酸序列如sedidno：1～26中的任意一条所示。

优选的，所述七肽的氨基酸序列如sedidno：1或sedidno：2所示。

优选的，所述七肽的氨基酸序列插入的位置为重组腺相关病毒衣壳蛋白的第588和589氨基酸残基之间。

本发明还提供了上述传递载体在制备基因治疗人类t淋巴细胞白血病病毒感染相关疾病的药物中的应用。

本发明还提供了上述传递载体在制备基因编辑人类t淋巴细胞白血病病毒感染相关疾病的药物中的应用。

优选的，所述人类t淋巴细胞白血病病毒感染相关疾病包括：hiv感染导致的艾滋病、人类t淋巴细胞白血病病毒1型感染导致的成人t细胞白血病。

本发明提供了一种cd4阳性细胞特异性基因的传递载体，所述传递载体为在重组腺相关病毒的衣壳蛋白中插入一个七肽的重组腺相关病毒；所述七肽的氨基酸序列如sedidno：1～26中的任意一条所示。本发明通过在raav衣壳中插入一个七肽后，使得raav能够靶向高效递送转基因元件至cd4阳性细胞。本发明提供的传递载体通过cd4阳性细胞为靶细胞进行转基因表达的验证可知，所述传递载体能够选择性转导cd4阳性细胞，转基因表达水平明显高于野生型aav2载体，且能够进行有效的靶向基因编辑。由应用例可知，在衣壳中插入本发明提供的七肽的重组腺相关病毒(raav)对jurkat细胞的转导效率显著高于野生型raav2，且编辑效率高于野生型raav2。

附图说明

图1为野生型aav2基因组示意图及构建衣壳修饰文库质粒的引物设计位置；

图2为在96个单菌落中的插入序列测序结果；

图3为经3～5轮筛选后得到的靶向cd4细胞的插入序列；其中a为筛选前后插入序列的测序结果；b为经过第3，4，5轮筛选后，各插入序列富集度的饼状图，每一轮测定3个重复；

图4为raav-nsv、raav-ndt和野生型raav2对jurkat细胞的转导效率的比较，从左到右每列依次为野生型raav2、raav-nsv和raav-ndt；

图5为raav-nsv、raav-ndt和野生型raav2对a549细胞的转导效率的比较，从左到右每列依次为野生型raav2、raav-nsv和raav-ndt；

图6为raav-nsv、raav-ndt和野生型raav2载体介导的cd4阳性jurkat细胞的基因编辑效率的比较结果，从左到右依次为raav-nsv、raav-ndt和野生型raav2。

具体实施方式

本发明提供了一种cd4阳性细胞特异性基因的传递载体，所述传递载体为在重组腺相关病毒的衣壳蛋白中插入一个七肽的重组腺相关病毒；所述七肽的氨基酸序列如sedidno：1～26中的任意一条所示。

本发明在raav衣壳蛋白的特定位置插入上述任一条七肽后，能够改变raav与宿主细胞结合的配体，得到的新型raav载体获得了与cd4阳性细胞特异性结合的能力，能够将所携带的转基因序列靶向递送cd4阳性细胞中。

在本发明中，所述七肽的氨基酸序列优选如sedidno：1或sedidno：2所示。插入这两个七肽的新型raav载体，均可以高效转导cd4阳性细胞。本发明所述的sedidno：1或sedidno：2在插入raav衣壳蛋白后得到的新型raav载体，相较于插入sedidno：3～26得到的新型raav载体，具有更高效地转导cd4阳性细胞的技术效果。

在本发明中，所述七肽的氨基酸序列插入的位置优选为重组腺相关病毒衣壳蛋白的第588和589氨基酸残基之间。本发明提供的氨基酸序列插入位置，在七肽的氨基酸序列插入该部位后，不仅能够有效破坏raav载体与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(hpsg)受体结合的能力，因此降低了raav载体转导具有hpsg受体的细胞的可能性，同时还获得了特异性结合cd4的能力。

本发明还提供了上述传递载体在制备基因治疗人类t淋巴细胞白血病病毒感染相关疾病的药物中的应用；所述传递载体优选靶向递送治疗基因至人类t淋巴细胞白血病病毒阳性细胞。

本发明还提供了上述传递载体在制备基因编辑人类t淋巴细胞白血病病毒感染相关疾病的药物中的应用；所述传递载体优选靶向递送基因编辑元件至人类t淋巴细胞白血病病毒阳性细胞。在本发明中，所述人类t淋巴细胞白血病病毒感染相关疾病优选包括：hiv感染导致的艾滋病、人类t淋巴细胞白血病病毒1型感染导致的成人t细胞白血病。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的cd4阳性细胞特异性基因传递载体及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

质粒paav为携带野生型aav2病毒全基因的质粒(pcap/rep，美国天普大学weidongxiao实验室惠赠)，其中cap基因负责编码aav2病毒的衣壳蛋白。

(1)引物设计

如图1所示，设计对aav衣壳进行修饰改造的pcr引物共4条，如sedidno：27～30所示：

引物f(tcaggtgtttactgactcggag，sedidno：27)；

引物r(cgtcacacatacgacaccgg，sedidno：28)；

引物r1(tctgttgcctctctggaggttg，sedidno：29)；

引物f1(caacctccagagaggcaacagannnnnnnnnnnnnnnnnnncaagcagctaccgcagatgtc，sedidno：30)，其中21个n指的是插入的21个碱基的随机片段。

(2)片段一的制备

以质粒paav为模板，以引物f和r1为配对引物，经pcr扩增片段一。

(3)片段二的制备

以质粒paav为模板，以引物f1和r为配对引物，经pcr扩增片段二。

(4)含随机片段的cap基因的制备

以pcr扩增片段一和片段二为模板，以引物f和r为配对引物，经pcr扩增，得到含随机片段的cap基因序列。

(5)衣壳修饰文库质粒paav-lib的制备

以bsiwi和asci两种酶对质粒paav进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶纯化，切胶回收线性化大片段。

取10u重组酶，线性化载体500ng，含随机片段的cap基因400ng，加ddh2o构建体外同源重组反应体系80μl，于50℃金属浴加热1.5h进行重组反应。

取重组产物，电穿孔方法转化感受态e.coli细胞。将转化后的菌液均匀涂布到固体培养基平板上，37℃培养箱过夜培养约16h。随机挑取平板上的菌落送genewiz公司进行测序分析。

(6)衣壳修饰文库质粒paav-lib的质量评价

从转化平板上挑取96个单菌落进行碱基插入区域的序列鉴定，序列鉴定结果如图2所示，图2显示只有1个菌落不含插入的随机序列，说明假阳性占比约为1％。对其它成功插入的碱基序列进行分析，几乎未发现重叠的序列，说明该文库的序列多样性较丰富。

另外取8个单菌落进行cap的开放阅读框进行序列测定，并在snapgene上与理论序列进行比对分析，发现除插入序列区域外，所有序列均能与原始序列完全匹配，无任何位点的突变和错位，说明在质粒上插入随机片段后整个衣壳蛋白的开放阅读框序列保真度较高，可用作后续aav衣壳突变体文库的生产。

实施例2

(1)aav衣壳突变体文库的制备

取293细胞接种于培养皿中，在含有10％fbs的dmem培养基中过夜培养，至汇合度约为80％。

取1ml无血清培养基，加入8μgpaav-lib和10μg辅助质粒pfd6，轻轻混匀后，按1:3的比例加入1mg/ml的pei溶液，涡旋混匀。逐滴均匀加入到293细胞的培养基中，同时尽快轻轻摇动混匀。

将细胞置于37℃，5％co2的细胞培养箱中培养，转染后16h弃掉旧培养基，加入10ml含10％fbs的新鲜dmem培养基。

在细胞培养箱中继续培养至72h，收细胞至15ml离心管，于1000g，4℃，离心15min，上清保存至4℃，沉淀用1mlpbs溶液重悬至1.5ml离心管中。

将收集的细胞悬液于-80℃冰箱中冻存1h，再立即放入37℃金属浴中1h。如此反复冻融3到5次以裂解细胞，于8000g，4℃，离心15min收集上清至新的离心管中，得到aav突变体文库aav-lib。

将收集的病毒液过0.22μm针式滤膜，每200μl分装保存至-80℃备用。

(2)aav衣壳突变体文库的cd4阳性细胞定向筛选

取mt-2细胞(cd4阳性)，按2.8×10⁵细胞/孔接种于6孔板。以aav-lib感染mt-2细胞(moi为10000)。

感染6h后，收集细胞进行低速离心，弃掉含病毒文库的培养基，细胞沉淀用pbs溶液重悬润洗，再次低速离心弃上清，补加新鲜的1640培养基。

取ad5(1000pfu/cell)加至培养基中，与mt-2细胞共同孵育约60～72h，待细胞出现约50％的致细胞病变效应，收集细胞反复冻融3到5次裂解细胞，得到含病毒上清液。56℃，30min热灭活含病毒上清液内ad5，8000g，4℃，15min离心，收集上清至新的离心管。在超净台中将收集的病毒液过0.22μm针式滤器除菌。

取收集的病毒液，重复以上步骤反复筛选3～5轮。每轮过后，均取样对富集的aav病毒cap内插入序列进行测序分析。测定结果见表1。

表1筛选5轮之后富集的插入序列汇总表

测序结果如图3所示，图3中的a为筛选前后插入序列的测序结果：起始阶段每种核苷酸在每个位置都是均匀分布，即各占25％；在经过3～5轮筛选后，对插入序列进行测序，发现特定序列得到富集，其中富集度最高的序列为sedidno：1；图3中的b为经过第3，4，5轮筛选后，各插入序列富集度的饼状图，每一轮测定3个重复，由图3中的a可知，在第3轮筛选后，富集的插入序列主要为seqidno：31aattctgttcatgctacggtt，肽序列为seqidno：1nsvhatv，富集率次之的插入序列为seqidno：32aatgatacgagggcgccgccg，肽序列为seqidno：2ndtrapp。继续进行两轮筛选后，得到共26条富集序列，各序列富集率见图3中的b。

(3)cd4阳性细胞靶向载体raav-nsv的构建

将筛选出来的主要序列seqidno：1aattctgttagggctacggtt，经同源重组方法(所述同源重组的方法和实施例1中的步骤相同)，插入raav载体包装质粒ph22的cap基因中，具体位置在编码vp1第588和589位氨基酸的序列之间，得到ph22-nsv质粒。

按照三质粒共转染方法，制备在衣壳蛋白内嵌入nsvhatv肽段的cd4阳性细胞靶向raav载体raav-nsv。用dmem配置三质粒(ph22-nsv，phelper质粒以及重组aavgenome质粒)的混合溶液，用dmem稀释polyjet试剂，充分混匀后迅速将polyjet稀释液添加到质粒混合液中，震荡混匀，在室温下静置10分钟(不超过20分钟)，用移液枪将混合液逐滴均匀添加到培养的细胞中。放置二氧化碳培养箱中培养，培养时间24～72h。收集细胞和培养基于50ml离心管中。4℃，1000g离心10分钟使细胞沉淀。收集的细胞用10mlpbs(0.001％pluronicf68+200mmnacl)重悬，超声破碎后，4℃转速3220g离心15分钟，收集上清液。每毫升上清添加5个单位的benzonase(neb公司)，37℃温育45分钟。4℃以转速2415g离心10分钟，取上清进行碘克沙醇密度梯度离心纯化。

(4)cd4阳性细胞靶向载体raav-ndt的构建

将筛选出来的次要序列seqidno：32aatgatacgagggcgccgccg，经同源重组方法(与实施例1步骤相同)，插入raav载体包装质粒ph22cap基因中，具体位置在编码vp1第588和589位氨基酸的序列之间，得到ph22-ndt质粒。

按照三质粒共转染方法，制备在衣壳蛋白内嵌入ndtrapp肽段的cd4阳性细胞靶向raav载体raav-ndt。生产方法同步骤(3)中raav-nsv的方法，但是衣壳质粒更换为ph22-ndt。

应用例1

取cd4阳性细胞jurkat细胞于96孔细胞培养板进行培养，至汇合度约为80％。

分别取携带绿色荧光蛋白(gfp)转基因表达框的野生型raav2，raav-nsv和raav-ndt转导jurkat细胞(moi1000)，48小时后观察gfp水平，观察结果如图4所示。由图4可知，raav-nsv和raav-ndt对jurkat细胞的转导效率显著高于野生型raav2。

按照raav-nsv和raav-ndt的制备方法，同样包装插入sedidno：3～26，24条七肽的raav。分别转导jurkat细胞(moi1000)，结果均能有效转导，转导效率为raav-nsv和raav-ndt的10％至80％不等。

应用例2

取cd4阴性细胞a549细胞于96孔细胞培养板进行培养，至汇合度约为80％。

分别取携带绿色荧光蛋白(gfp)转基因表达框的野生型raav2，raav-nsv和raav-ndt转导a549细胞(moi1000)，48小时后观察gfp水平，观察结果如图5所示。由图5可知，raav-nsv和raav-ndt对a549细胞的转导效率显著低于野生型raav2。

应用例3

按照三质粒共转染方法，分别制备携带spcas9/grna表达元件的raav-nsv，raav-ndt和raav2。

取cd4阳性细胞jurkat细胞于96孔细胞培养板进行培养，至汇合度约为80％。

以基因编辑报告质粒转染jurkat细胞。该质粒携带一个缺少起始密码子的rfp表达基因，其上游有一个能被特定spcas9/grna组合识别剪切位点(rosa26-1)，正常功能的起始密码子又位于这个靶标位点的上游。在没有基因编辑元件spcas9/grna处理的情况下，这个质粒理论上不能表达rfp。而当spcas9/grna存在的情况下，rosa26-1位点会被识别并剪切产生dna断裂位点，而后这个位点会被细胞的dna修复系统nhej修复产生插入缺失，使得rfp的orf能够和上游的起始密码子融合从而正常表达。

在质粒转染后的第2天，分别转导携带spcas9/grna表达元件的raav-nsv，raav-ndt和raav2，raav-nsv、raav-ndt和野生型raav2载体介导的cd4阳性jurkat细胞的基因编辑效率的比较结果。由图6可知，raav-nsv和raav-ndt能够对jurkat细胞进行有效的基因编辑，且编辑效率高于野生型raav2。

由上述试验可知，在衣壳中插入本发明提供的七肽获得的raav对jurkat细胞的转导效率显著高于野生型raav2，且编辑效率高于野生型raav2。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110>华侨大学

<120>cd4阳性细胞特异性基因传递载体及其应用

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