稳定表达猪源宿主限制因子A3Z2分子的细胞系的筛选、培育方法及其应用与流程

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及稳定表达猪源宿主限制因子a3z2分子的细胞系的筛选、培育方法及其应用。

背景技术：

病毒和宿主细胞相互作用的过程中，细胞会表达一系列不同的蛋白以细胞自主的方式通过发挥不同的功能来抑制病毒的复制，这些蛋白被称为宿主限制因子或天然抵抗因子，是先天免疫抗病毒反应的组成部分，为机体提供了一条早期的感染防御线。载脂蛋白bmrna编辑酶催化多肽蛋白3(apolipoproteinbmrna-editingenzymecatalyticpolypeptideprotein3,apobec3)是一类具有抗病毒活性的宿主限制因子。apobec3蛋白家族成员包括a3a-h，其中研究比较透彻的a3g(apobec3g)是一种干扰素刺激基因(isg)，a3g具有其独特的抗病毒作用机制，在机体固有免疫防御机制中发挥重要作用。目前研究证实a3g能够有效抑制人类所得艾滋病病毒1型(hiv-1)、丙型肝炎病毒(hepatitiscvirus)、乙型肝炎病毒(hepatitisbvirus,hbv)hbv、麻疹病毒(measlesvirus)和呼吸道合胞体病毒(respiratorysyncytialviruses)。

不同物种的apobec3家族基因由于长期的选择压力使其具有多态性，在其他动物中也存在与人类apobec3(简写a3)具有相似功能的同源性基因，在猪中包含2个a3基因(a3z2和a3z3)，这两个a3基因编码至少四个不同的mrna：a3z2，a3z3，a3z2-z3和a3z2-z3剪接变体a(sva)]。目前对于猪源a3s分子的研究相对有限。猪apobec-a3z2-z3(也称猪a3f)、-3z2和-3z3在早期的一些研究中被发现具有很强的抑制hiv-1(△vif缺陷型)作用，对mlv的抑制作用则较弱。但是人与动物仅仅是相似，而不是完全相同，虽然是同源性基因，但是细微的差别，功能就会有巨大的差别，就会造成不同的问题。目前针对猪流行性腹泻病毒(pedv)与猪源宿主限制因子a3z2(poa3z2)相互作用的研究有限。本发明构建的表达猪源a3z2分子的ipec-j2-poa3z2细胞系，不仅可用于猪源抗病毒蛋白a3z2的制备，还可以用于研究pedv与宿主限制因子a3z2相互作用的分子机制，并以此为靶点为抗pedv新药的筛选提供思路。

技术实现要素：

本发明提供了稳定表达猪源宿主限制因子a3z2分子的细胞系的筛选、培育方法及其应用。

本发明的方案是：

稳定表达猪源宿主限制因子a3z2分子的细胞系的筛选、培育方法，包括下列步骤：

1)猪源a3z2真核表达载体的构建，设计扩增猪源a3z2基因全长的引物a3z2-f：5-′atggatcctcagcgcctgagacaa-3′和a3z2-r：5-′tcagcggtaacaaatccaacta-3′引物，通过一步法rt-pcr扩增获得包含猪源a3z2基因全长的pcr产物，通过胶回收，连接pmd-18t载体，构建成功pmd-18t-poa3z2载体，测序正确后，以pmd-18t-poa3z2载体为模板，以包含ecori酶切位点的引物h1：agtccagtgtggtggaattcatggatcctcagcgcctg和h2：gtgctggatatctgcagaattcgcggtaacaaatccaactagcatcc，进行聚合酶链式反应，采用一步法克隆试剂盒，通过pcr扩增、酶切、连接、转化和测序鉴定，构建获得pcdna3.1-3xflag-poa3z2载体；

2)稳定表达猪源宿主限制因子a3z2的细胞系的筛选，于转染前一天，将细胞接种在6孔板中，待细胞长至70％-80％融合度时，用转染试剂将步骤1)构建获得的pcdna3.1-3xflag-poa3z2载体转染入细胞，培养液中继续培养24小时后，向培养液中添加g418至终浓度600μg/ml，每3天换一次含有600μg/mlg418的细胞培养液，此时，未转染重组质粒的细胞在g418的作用下逐渐凋亡，换液，去除阴性细胞；当阴性细胞去除后，将筛选获得阳性细胞通过有限稀释法进行单克隆细胞培养，待细胞单克隆长起来后，继续用含有g418的培养液培养，适时换液，此细胞记为第1代，并继续传代、扩大培养，将ipec-j2-poa3z2细胞冻存备用；

3)观察检测分析，免疫荧光观察poa3z2在细胞中的表达，sbyrgreenipcr方法分析猪源a3z2mrna的表达，westernblot方法分析poa3z2蛋白的表达,流式细胞术分析poa3z2在细胞中的表达率；

4)接种病毒，通过步骤2)中的ipec-j2-poa3z2细胞，感染猪流行性腹泻病毒(pedv)，在感染24h，48h时间段分别收集细胞样本；

5)数据收集，将步骤4)中收集的细胞样本分别进行荧光定量pcr检测病毒n基因的mrna，分析a3z2抑制pedv的mrna表达，westernblot检测病毒n蛋白表达，分析a3z2抑制pedv的n蛋白表达。

作为优选的技术方案，所述步骤3)中sbyrgreenipcr方法检测猪源a3z2mrna的表达方法：用axygen-rna提取试剂盒，分别提取ipec-j2-poa3z2细胞和ipec-j2细胞的总rna；将提取的总rna用试剂盒进行反转录得到cdna，反转录条件为：37℃，15min，85℃，5s，4℃保存；用试剂盒以得到的cdna为模板、猪源gapdh为内参在仪器上进行相对荧光定量pcr检测a3z2的表达水平；相对荧光定量-pcr条件为95℃，30s；95℃，5s，60℃，30s；定量引物为gapdh-f:agccaaaagggtcatcatct、gapdh-r:atgagtccttccacgatacc和a3z2-sf:atggatcctcagcgcctg、a3z2-sr:5′-tcagcggtaacaaatccaac-3′。

作为优选的技术方案，所述步骤3)中westernblot方法分析poa3z2蛋白的表达：收集步骤3)中ipec-j2-poa3z2细胞和ipec-j2细胞，通过全蛋白提取试剂盒，抽提各组细胞的总蛋白，经westernblot方法分析各组细胞中poa3z2基因的蛋白产物的表达量变化。

作为优选的技术方案，所述病毒为猪流行性腹泻病毒(pedv)。

作为优选的技术方案，所述步骤2)中细胞为ipec-j2细胞。

作为优选的技术方案，所述步骤4)中在ipec-j2-poa3z2细胞中感染猪流行性腹泻病毒(pedv)，在感染24h，48h时间段分别收集细胞样本，分析poa3z2抑制pedv的作用。

作为优选的技术方案，所述的稳定表达猪源宿主限制因子a3z2分子的细胞系的筛选、培育方法用于研究猪源宿主限制因子a3z2分子与猪流行性腹泻病毒(pedv)相互作用。

作为优选的技术方案，westernblot方法分析poa3z2蛋白的表达：收集pcdna3.1-3xflag-poa3z2和未转染组细胞，参照m-permammalianproteinextractionreagent的说明书，抽提各组细胞的总蛋白，经westernblot方法分析各组细胞中poa3z2基因的蛋白产物的表达量变化。

本发明还公开了一种稳定表达猪源宿主限制因子a3z2分子的细胞系在抑制pedv增殖中及其作为抗pedv制剂的应用，所述能够稳定表达猪源宿主限制因子a3z2分子的细胞系为导入携带有猪源a3z2基因的真核表达载体pcdna3.1-3xflag-poa3z2的ipec-j2细胞系。

作为优选的技术方案，将铺满单层的稳定表达猪源宿主限制因子a3z2分子的ipec-j2细胞系传代后，经37℃5％co2过夜培养，细胞汇合度达80～90％时，吸附猪流行性腹泻病毒(pedv)，用含2％fbs的dmem培养基在37℃5％co2培养。

由于采用了上述技术方案，稳定表达猪源宿主限制因子a3z2分子的细胞系的筛选、培育方法，包括下列步骤：

1)猪源a3z2真核表达载体的构建，设计扩增猪源a3z2基因全长的引物a3z2-f：5-′atggatcctcagcgcctgagacaa-3′和a3z2-r：5-′tcagcggtaacaaatccaacta-3′，通过一步法rt-pcr扩增获得包含猪源a3z2基因全长的pcr产物，通过胶回收，连接pmd-18t载体，构建成功pmd-18t-poa3z2载体，测序正确后，以pmd-18t-poa3z2载体为模板，以包含ecori酶切位点的引物h1：agtccagtgtggtggaattcatggatcctcagcgcctg和h2：gtgctggatatctgcagaattcgcggtaacaaatccaactagcatcc，进行聚合酶链式反应，采用一步法克隆试剂盒，通过pcr扩增、酶切、连接、转化和测序鉴定，构建获得pcdna3.1-3xflag-poa3z2载体；

2)稳定表达猪源宿主限制因子a3z2的细胞系的筛选，于转染前一天，将细胞接种在6孔板中，待细胞长至70％-80％融合度时，用转染试剂将步骤1)构建获得的pcdna3.1-3xflag-poa3z2载体转染入细胞，培养液中继续培养24小时后，向培养液中添加g418至终浓度600μg/ml，每3天换一次含有600μg/mlg418的细胞培养液，此时，未转染重组质粒的细胞在g418的作用下逐渐死亡，换液，去除阴性细胞；当阴性细胞去除后，将筛选获得阳性细胞通过有限稀释法进行单克隆细胞培养，待细胞单克隆长起来后，继续用含有g418的培养液培养，适时换液，此细胞记为第1代，并继续传代、扩大培养，将ipec-j2-poa3z2细胞冻存备用；

3)观察检测分析，免疫荧光观察poa3z2在细胞中的表达，sbyrgreenipcr方法分析猪源a3z2mrna的表达，westernblot方法分析poa3z2蛋白的表达,流式细胞术分析poa3z2在细胞中的表达率；

4)接种病毒，通过步骤2)中的ipec-j2-poa3z2细胞，感染猪流行性腹泻病毒(pedv)，在感染24h，48h时间段分别收集细胞样本；

5)数据收集，将步骤4)中收集的细胞样本分别进行荧光定量pcr检测病毒n基因的mrna，分析a3z2抑制pedv的mrna表达，westernblot检测病毒n蛋白表达，分析a3z2抑制pedv的n蛋白表达。

本发明的优点：

1、稳定表达猪源宿主限制因子a3z2分子的细胞系可用于猪源抗病毒蛋白a3z2的制备；

2、经过本发明能够表明猪源a3z2获得了基因克隆和真核表达，以及具备抑制pedv的抗病毒活性；

3、为研究pedv与宿主限制因子a3z2相互作用的分子机制提供了基础；

4、该细胞系有利于以猪源a3z2为靶点筛选抗pedv新药提供思路。

附图说明

图1.猪源a3z2基因全长pcr电泳图；

图2.pcdna3.1-3xflag-poa3z2载体单酶切图；

图3.筛选的单克隆细胞图；

图4.poa3z2表达的免疫荧光图片；

图5.相对荧光定量pcr分析poa3z2蛋白的表达；

图6.poa3z2蛋白的westernblot图；

图7.流式细胞术分析poa3z2的表达率；

图8.相对荧光定量pcr分析poa3z2对pedv的抑制作用；

图9.westernblot分析poa3z2对pedv的抑制作用；

具体实施方式

为了弥补以上不足，本发明稳定表达猪源宿主限制因子a3z2分子的细胞系的筛选、培育方法及其应用以解决上述背景技术中的问题。

稳定表达猪源宿主限制因子a3z2分子的细胞系的筛选、培育方法，包括下列步骤：

1)猪源a3z2真核表达载体的构建，设计扩增猪源a3z2基因全长的引物a3z2-f：5-′atggatcctcagcgcctgagacaa-3′和a3z2-r：5-′tcagcggtaacaaatccaacta-3′引物，通过一步法rt-pcr扩增获得包含猪源a3z2基因全长的pcr产物，通过胶回收，连接pmd-18t载体，构建成功pmd-18t-poa3z2载体，测序正确后，以pmd-18t-poa3z2载体为模板，以包含ecori酶切位点的引物h1：agtccagtgtggtggaattcatggatcctcagcgcctg和h2：gtgctggatatctgcagaattcgcggtaacaaatccaactagcatcc，进行聚合酶链式反应，采用一步法克隆试剂盒，通过pcr扩增、酶切、连接、转化和测序鉴定，构建获得pcdna3.1-3xflag-poa3z2载体；

2)稳定表达猪源宿主限制因子a3z2的细胞系的筛选，于转染前一天，将细胞接种在6孔板中，待细胞长至70％-80％融合度时，用转染试剂将步骤1)构建获得的pcdna3.1-3xflag-poa3z2载体转染入细胞，培养液中继续培养24小时后，向培养液中添加g418至终浓度600μg/ml，每3天换一次含有600μg/mlg418的细胞培养液，此时，未转染重组质粒的细胞在g418的作用下逐渐死亡，换液，去除阴性细胞；当阴性细胞去除后，将筛选获得阳性细胞通过有限稀释法进行单克隆细胞培养，待细胞单克隆长起来后，继续用含有g418的培养液培养，适时换液，此细胞记为第1代，并继续传代、扩大培养，将ipec-j2-poa3z2细胞冻存备用；

3)观察检测分析，免疫荧光观察poa3z2在细胞中的表达，sbyrgreenipcr方法分析猪源a3z2mrna的表达，westernblot方法分析poa3z2蛋白的表达,流式细胞术分析poa3z2在细胞中的表达率；

4)接种病毒，通过步骤2)中的ipec-j2-poa3z2细胞，感染猪流行性腹泻病毒(pedv)，在感染24h，48h时间段分别收集细胞样本；

5)数据收集，将步骤4)中收集的细胞样本分别进行测定tcid50,荧光定量pcr检测病毒n基因的mrna，分析a3z2抑制pedv的mrna表达，westernblot检测病毒n蛋白表达，分析a3z2抑制pedv的n蛋白表达。

所述步骤3)中sbyrgreenipcr方法检测猪源a3z2mrna的表达方法：用axygen-rna提取试剂盒，分别提取ipec-j2-poa3z2细胞和ipec-j2细胞的总rna；将提取的总rna用试剂盒进行反转录得到cdna，反转录条件为：37℃，15min，85℃，5s，4℃保存；用试剂盒以得到的cdna为模板、猪源gapdh为内参在仪器上进行相对荧光定量pcr检测a3z2的表达水平；相对荧光定量-pcr条件为95℃，30s；95℃，5s，60℃，30s；定量引物为gapdh-f:agccaaaagggtcatcatct、gapdh-r:atgagtccttccacgatacc和a3z2-sf:atggatcctcagcgcctg、a3z2-sr:5′-tcagcggtaacaaatccaac-3′。

所述步骤3)中westernblot方法分析poa3z2蛋白的表达：收集步骤3)中ipec-j2-poa3z2细胞和ipec-j2细胞，通过全蛋白提取试剂盒，抽提各组细胞的总蛋白，经westernblot方法分析各组细胞中poa3z2基因的蛋白产物的表达量变化。

所述病毒为猪流行性腹泻病毒(pedv)。

所述步骤2)中细胞为ipec-j2细胞。

所述步骤4)中在ipec-j2-poa3z2细胞中感染猪流行性腹泻病毒(pedv)，在感染24h，48h时间段分别收集细胞样本，分析poa3z2抑制pedv的作用。

所述的稳定表达猪源宿主限制因子a3z2分子的细胞系的筛选、培育方法用于研究猪源宿主限制因子a3z2分子与pedv相互作用。

westernblot方法分析poa3z2蛋白的表达：收集pcdna3.1-3xflag-poa3z2和未转染组细胞，参照全蛋白提取试剂盒的说明书，抽提各组细胞的总蛋白，经westernblot方法分析各组细胞中poa3z2基因的蛋白产物的表达量变化。

本发明还公开了一种稳定表达猪源宿主限制因子a3z2分子的细胞系在抑制pedv增殖中及其作为抗pedv制剂的应用，所述能够稳定表达猪源宿主限制因子a3z2分子的细胞系为导入携带有猪源宿主限制因子a3z2分子基因的真核表达载体pcdna3.1-3xflag-poa3z2的ipec-j2细胞系。

将铺满单层的稳定表达猪源宿主限制因子a3z2分子的ipec-j2细胞系传代后，经37℃5％co2过夜培养，细胞汇合度达80～90％时，吸附pedv，用含2％fbs的dmem培养基在37℃5％co2培养。

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：

材料与方法

菌株和细胞，pcdna3.1-3xflag-a3z2载体购自clontech公司，大肠杆菌top10菌株购自天根生化科技(北京)有限公司，ipec-j2细胞购自中国典型培养物保藏中心(武汉大学)。

试剂，fugenehd购自promega公司；rna提取试剂盒购自axygen公司的；primescriptrtmastermixperfectrealtime试剂盒、premixextaqtmⅱ(tlirnasehplus)试剂盒、2000bpdnamarker、ex-taqdna聚合酶、t4dna连接酶及内切酶均购自takara公司；m-permammalianproteinextractionreagent购自thermo公司。flag小鼠单克隆抗体购自碧云天生物技术公司。

猪源a3z2真核表达载体的构建：

其中猪源a3z2基因测序如下表1：

atggatcctcagcgcctgagacaatggccagggccgggaccagccagccgaggaggctacggccagaggcccaggatcagtaacccagaggagtggttccatgagttatctccccgaaccttctccttccactttcgcaacctgcgctttgcctctgggcggaaccgctcctacatctgctgccaggtgtaaggaaagaactgtttcttccaaggcatctttcaaaaccaggtccctcccgacccgccctgccacgccgagctctgcttcctctcttggttccagtcctgggggctgtccccggacgagcattactacgtcacctggttcatctcctggagcccctgctgtgagtgtgcagcgaaggtggctcagttcctggaggagaacaggaacgtgagcctgagcctctcggccgctcgcctctactacttctggaagtcagagtcccgggaggggctgcgcagactgagtgacctgggggcccaggtgggcatcatgtccttccaagacttccaacactgctggaacaacttcgtgcacaacctggggatgcccttccagccgtggaaaaaactgcataaaaattatcaacgcttggtcacagagctgaagcagattctcagggaggaacctgcaacctatggaagtccccaggcccagggaaaggttcgaatcggatctacagctgctggcctacgccacagccacagccacaccagatccgaggctcatctgagacctaaccacagctcacggcaacaccggatccttaacccaccgagggaggccagggcacgaacctgcgtcctcgtggatgctagttggatttgttaccgctga

如图1、图2和表1所示，设计扩增猪源a3z2基因全长的引物a3z2-f：5-′atggatcctcagcgcctgagacaa-3′和a3z2-r：5-′tcagcggtaacaaatccaacta-3′，通过一步法rt-pcr(反应体系和条件上文有写反应体系和条件)扩增获得包含猪源a3z2基因全长的pcr产物，通过胶回收，连接pmd-18t载体，构建成功pmd-18t-poa3z2载体，测序正确后，以pmd-18t-poa3z2载体为模板，以包含ecori酶切位点的引物h1：agtccagtgtggtggaattcatggatcctcagcgcctg和h2：gtgctggatatctgcagaattcgcggtaacaaatccaactagcatcc进行pcr，采用一步法克隆试剂盒(nebuilderhifidnaassemblymastermix，货号：e2621s)，按照如下反应体系和反应条件，通过pcr扩增、酶切、连接、转化和测序鉴定，构建获得pcdna3.1-3xflag-poa3z2载体。

稳定表达猪源a3z2的ipec-j2-poa3z2细胞系的筛选：

于转染前一天，将ipec-j2细胞接种在6孔板中，待细胞长至70％-80％融合度时，用promega的fugenehd将pcdna3.1-3xflag-poa3z2转染入ipec-j2细胞，培养液中继续培养24小时后，向培养液中添加g418至终浓度600μg/ml，每3天换一次含有600μg/mlg-418的细胞培养液。此时，未转染重组质粒的细胞在g418的作用下逐渐死亡，换液，去除阴性细胞。当阴性细胞去除后，将筛选获得阳性细胞通过有限稀释法进行单克隆细胞培养，待细胞单克隆长起来后(如图3所示)，继续用含有g418(300μg/ml)的dmem培养，适时换液，此细胞记为第1代，并继续传代、扩大培养，将ipec-j2-poa3z2细胞冻存备用。

免疫荧光观察poa3z2在ipec-j2细胞中的表达，见图4；

sbyrgreenipcr方法检测抑制猪源a3z2mrna的表达：

如图5所示，用axygen公司的rna提取试剂盒，分别提取pcdna3.1-3xflag-poa3z2转染组和未转染组ipec-j2细胞的总rna。将提取的总rna用takara公司的primescript^tmrtmastermixperfectrealtime试剂盒进行反转录得到cdna，反转录条件为：37℃15min，85℃5s，4℃保存。用takara公司的premixextaqtmⅱ(tlirnasehplus)试剂盒以得到的cdna为模板、猪源gapdh为内参在roche公司的lightcycle96仪器上进行相对荧光定量pcr检测a3z2的表达水平；相对荧光定量-pcr条件为：95℃30s；95℃5s，60℃30s(40个循环)；定量引物为gapdh-f、gapdh-r和a3z2-sf:atggatcctcagcgcctg、a3z2-sr:5′-tcagcggtaacaaatccaac-3′。

westernblot方法分析poa3z2蛋白的表达：

如图6所示，收集pcdna3.1-3xflag-poa3z2转染组和未转染组ipec-j2细胞，参照全蛋白提取试剂盒的说明书，抽提各组细胞的总蛋白，经westernblot方法分析各组细胞中poa3z2基因的蛋白产物的表达量变化。

流式细胞术分析poa3z2在ipec-j2细胞中的表达率，如图7所示。

实施例2

猪源a3z2真核表达载体的构建：

如图1、图2和表1所示，设计扩增猪源a3z2基因全长的引物a3z2-f和a3z2-r，通过一步法rt-pcr(反应体系和条件)扩增获得包含猪源a3z2基因全长的pcr产物，通过胶回收，连接pmd-18t载体，构建成功pmd-18t-poa3z2载体，测序正确后，以pmd-18t-poa3z2载体为模板，以包含ecori酶切位点的引物h1和h2进行pcr，采用一步法克隆试剂盒，按照如下反应体系和反应条件，通过pcr扩增、酶切、连接、转化和测序鉴定，构建获得pcdna3.1-3xflag-poa3z2载体。

稳定表达猪源a3z2的ipec-j2细胞系的筛选：

于转染前一天，将ipec-j2细胞接种在6孔板中，待细胞长至70％-80％融合度时，用promega的fugenehd将pcdna3.1-3xflag-poa3z2转染入ipec-j2细胞，继续培养24小时后，向保护加速培养液中添加g418至终浓度600μg/ml，每3天换一次含有600μg/mlg-418的细胞培养液。此时，未转染重组质粒的细胞在g418的作用下逐渐凋亡，换液，去除阴性细胞。当阴性细胞去除后，将筛选获得阳性细胞以一定的稀释度传到96孔细胞培养板中，并继续用含有g418(300μg/ml)的dmem培养，适时换液，此细胞记为第1代，并继续传代、扩大培养，冻存备用。

接种病毒：

将转染pcdna3.1-3xflag-poa3z2质粒、且经过筛选获得的ipec-j2-poa3z2细胞于实验前一天接种在细胞培养板中，24小时后，吸附猪流行性腹泻病毒(pedv)，在感染后24h，48h时间段分别收集细胞样本；

样本收集和数据分析：

收集的细胞样本分别进行相对荧光定量pcr检测pedvn基因的mrna，分析a3z2降低pedv的mrna表达；westernblot检测pedvn蛋白表达，分析a3z2降低pedv的n蛋白表达。

实施例1与实施例2可以看出，猪源a3z2基因获得了真核克隆和表达，以及具备抑制pedv的抗病毒活性。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界。

起点商标作为专业知识产权交易平台，可以帮助大家解决很多问题，如果大家想要了解更多知产交易信息请点击 【在线咨询】或添加微信 【19522093243】与客服一对一沟通，为大家解决相关问题。

此文章来源于网络,如有侵权,请联系删除