一种藻蓝蛋白的酶解方法及其应用与流程

本发明涉及一种蛋白的酶解方法，特别涉及一种藻蓝蛋白的酶解方法及其应用。

背景技术：

随着生物技术的兴起和发展、蛋白质工程和基因工程技术的突飞猛进,越来越多的蛋白质、多肽类药物被开发并用于疾病诊断和治疗。藻蓝蛋白(pc)从螺旋藻中分离、纯化及鉴定出来的一种新型海洋蛋白，pc充分发挥了藻蓝蛋白在抗氧化、抗肿瘤方面的作用，且能显著的增强肿瘤细胞对抗肿瘤药物(如5-氟尿嘧啶和紫杉醇等)的敏感性。pc酶解后并初步分离活性肽组分，发现活性肽粗提物比pc整单比具有更强的抗氧化及体外抗肿瘤活性。这些结果显示pc具有良好的药用开发前景。但是常用常规液态的酶解效率低，酶解时间长达24小时。因此，寻找提高蛋白质酶解效率、并减少其酶解时间的方法具有研究意义。

技术实现要素：

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种藻蓝蛋白的酶解方法。

本发明的另一目的在于提供上述藻蓝蛋白的酶解方法在制备活性肽组分中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种藻蓝蛋白的酶解方法，包括如下步骤：将藻蓝蛋白和酶配制得到酶解反应体系，酶解，酶解完毕后灭活，得到藻蓝蛋白酶解产物；优选包括如下步骤：将藻蓝蛋白和酶配制得到酶解反应体系，在酶解的同时辅以微波，酶解完毕后灭活，得到藻蓝蛋白酶解产物。

所述的酶解反应体系中：藻蓝蛋白8～12mg/ml，酶的浓度为0.08～0.12mg/ml，酶解缓冲液的ph为6.8～7.2；进一步优选如下藻蓝蛋白10mg/ml，酶的浓度为0.1mg/ml，酶解缓冲液的ph为7.0。

所述的酶优选为胰酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶中的至少一种；更优选为胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶中的至少一种与胰酶组合得到的复合酶；最优选为胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶中的一种与胰酶按质量比1：1配比得到的复合酶。

所述的胰酶优选为酶活力5万单位的胰酶。

所述的胰凝乳蛋白酶优选为酶活力5万单位的胰凝乳蛋白酶。

所述的木瓜蛋白酶优选为酶活力5万单位的木瓜蛋白酶。

所述的枯草杆菌蛋白酶优选为酶活力5万单位的枯草杆菌蛋白酶。

所述的酶解缓冲液优选为ph6.8～7.2、0.01～0.1mol/l的磷酸盐缓冲盐；更优选为ph7.0、0.05mol/l的磷酸盐缓冲盐。

所述的酶解的温度优选为35～45℃；更优选为40℃。

所述的微波的条件优选为温度35～45℃，微波频率250～350ghz，压力10～20bar；更优选为温度40℃，微波频率300ghz，压力15bar。

上述藻蓝蛋白的酶解方法在制备活性肽组分中的应用。

一种活性肽，通过上述酶解方法制备得到。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明通过酶的选择和优化，发现胰酶+胰凝乳蛋白酶或胰酶+木瓜蛋白酶的酶解率相对于单一蛋白酶接近提高1倍。

(2)本发明的酶解体系通过微波合成技术辅助，减少了两种联合蛋白酶的酶解时间，少量提高其酶解率，明显提高酶解产物的自由基清除效率。

附图说明

图1是对单酶解藻蓝蛋白得到的酶解产物检测得到的酶解率结果图。

图2是对单酶解藻蓝蛋白得到的酶解产物检测得到的自由基清除率结果图。

图3是对双酶解藻蓝蛋白得到的酶解产物检测得到的酶解率结果图。

图4是对双酶解藻蓝蛋白得到的酶解产物检测得到的自由基清除率结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

藻蓝蛋白购自麦克林试剂公司；

胰酶购自麦克林试剂公司，酶活力5万；

胰凝乳蛋白酶购自麦克林试剂公司，酶活力5万；

木瓜蛋白酶购自麦克林试剂公司，酶活力5万；

枯草杆菌蛋白酶购自叶源生物公司，酶活力5万；

实施例1

一、试验的设置

1、单酶解反应

反应体系的组成：磷酸盐缓冲液(ph7.00、浓度是50mm)、藻蓝蛋白10mg/ml，酶的浓度为0.1mg/ml。磷酸盐缓冲液的配制如下：磷酸二氢钾0.68g，加0.1mol/l氢氧化钠溶液29.1ml，用水稀释至100ml。

反应条件：分别酶解5分钟、15分钟、6小时、12小时、24小时、微波+5min、微波+15min。其中，酶解的温度是40℃；微波辅助酶解，是酶解同时加入微波辅助，微波的条件为40℃，微波频率300ghz，压力15bar(通过控制温度来调整微波功率，酶解期间辅以微波)。

酶解结束后，酶解产物在90℃水浴下孵育15分钟来灭活蛋白酶。灭活的酶解产物于4℃保存。

通过bca法来检测酶解率：吸取20μl样品溶液于酶标孔中，加入bca试剂200μl，轻摇，于37℃保温30-60min，冷却至室温后，以空白为对照，在酶标仪上562nm处比色，根据蛋白标准曲线计算蛋白浓度。

通过abts法检测自由基清除率：加入100μl浓度是7.4mmol/l的abts溶液置于酶标孔中，加入100μl超纯水作为对照组。将100μl浓度是7.4mmol/l的abts溶液置于酶标孔中，加入100μl样品，在酶标仪上734nm处读数2小时，间隔5分钟一次。将样品组读数除以对照组读数计算自由基清除率。

2、双酶解反应

反应体系的组成：磷酸盐缓冲液(ph7.00、浓度是50mm)、藻蓝蛋白10mg/ml，酶的总浓度为0.1mg/ml，其中，在双酶解反应体系中，每种蛋白酶为0.05mg/ml。

反应条件：分别酶解5分钟、15分钟、6小时、12小时、24小时、微波+5min、微波+15min。其中，酶解的温度是40℃；微波辅助酶解，是酶解同时加入微波辅助，微波的条件为40℃，微波频率300ghz，压力15bar。

酶解结束后，酶解产物在90℃水浴下孵育15分钟来灭活蛋白酶。灭活的酶解产物于4℃保存。

酶解率和自由基清除率的检测同第1部分内容。

二、结果

单酶解反应的酶解率如图1所示，图1的结果表明微波反应均能减少蛋白酶对藻蓝蛋白的酶解时间，常规液态酶解时间为24小时，而微波辅助后，酶解时间大幅降低到15分钟。此外，在胰凝乳蛋白酶的条件下，微波处理15min后，藻蓝蛋白的酶解率达到36％，高于常规液态酶解24小时组(21％)。因此，可认为微波辅助能提高单酶解的效率，减少酶解时间，并且提高胰凝乳蛋白酶对藻蓝蛋白的酶解率。单酶解反应的自由基清除率如图2所示，图2的结果表明微波辅助均能提高单酶解反应产物的自由基清除率。特别是木瓜蛋白酶，常规液态酶解24小时，产物的自由基清除率仅有15％，但是微波辅助酶解15分钟产物的自由基清除率高达26％。因此，可认为微波反应可以提高单酶解反应的有效多肽的产生，特别是木瓜蛋白酶能产生更多的有效多肽，从而提高酶解产物的自由基清除率。

双酶解反应的酶解率如图3所示，图3的结果表明微波辅助条件下，胰酶+胰凝乳蛋白酶的酶解率相对于单一蛋白酶接近提高1倍。双酶解反应的自由基清除率如图4所示，图4的结果表明微波合成技术辅助酶解反应，能减少了两种联合蛋白酶(胰酶+木瓜蛋白酶)的酶解时间，提高其酶解率，而且明显提高酶解产物的自由基清除效率。

酶解反应的酶解率如表1所示，自由基清除率(60分钟的检测结)如表2所示。结合表1和表2的结果可知：微波能有效提高酶解效率，其中，胰酶和木瓜蛋白酶的酶解效率不仅是最高，而且得到的酶解产物的自由基清除率也最高。这说明，微波辅以胰酶和木瓜蛋白酶不仅有利于酶解藻蓝蛋白，而且得到的酶解产物的抗氧化性最强。

双酶解体系中，我们尝试了6种组合，胰酶+胰凝乳蛋白酶，胰酶+木瓜蛋白酶，胰酶+枯草杆菌蛋白酶，胰凝乳蛋白酶+木瓜蛋白酶，胰凝乳蛋白酶+枯草杆菌蛋白酶，木瓜蛋白酶+枯草杆菌蛋白酶。其中，只有胰酶+木瓜蛋白酶体系(微波辅助)的产物酶解率明显提高达到50.44％，其自由基清除率更高达96.42％。这里面的原因可能是胰酶+木瓜蛋白酶导致藻蓝蛋白暴露更多活性基团，更多活性多肽的产生，这是胰酶+木瓜蛋白酶综合产生的效果。

表1酶解率

表2自由基清除率

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

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