一种在有机相中全酶法制备亲水性植物甾醇二元酸糖酯的方法与流程

本发明涉及化学合成技术领域，具体涉及一种在有机相中全酶法制备亲水性植物甾醇二元酸糖酯的方法。

背景技术：

植物甾醇是一类化学结构与胆固醇相似，具有疏水性甾体骨架、c-3位有一个β-羟基、d环上带侧链的化合物。常见的植物甾醇主要有β-谷甾醇、豆甾醇、菜籽甾醇和菜油甾醇四种。它们主要存在于植物和海洋生物中，无法在人体内合成。在食品加工中，植物甾醇是油脂精炼过程中产生的有价值的副产物。

自1950年代首次发现植物甾醇具有降低血脂胆固醇功能以来，科研人员对植物甾醇展开了广泛的研究，关于植物甾醇消费的指南和共识也陆续发布。一般来说，植物甾醇的建议摄入量为1.5~3g/天，可以降低8~15％低密度胆固醇水平。同时，进行了大量的动物和临床实验，进一步证实植物甾醇具有其他的生物活性，如抗癌，抗炎，抗氧化及抗肿瘤等。

由于植物甾醇独特的化学结构和晶体形式决定了它具有差的脂溶性、水不溶性和生物利用率低等特点，极大地限制了它的实际应用。许多文献已经证明，植物甾醇，若以粉末形式单独使用或直接添加到食物基质中，会产生不良的质地，并可能由于其不良的溶解性而显著影响降低胆固醇的功效。

近十年来有不少文献和专利报道是将植物甾醇与脂肪酸通过酯化或酯交换反应合成植物甾醇酯以改善其脂溶性。但游离植物甾醇或植物甾醇脂肪酸酯主要用于以脂类为基础的食物基质，这不符合理想的低脂饮食。而且，植物甾醇在脂类中的溶解度会影响其扩散速率，从而延长降低血液胆固醇水平所需的时间。此外，也有报道显示，生物活性物质可以通过改善水溶性，加快其在体内进入组织的速度和提高生物利用率。近几年来，陆续有人利用包埋、微乳化等方法改善植物甾醇在水相中的分散性，但制备的水溶性植物甾醇微乳液、纳米分散体和纳米脂质体等具有稳定性差、不宜长期保存、容易变质等缺点。

通过化学修饰合成亲水植物甾醇衍生物这一有前景的研究，目前还刚刚起步，主要有以下一些专利：

cn106755252b公开了一种以离子液体为催化剂，一锅法合成亲水性植物甾醇/甾烷醇衍生物。该专利的反应温度为80℃~130℃，反应温度过高，且离子液体的食品安全性未知，两步反应结束后，需经过多次反复萃取以获得高纯度产品，后处理复杂。

cn109053843b公开了一种植物甾醇多元酸肌醇酯及其制备方法，该方法分为三步：第一步，植物甾醇和琥珀酸酐反应合成植物甾醇琥珀酸单酯；第二步，植物甾醇琥珀酸单酯与乙酸乙烯酯制备植物甾醇琥珀酸乙烯酯；第三步，植物甾醇琥珀酸乙烯酯与肌醇合成植物甾醇琥珀酸肌醇酯。其中，仅第三步反应使用生物酶催化，其余两步均采用化学催化。同时，该专利仅合成肌醇酯一种，与本发明采用的多种功能性糖类作亲水剂相比，应用范围较小、大众接受度较差。

cn103965278a公布了一种一种植物甾醇有机二元酸糖酯的制备方法。该发明采用的技术方案为使用二环己基碳酰亚胺、4-二甲氨基吡啶和对甲基苯磺酸复合催化剂催化植物甾醇有机二元酸单酯与功能性糖发生酯化。该专利第一步反应在110℃条件下于甲苯中反应6h，选择的反应溶剂毒性大，反应温度过高。第二步使用多种化学催化剂复配，合成植物甾醇有机二元酸糖酯，催化剂不宜去除、后处理复杂、安全性差。

技术实现要素：

要解决的技术问题：本发明利用糖类/糖醇类为亲水剂，二元酸二乙烯酯为连接剂，通过化学修饰合成亲水植物甾醇衍生物，解决了物理改善植物甾醇水溶性存在的问题。同时，本发明还提供了一种在有机相中一锅两步全酶法催化酯交换合成亲水性植物甾醇二元酸糖酯的方法，无需官能团保护、操作简单、能耗低、产率高、品质稳定、易于保存，可有效解决之前化学合成方法过程中出现的反应温度高、溶剂毒性大、催化剂使用量大、后处理复杂、食用安全系数低等缺陷。

技术方案：一种在有机相中全酶法制备亲水性植物甾醇二元酸糖酯的方法，制备步骤如下：

s1：植物甾醇二元酸乙烯酯的制备：分别称取植物甾醇、二元酸二乙烯酯、脂肪酶于反应容器中，加入预先经过脱水处理的反应溶剂，置于恒温震荡器中，在温度35℃~60℃和震荡转速200rpm~300rpm下开始反应10h~48h；

s2：植物甾醇二元酸糖酯的制备：反应液过滤除去酶，旋转蒸发除去溶剂，加入糖类/糖醇类、蛋白酶和预先经过脱水处理的溶剂，在温度35℃~60℃下继续反应24h~120h，即合成亲水植物甾醇二元酸糖酯。

进一步的，所述植物甾醇为β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、菜籽甾醇中的一种或一种以上以任意比例的混合物。

进一步的，所述二元酸二乙烯酯为丁二酸二乙烯酯、己二酸二乙烯酯、辛二酸二乙烯酯、癸二酸二乙烯酯中的一种或几种。

进一步的，所述脂肪酶为诺维信固定化脂肪酶novozyme435、固定化脂肪酶lipozymerm、lipozymetlim或褶皱假丝酵母脂肪酶candidarugosa。

进一步的，所述步骤s1中预先经过脱水处理的反应溶剂为环己烷、正己烷、正庚烷、正辛烷、异辛烷或石油醚。

进一步的，所述糖类/糖醇类为山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、异麦芽糖醇、乳糖醇、半乳糖醇、赤藓糖醇和葡萄糖、果糖、甘露糖、蔗糖、山梨糖、木糖、乳糖、麦芽糖、棉子糖中的一种或几种。

进一步的，所述蛋白酶为中性蛋白酶、碱性蛋白酶或芽孢杆菌属蛋白酶。

进一步的，所述步骤s2中预先经过脱水处理的溶剂为吡啶、吡啶+丙酮、n，n-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜。

进一步的，所述步骤s1中二元酸二乙烯酯的摩尔量为植物甾醇摩尔量的1~5倍，脂肪酶用量为10mg/ml~50mg/ml。

进一步的，所述步骤s2中植物甾醇二元酸乙烯酯与糖类/糖醇类的摩尔量为1:1~1:5，蛋白酶用量为10mg/ml-50mg/ml。

植物甾醇二元酸糖酯合成反应方程式如下：

第一步：

第二步：

其中，n=2、4、6或8；

其中，r1=；

其中，r2为糖基/糖醇基。

有益效果：

1、本发明使用糖类/糖醇类为亲水剂，二元酸二乙烯酯为连接剂，通过化学修饰合成植物甾醇二元酸糖酯，在一定程度上改善了植物甾醇的亲水性，扩大了其在食品领域的应用范围。

2、本发明采用两步酶法，在温和的反应条件下进行反应，从根本上解决了传统亲水植物甾醇衍生物合成过程中反应温度过高、催化剂使用量大、毒性强、后处理操作步骤复杂等缺点，为后期实现绿色工业化生产奠定基础。

3、本发明选用多种糖醇类/糖类为亲水剂对植物甾醇进行亲水改性，覆盖面广、产品安全性高、大众接受度好。

4、植物甾醇和糖类直接发生糖基化反应制备植物甾醇糖苷，具有以下缺点：（1）反应转化率低；（2）所使用的大多数催化剂比较昂贵、毒性较强，导致合成成本增加、生态恶化；（3）对应的糖基化转移酶不易匹配，不能采用酶法温和、绿色合成目标产物。本发明选用两步法酶催化酯交换合成亲水植物甾醇二元酸糖酯，以二元酸二乙烯酯为连接剂，反应条件温和、操作简单、收率高，避免了直接糖基化的缺点。

5、本发明以二元酸二乙烯酯为连接剂，以酯交换的方法合成植物甾醇二元酸糖酯，反应后生成乙醛，以气体形式释放，促进了反应平衡的正相进行，获得较高的转化率，避免了因传统的酯化反应产生的副产物水阻碍了反应的顺利进行。

6、酶对其底物具有高度特异性，本发明两步法合成中依次选用了市售的固定化或固体脂肪酶和蛋白酶作为生物催化剂进行催化酯交换，分别获得了不错的转化率，而且反应后易于分离回收。

附图说明

图1为β-谷甾醇己二酸乙烯酯的高效液相色谱图。

图2为菜油甾醇己二酸蔗糖酯的高效液相色谱图。

图3为β-谷甾醇己二酸乙烯酯质谱图。

图4为菜油甾醇己二酸蔗糖酯质谱图。

图5为β-谷甾醇丁二酸山梨糖醇酯质谱图。

图6为β-谷甾醇己二酸乙烯酯和β-谷甾醇的nmr谱图。

具体实施方式

本发明提出了一种在有机相中全酶法制备亲水性植物甾醇二元酸糖酯的方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下将配合实施例来对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

通过高效液相色谱(hplc)-蒸发光散射检测器(elsd)测定植物甾醇向植物甾醇二元酸乙烯酯和植物甾醇二元酸乙烯酯向亲水性植物甾醇二元酸糖酯两步反应的转化率和纯度。hplc-elsd分析系统包括agilent1260高效液相色谱仪、蒸发光散射检测器和数据处理软件。通过使用zorbax300sb-c18（5μm，4.6×250mm，agilent）在35℃下等度洗脱样品。甲醇/甲酸（v/v，1000/1）用作流动相，进样量10μl，流速为1ml/min。将elsd检测器控制在60℃。高纯氮气用作载气，压力为0.5bar。

中间产物和最终产物转化率定义如下：

转化率（%）=新物质峰面积/(新物质峰面积+初始物质峰面积)×100

采用高效液相色谱质谱联用仪(hplc-ms)和核磁共振波谱(nmr)鉴定植物甾醇二元酸乙烯酯和亲水性植物甾醇二元酸糖酯的化学结构。hplc-ms分析采用agilent1200和agilent6310，iontraplc/ms高效液相色谱质谱联用仪。液相条件为通过使用zorbax300sb-c18（5μm，4.6×250mm，agilent）在35℃下等度洗脱样品。甲醇/甲酸（v/v，1000/1）用作流动相，进样量10μl，流速为1ml/min。将dad检测波长控制在205nm。质谱条件采用esi源（+）模式，喷雾电压3kv，温度：350℃。nmr分析采用bruke400mhz核磁共振波谱仪，将纯化的产物溶于氘代氯仿，以四甲基硅烷为内标。

实施例1

β-谷甾醇己二酸乙烯酯的制备

制备方法：分别将3gβ-谷甾醇、3ml己二酸二乙烯酯，0.5g褶皱假丝酵母脂肪酶candidarugosa，100ml脱水异辛烷，依次加入反应瓶中，置于恒温震荡反应器，开启震荡转速为250rpm，调整温度至50℃，反应14h。经hplc-elsd检测β-谷甾醇己二酸乙烯酯的转化率可达95.7％。图1为β-谷甾醇己二酸乙烯酯的高效液相色谱图。将反应液过滤除去酶，旋转蒸发除去溶剂即可得到3.7gβ-谷甾醇己二酸乙烯酯。

结构鉴定：hplc-ms：β-谷甾醇的相对分子质量分别为414。β-谷甾醇己二酸乙烯酯的相对分子质量分别为568。β-谷甾醇己二酸乙烯酯在es⁺电离下，存在β-谷甾醇己二酸乙烯酯的[m+na]⁺分子离子峰591（即568+23）和[m-b]⁺分子离子峰397。图3为β-谷甾醇己二酸乙烯酯质谱图。nmr：β-谷甾醇己二酸乙烯酯和β-谷甾醇的nmr谱图如图6。因为游离β-谷甾醇c-3位羟基与己二酸二乙烯酯发生酯交换转变为酯基，所以c-3位氢从3.5ppm处已转移到4.6ppm，同时在4.8ppm和4.56ppm出现β-谷甾醇己二酸乙烯酯烯烃双键氢的特征峰。因此，根据hplc-ms和nmr结果证实中间产物为β-谷甾醇己二酸乙烯酯。

实施例2

菜油甾醇己二酸蔗糖酯的制备

制备方法：（1）分别将3g菜油甾醇、3ml己二酸二乙烯酯，1g诺维信固定化脂肪酶novozyme435，100ml脱水石油醚，依次加入反应瓶中，置于恒温震荡反应器，开启震荡转速为250rpm，调整温度至55℃，反应48h。经hplc-elsd检测菜油甾醇己二酸乙烯酯的转化率可达81.7％。（2）取样后，将第一步反应液过滤除去酶，旋转蒸发除去溶剂，加入6g亲水修饰剂蔗糖、0.2g碱性蛋白酶，30ml吡啶，将反应瓶置于恒温震荡反应器，开启震荡转速为250rpm，调整温度至55℃，反应96h。取样进hplc-elsd分析，经检测最终产物植物甾醇己二酸蔗糖酯的转化率可达84.1％。图2为菜油甾醇己二酸蔗糖酯的高效液相色谱图。（3）停止加热后，旋干溶剂。将粗品溶于一定量的二氯甲烷和甲醇，超声溶解后，过滤。分别用0.1m氢氧化钠溶液、饱和食盐水和蒸馏水分批依次洗涤有机层，最后收集有机层，旋转蒸发除去正丁醇即得植物甾醇己二酸蔗糖酯。hplc纯度为92.1％，计算得到收率为89.4％。所得植物甾醇己二酸蔗糖酯在30℃水中的溶解度为0.51g/l。

结构鉴定：hplc-ms：菜油甾醇己二酸蔗糖酯的相对分子质量分别为852。在es+电离下，菜油甾醇己二酸蔗糖酯的[m+na]⁺和[m-b]⁺分子离子峰，它们分别为875(即852+23)和383。图4为菜油甾醇己二酸蔗糖酯质谱图。

实施例3

β-谷甾醇丁二酸山梨糖醇酯的制备

制备方法：（1）分别将3gβ-谷甾醇、3ml丁二酸二乙烯酯，1g固定化脂肪酶lipozymerm，80ml脱水正庚烷，依次加入反应瓶中，置于恒温震荡反应器，开启震荡转速为250rpm，调整温度至60℃，反应48h。经hplc-elsd检测植物甾醇己二酸乙烯酯的转化率可达97.1％。（2）取样后，将第一步反应液过滤除去酶，旋转蒸发除去溶剂，加入3g亲水修饰剂山梨糖醇、0.5g中性蛋白酶，20ml吡啶和丙酮二元混合溶剂，将反应瓶置于恒温震荡反应器，开启震荡转速为250rpm，调整温度至40℃，反应120h。取样进hplc-elsd分析，经检测最终产物β-谷甾醇丁二酸山梨糖醇酯的转化率可达90.6％。（3）停止加热后，旋干溶剂。将粗品溶于一定量的正丁醇，超声溶解后，过滤。分别用0.1m氢氧化钠溶液、饱和食盐水和蒸馏水分批依次洗涤有机层，最后收集有机层，旋转蒸发除去正丁醇即得β-谷甾醇丁二酸山梨糖醇酯。hplc纯度为94.5％，计算得到收率为92.9％。所得β-谷甾醇丁二酸山梨糖醇酯在30℃水中的溶解度为0.39g/l。

结构鉴定：hplc-ms：β-谷甾醇丁二酸山梨糖醇酯的相对分子质量分别为678。在es+电离下，β-谷甾醇丁二酸山梨糖醇酯的[m+na]⁺和[m-b]⁺分子离子峰，它们分别为701(即678+23)和397。图5为β-谷甾醇丁二酸山梨糖醇酯质谱图。

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