一种利用新型葡萄糖醛酸酶生物催化制备甘草次酸的方法与流程

本发明属于催化剂领域，特别涉及一种利用新型葡萄糖醛酸酶生物催化制备甘草次酸的方法。

背景技术：

β-葡萄糖醛酸酶（kae），存在于人体各组织和体液中，是一种可以水解葡萄糖醛酸苷酸性水解酶。在肝组织中含量最多，在促进细胞增殖中起重要作用。正常人血清中该酶活性最低，随着细胞增生变化，其活性逐渐升高，至发生癌变时活性显著升高。β-葡萄糖醛酸酶作为一种体内酶标志，是与肝癌的发生发展相关的体内活性酶，可能成为肝癌诊断的辅助指标。虽然人类的β-葡萄糖醛酸酶在疾病中发挥重要作用，但人类存在的大多数β-葡萄糖醛酸酶位于微生物群中。事实上，肠道微生物组编码了数千种糖基水解酶，而人类基因组编码的只有97种。近些年，以酶为基础的快速检测技术发展趋于成熟，人们实现了对通过对β-葡萄糖醛酸苷酶活性的近实时监测，用于农村地表水微生物水质在线监测。

甘草属于豆科植物，具有明显的抗炎，抗溃疡作用和抗变态反应作用；近年的药理研究发现甘草还具抗肿瘤，抗爱滋病毒的活性。大量研究证明，甘草酸的药理活性主要归因于甘草的主要成分甘草酸和甘草次酸及其衍生物。甘草酸作为一种天然糖苷类化合物，同其他天然的糖苷类物质一样，不易溶于水，而且由于在c3位连接2个葡萄糖醛酸，极性较强，不能有效透过疏水性的细胞膜，降低了在细胞中的浓度，限制了甘草酸在细胞内发挥药效，不能更好的应用在一些药物治疗上。因此，需要通过定向改造它们的结构，来提高其衍生物的活性。研究表明甘草酸的糖链对其生理功能有着重要影响。如果去掉甘草酸的2个葡萄糖醛酸，则生成甘草次酸，其抗炎，免疫调节，抗肝损伤，抗病毒，抗肿瘤等生理活性相比于甘草酸有明显的增强。

现存的β-葡萄糖醛酸酶大部分会断裂甘草酸的两个糖链，导致中间产物单葡萄糖醛酸甘草次酸的生成，使最终产物不纯。且游离酶的大量使用造成生产成本过高，不利于工业化应用，因此寻找一种能够高效快速的将甘草酸直接转化为甘草次酸的新型β-葡萄糖醛酸酶，具有极高的工业利用价值。

技术实现要素：

针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种新型葡萄糖醛酸酶，并利用其固定化酶生物催化制备甘草次酸，避免中间产物单葡萄糖醛酸甘草次酸的生成，同时利用固定化酶可回收再次利用的特点，降低生产成本。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种利用新型葡萄糖醛酸酶生物催化制备甘草次酸的方法，包括以下步骤：

1）通过与现存β-葡萄糖醛酸酶进行同源度比对，筛选出一种来自于伯氏曲霉的β-葡萄糖醛酸酶，所述的β-葡萄糖醛酸酶是由ncbi数据库中基因编号为kae8374379.1的基因序列所编码，通过基因工程手段将所述基因导入大肠杆菌表达得到β-葡萄糖醛酸酶；

2）在磷酸盐缓冲液中，用fe3o4@zr-2mim载体固定步骤1）获得的β-葡萄糖醛酸酶，得到固定化酶fe3o4@zr-2mim@kae；

3）利用步骤2）得到的固定化酶催化甘草酸生成甘草次酸。

进一步的，步骤1）中所述基因工程手段的具体方法包括：首先利用pcr对基因进行扩增，而后采用酶切连接手段将其导入表达载体质粒pet28a，通过大肠杆菌bl21(de3)进行蛋白表达；

其中pcr扩增的引物为：

引物kae-f：5’-gggaaaggatccattccgaccgatgcgcaga-3’

引物kae-r：5’-gggaaagtcgacctggcacgcctggccttc-3’。

进一步的，步骤2）中所述fe3o4@zr-2mim载体的制备方法为：将磁性fe3o4在pvp（水/甲醇/乙醇）溶液中超声悬浮，随后加入二甲基咪唑（2-mim）（水/甲醇/乙醇）溶液，继续超声，最后在搅拌下缓慢加入硝酸锆（水/甲醇/乙醇）溶液，静置后分离沉淀，干燥后得到固定化载体fe3o4@zr-2mim。

进一步的，步骤2）中所述磷酸盐缓冲溶液为磷酸氢二钠和柠檬酸混合液，ph值为7.0~8.0。

进一步的，步骤2）中β-葡萄糖醛酸酶的浓度为0.5mg/ml~2.5mg/ml；fe3o4@zr-2mim载体量为2mg~6mg；固定化温度为20℃~40℃，固定时间12min~45min，固定环境为金属浴振荡600rpm~800rpm。

进一步的，步骤3）所述固定化酶催化甘草酸制备甘草次酸的具体步骤为：称量甘草酸溶解于醋酸-醋酸钠缓冲液中，形成甘草酸溶液，加入吸去上清磷酸盐缓冲液的固定化酶fe3o4@zr-2mim@kae中，摇床反应后通过离心将上清分离，沉淀即为甘草次酸。

进一步的，步骤3）催化反应的温度为40℃~60℃，时间为2h~6h，ph值为4.5~5.5。

进一步的，步骤3）所述甘草酸在醋酸-醋酸钠中的浓度为1mg/ml~3mg/ml。

本发明相比现有技术的有益效果为：

1、本发明的方法克服了现有技术生成甘草次酸时会生成中间产物单葡萄糖醛酸甘草次酸的问题，本发明中所述的β-葡萄糖醛酸酶转化快，能够在2h内将底物甘草酸完全转化；现有多数固定化酶的制备采用的是先纯化后固定的方式，增加了固定化酶制备的难度和工作量，实用性差，本发明得到的固定化载体fe3o4@zr-2mim，利用葡萄糖醛酸酶中人工引入的his标签可以与锆基特异性配位结合的原理，从细胞裂解液中直接特异性固定β-葡萄糖醛酸酶，省略了酶纯化步骤，并且本发明制备得到的固定化酶为磁响应沉淀物，可以通过磁响应回收再利用，降低了生产成本，工艺简单，经济节约，非常适合于大规模工业化生产；

2、本发明的fe3o4@zr-2mim@kae催化效率高，对甘草酸的转化率基本达到95%，反应条件温和、高效、绿色安全，底物甘草酸基本完全转化为甘草次酸。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1为β-葡萄糖醛酸酶pcr扩增电泳图；

图2为酶基因成功导入表达载体质粒双酶切验证dna电泳示意图；

图3为表达载体质粒为pet28a图谱；

图4为固定化酶fe3o4@zr-2mim@kae透射电镜图；

图5为甘草酸生成甘草次酸转化原理图；

图6为hplc测定实施例3的甘草次酸产品纯度图。

具体实施方式

实施例1

本实施例提供了β-葡萄糖醛酸酶的筛选与表达，具体方法为：首先通过基因数据库ncbi，将现存应用较多的β-葡萄糖醛酸酶进行序列比对，筛选出一种来自于伯氏曲霉的β-葡萄糖醛酸酶（氨基酸序列同源度85%），基因编号kae8374379.1，通过pcr扩增得到目的基因（如图1所示），其引物为：

引物kae-f：5’-gggaaaggatccattccgaccgatgcgcaga-3’，酶切位点为bamhi；

引物kae-r：5’-gggaaagtcgacctggcacgcctggccttc-3’，酶切位点为sali。

而后采用酶切连接手段将目的基因与表达载体质粒pet28a连接（如图2、图3所示），导入表达菌-大肠杆菌bl21(de3)，100mllb液体培养基培养，在od0.6时加入诱导剂iptg，在16℃下低温诱导24h，离心，菌体用20ml，20mm，ph7.0磷酸盐缓冲液重悬，超声细胞破碎，得到β-葡萄糖醛酸酶粗酶液。

实施例2

本实施例构建了固定化酶fe3o4@zr-2mim@kae，具体方法为：

1）表达载体fe3o4@zr-2mim的构建

将fe3o4微球（100mg）加入溶于pvp的甲醇溶液（50ml，1mg/ml）中，在超声仪中超声60min，用磁铁吸附除去上清。在超声波作用下，沉淀被收集并分散在2-甲基咪唑（2-mim）的甲醇（25ml，40mm）溶液中。然后，在搅拌下将zr(no3)4·5h2o的甲醇溶液（25ml，40mm）添加到溶液中。静置10min后，用磁铁收集，并用甲醇溶液彻底冲洗。沉淀在80℃下干燥8h。

2）固定化酶fe3o4@zr-2mim@kae的构建

取实施例1制备得到的β-葡萄糖醛酸酶粗酶液，每管2ml，分装在离心管中，每管加入3mg构建好的载体fe3o4@zr-2mim，在25摄氏度，800rpm下金属浴震荡反应30min，通过锆和β-葡萄糖醛酸酶所带组氨酸标签的特异性吸附作用，在细胞裂解液中直接固定酶，反应完成后将上清粗酶液吸出，固定化酶fe3o4@zr-2mim@kae加1mlph7.0磷酸盐缓冲液保存，放置于冰箱待用。

利用透射电镜观察构建得到的固定化酶，结果图如图4所示。

实施例3

本实施例利用实施例2构建的固定化酶fe3o4@zr-2mim@kae催化甘草酸制备甘草次酸，其反应原理图如图5所示，具体方法为：

称量甘草酸10mg，溶解于5mlph5.020mm醋酸-醋酸钠缓冲液中，取1ml甘草酸溶液，加入吸去上清磷酸盐缓冲液的固定化酶fe3o4@zr-2mim@kae中，在60℃摇床反应2h，待2h后通过12000rpm离心将上清分离，沉淀即为产物甘草次酸。

将得到的沉淀溶解于1ml甲醇中，如图6所示，hplc（甲醇：0.2%磷酸90:10波长254nm，流速1ml/min，柱温35℃）检测上清和沉淀中甘草酸、甘草次酸含量，最终转化率为95%。

最后应说明的是，以上仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳布置方案对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

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