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您当前的位置： 一种DNA和RNA双建库用于NGS标定肺癌靶向用药和化疗用药基因组的方法及系统与流程
2021-02-02 18:02:32|
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本发明属于基因测序技术领域，具体涉及一种dna和rna双建库用于ngs标定肺癌靶向用药和化疗用药基因组的方法及系统。
背景技术：
肿瘤是一种由多基因发生改变而导致相关基因功能障碍的复杂疾病，多基因改变也是肿瘤发生发展的最根本原因。肿瘤患者对各种药物存在明显个体差异，也与患者个体肿瘤相关基因差异表达和多态性有关。肿瘤相关基因的变异状态在肿瘤的诊断、治疗、预后等个性化治疗过程中起着非常重要的作用，随着越来越多的标志物被鉴定出来，肿瘤的治疗方式将根据患者特异性的生物标志物变得越来越个性化，在实现肿瘤个性化治疗的道路上，下一代测序(ngs)技术发挥着不可取代的作用，它帮助研究人员和病理学家实现了从单基因检测到多基因检测的完美转换。
药物安全性是病人从个体化用药首先受益的领域，恶性肿瘤是目前最需要个体化药物治疗的一类疾病，然而，在肿瘤化疗中，无论是疗效还是毒副作用，都存在较大的个体差异。通过个体基因多态性检测分析，可以为医生提供有力的证据和信息，在实施治疗方案时，可选择对患者最有效的药物治疗方案，不仅提高了疗效，还可以降低化疗毒副作用。当前，即便不是所有的药物都能实行基因导向的个体化治疗，基因检测指导下的安全药物个体化治疗已经有显著临床应用意义。
肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。近50年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高，男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位。肺癌的病因至今尚不完全明确，大量资料表明，长期大量吸烟与肺癌的发生有非常密切的关系。目前。化学治疗是肺癌的最主要治疗手段，90％以上的肺癌患者需要接受化疗治疗，化疗对肺癌的疗效无论早期或晚期均较肯定，甚至有约1％的早期小细胞肺癌通过化疗治愈，对非小细胞肺癌的肿瘤缓解率为40％～50％。通过肺癌药物基因检测进行靶向药物治疗可明显提高化疗效果、精准性及药物安全性，现有肺癌药物基因检测系统注重对单一靶向药物或者是化疗药物基因进行检测，也出现了个别针对基因突变的检测组合，但主要是针对泛癌种设计，且局限于检测点突变等常规突变，无法检测基因融合突变和剪接变异所带来的与疾病相关的基因变异，检测效率低，检测成本高。
本发明检测体系是利用pcr扩增dna构建dna文库，同时利用逆转录mrna成互补dna(cdna)后再经pcr扩增融合和不同剪切重组的dna(rna文库构建)。上述两种文库核酸再采用illumina平台对目标序列进行高通量测序和分析，从而获得目标基因的突变信息。illumina新一代测序技术可以高通量、并行对核酸片段进行深度测序，测序的技术原理是采用可逆性末端边合成边测序反应，首先在dna片段两端加上序列已知的通用接头和信标序列构建文库，文库加载到测序芯片flowcell上，文库两端的已知序列与flowcell基底上的oligo序列互补，每条文库片段都经过桥式pcr扩增形成一个簇，测序时采用边合成边测序反应，即在碱基延伸过程中，每个循环反应只能延伸一个正确互补的碱基，根据不同的荧光信号确认碱基种类，保证最终的核酸序列质量，经过多个循环后，完整读取核酸序列。
技术实现要素：
针对现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种dna和rna双建库用于ngs标定肺癌靶向用药和化疗用药基因组的方法及系统。
本发明的技术方案概述如下：
提供一种dna和rna双建库用于ngs标定肺癌靶向用药和化疗用药基因组的方法：通过直接对已知突变位点的基因进行扩增后建库，并进行ngs的测序检测，再结合生物信息学分析确定并验证突变基因的存在；具体包括以下步骤：
s1：核酸提取：按照《ffpe组织基因组dna提取标准操作流程》提取dna，按照《组织rna提取标准操作流程》提取rna，并测定dna/rna的浓度；
s2：文库构建：
dna文库构建：对基因组dna进行特异性pcr扩增反应、特异性引物消化，纯化产物后，再对其进行二次pcr扩增反应，纯化并质控文库；
其中，特异性pcr反应体系由高保真pcr混合液、chs298引物、dna按照(10～14)：(3～5)：(6.5～9.5)的体积比混合而成；
二次pcr反应体系由indexingpcrmastermix、无核酸酶水、pi700序列标签、pi500序列标签、纯化后产物按照(20～30)：(12～16)：(3～5)：(3～5)：(2.5～3.5)的体积比混合而成；
rna文库构建：以rna为模板反转录合成cdna，并进行特异性pcr扩增反应、特异性引物消化，纯化产物后，再对其进行二次pcr扩增反应，纯化并质控文库；
其中，特异性pcr反应体系由高保真pcr混合液、5xsf引物、cdna按照(20～30)：(8～12)：(14～16)的体积比混合而成；
二次pcr反应体系由indexingpcrmastermix、无核酸酶水、pi700序列标签、pi500序列标签、纯化后产物按照(20～30)：(4～6)：(3～5)：(3～5)：(11～13)的体积比混合而成；
s3：上机测序：将高通量测序文库上机，并运行设备，在illumina的miniseq平台测序；
s4：数据生物信息学处理分析：将测序得到的fastq格式文件上传至真固生物配套的生信分析软件系统进行自动分析即可；
s5：质控：阳性质控：以panel检测范围内已知突变标本核酸为模板，与样本平行实验，每批次1个；阴性质控：以无检测范围内或检测范围外突变标本核酸为模板，与样本平行实验，每批次1个。
优选的是，所述测定dna/rna的浓度操作方法为：使用
a)将1μlqubitreagent加入199μlqubitbuffer，充分震荡，微离心，得到qubit荧光混合物；
b)向2个qubit浓度测定专用管中分别加入190μlqubit荧光混合物，标记为s1、s2，向s1标记专用管中加入10μlstandard1，向s2标记专用管中加入10μlstandard2；
c)向另外2个qubit浓度测定专用管中分别加入199μlqubit荧光混合物，加入1μldna/rna样本；
d)接通
优选的是，所述dna或rna文库构建中纯化并质控文库方法为：
a.室温下，取50.0μlagencourtampurexpbeads与产物混匀，室温孵育5min；
b.置于磁力架上5min，弃上清；
c.加入150.0μl70％乙醇，静置30s，弃上清；
d.加入150.0μl70％乙醇，静置30s，弃上清；
e.室温放置2～5min，待磁珠干燥；
f.加入32.0μlddh2o，重悬磁珠，室温静置5min，离心后磁力架上放置2min至上清澄清；
g.转移30.0μl上清至新0.2mlpcr管中；
h.用qubit3.0将终文库进行浓度测定；
i.采用agilent2100生物分析仪检测文库片段大小。
优选的是，所述dna文库构建中特异性引物消化方法为：向25μl特异性pcr扩增后混合液中滴加3μlexonuclease、2μl10xexonucleaseibuffer，于37℃震荡反应20min，升温至80℃，震荡反应10min，再降温至8℃，备用。
优选的是，所述dna文库构建中纯化产物方法为：
a.加入20μl无核酸酶水至特异性引物消化产物中；
b.将agencourtampurexpbeads提前平衡至室温，加入60μl至产物中，混匀，室温孵育5min；
c.置于磁力架上5min，弃上清；
d.加入150.0μl新鲜配置的70％乙醇，静置30s，弃上清；
e.加入150.0μl新鲜配置的70％乙醇，静置30s，弃上清；
f.室温放置2～5min，待磁珠干燥，再加入32μlddh2o，重悬磁珠，于室温静置5min，离心后磁力架上放置5min至上清澄清。
优选的是，所述rna文库构建中特异性引物消化方法为：向50μl特异性pcr扩增后混合液中滴加3μlexonuclease、2μl10xexonucleaseibuffer，于37℃震荡反应20min，升温至80℃，震荡反应10min，再降温至8℃，备用。
优选的是，所述dna文库构建，其中，特异性pcr反应程序为：95℃热启动，15分钟；98℃变性，1分钟；58℃退火，2分钟；60℃退火，4分钟；64℃退火，1分钟；72℃延伸，1分钟；扩增5个循环；95℃变性，30秒；66℃退火延伸，3分钟；扩增18个循环；
8℃保存，无限循环；
二次pcr反应程序为：95℃热启动，2分钟；95℃变性，30秒；66℃退火，30秒；72℃延伸，60秒；扩增6个循环；72℃终延伸，5分钟；8℃保存，无限循环；
所述rna文库构建，其中，特异性pcr反应程序为：95℃热启动，15分钟；95℃变性，1分钟；58℃退火，1分钟；60℃退火，2分钟；64℃退火，30秒；72℃延伸，1分钟；扩增5个循环；95℃变性，30秒；66℃退火延伸3分钟；扩增24个循环；8℃保存，无限循环；
二次pcr反应程序为：95℃热启动，2分钟；95℃变性，30秒；66℃退火，30秒；72℃延伸，60秒；扩增5个循环；72℃终延伸，5分钟；8℃保存，无限循环。
优选的是，所述rna文库构建中纯化产物方法为：
a.将agencourtampurexpbeads提前平衡至室温，加入66μl至产物中，混匀，室温孵育5min；
b.置于磁力架上5min，弃上清；
c.加入150.0μl新鲜配置的70％乙醇，静置30s，弃上清；
d.加入150.0μl新鲜配置的70％乙醇，静置30s，弃上清；
e.室温放置2～5min，待磁珠干燥，再加入32μlddh2o，重悬磁珠，于室温静置5min，离心后磁力架上放置5min至上清澄清。
优选的是，所述高通量测序文库的制备方法为：
a.用rsbbuffer先将文库稀释成1.0nm；
b.将5μl1.0nm文库与5μl0.2nnaoh充分混匀，室温静置5min变性；
c.加入5μl200mmtris-hcl，将985μlhybridizationbuffer加入到变性完毕的文库中，振荡混匀，放置冰上防止复性，待进一步稀释；
d.取120μl上述稀释的文库与380μlhybridizationbuffer充分混匀，即得0.5ml高通量测序文库。
还提供一种dna和rna双建库用于ngs标定肺癌靶向用药和化疗用药基因组的系统，包括：
核酸提取模块，用于按照《ffpe组织基因组dna提取标准操作流程》提取dna，按照《组织rna提取标准操作流程》提取rna，并测定dna/rna的浓度；
文库构建模块，用于：
dna文库构建：对基因组dna进行特异性pcr扩增反应、特异性引物消化，纯化产物后，再对其进行二次pcr扩增反应，纯化并质控文库；
其中，特异性pcr反应体系由高保真pcr混合液、chs298引物、dna按照(10～14)：(3～5)：(6.5～9.5)的体积比混合而成；
二次pcr反应体系由indexingpcrmastermix、无核酸酶水、pi700序列标签、pi500序列标签、纯化后产物按照(20～30)：(12～16)：(3～5)：(3～5)：(2.5～3.5)的体积比混合而成；
rna文库构建：以rna为模板反转录合成cdna，并进行特异性pcr扩增反应、特异性引物消化，纯化产物后，再对其进行二次pcr扩增反应，纯化并质控文库；
其中，特异性pcr反应体系由高保真pcr混合液、5xsf引物、cdna按照(20～30)：(8～12)：(14～16)的体积比混合而成；
二次pcr反应体系由indexingpcrmastermix、无核酸酶水、pi700序列标签、pi500序列标签、纯化后产物按照(20～30)：(4～6)：(3～5)：(3～5)：(11～13)的体积比混合而成；
上机测序模块，用于将高通量测序文库上机，并运行设备，在illumina的miniseq平台测序；
处理分析模块，用于将测序得到的fastq格式文件上传至真固生物配套的生信分析软件系统进行自动分析即可；以及
质控模块，用于：
阳性质控：以panel检测范围内已知突变标本核酸为模板，与样本平行实验，每批次1个；阴性质控：以无检测范围内或检测范围外突变标本核酸为模板，与样本平行实验，每批次1个。
本发明的有益效果：
本发明解决了现有肺癌药物基因检测系统只可以针对非结构性基因突变(点突变，缺失和插入突变，移码突变等)检测用于靶向药物或者化疗药物的问题，同时能发现并定量检测新的转录本所反映的基因融合突变和不同剪切形成的异常突变，将结构性基因突变(基因融合突变，基因剪切变异等)及其表达量的改变与非结构性基因突变结合用于肺癌化疗和靶向药物基因检测，将肺癌化疗和靶向药物基因的多种突变类型检测在一个项目里就解决了；其次，本发明解决了肺癌小套餐检测范围不足以及大套餐检测内容过多造成成本增加的问题；由于本发明首先采用对检测区域的核酸进行基因扩增，然后上机测序分析，在保证了检测质量的同时大大的降低了无关数据量的产出，能在相对低通量的illumina平台的miniseq桌面仪上完成，极大降低检测成本和设备要求，提高了设备的检测和利用效率；本发明联合dna建库技术和rna建库技术用于肺癌的靶向药物及化疗药物治疗的选择，适用于各级医疗机构将ngs技术应用于指导临床精准用药。
附图说明
图1为本发明一实施例提供的一种dna和rna双建库用于ngs标定肺癌靶向用药和化疗用药基因组的方法流程图。
图2为本发明一实施例提供的一种dna和rna双建库用于ngs标定肺癌靶向用药和化疗用药基因组的系统
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
实施例1
如图1所示提供一种dna和rna双建库用于ngs标定肺癌靶向用药和化疗用药基因组的方法：通过直接对已知突变位点的基因进行扩增后建库，并进行ngs的测序检测，再结合生物信息学分析确定并验证突变基因的存在；具体包括以下步骤：
s1：核酸提取：按照《ffpe组织基因组dna提取标准操作流程》提取dna，按照《组织rna提取标准操作流程》提取rna，并测定dna/rna的浓度；
所述测定dna/rna的浓度操作方法为：使用
a)将1μlqubitreagent加入199μlqubitbuffer，充分震荡，微离心，得到qubit荧光混合物；
b)向2个qubit浓度测定专用管中分别加入190μlqubit荧光混合物，标记为s1、s2，向s1标记专用管中加入10μlstandard1，向s2标记专用管中加入10μlstandard2；
c)向另外2个qubit浓度测定专用管中分别加入199μlqubit荧光混合物，加入1μldna/rna样本；
d)接通
s2：文库构建：
dna文库构建：对基因组dna进行特异性pcr扩增反应、特异性引物消化，纯化产物后，再对其进行二次pcr扩增反应，纯化并质控文库；
其中，特异性pcr反应体系为：12.5μlgspcrmmx(高保真pcr混合液)+4.5μlchs298oligopool(chs298引物)+8μldna；
特异性pcr反应程序为：
[95℃,15min]；
[98℃,1min；58℃,2min；60℃,4min；64℃,1min；72℃,1min]5cycles；
[95℃,30s；66℃,3min]18cycles；
[8℃,∞]；
特异性引物消化方法为：向25μl特异性pcr扩增后混合液中滴加3μlexonuclease、2μl10xexonucleaseibuffer，于37℃震荡反应20min，升温至80℃，震荡反应10min，再降温至8℃，备用；
a.加入20μl无核酸酶水至特异性引物消化产物中；
b.将agencourtampurexpbeads提前平衡至室温，加入60μl至产物中，混匀，室温孵育5min；
c.置于磁力架上5min，弃上清；
d.加入150.0μl新鲜配置的70％乙醇，静置30s，弃上清；
e.加入150.0μl新鲜配置的70％乙醇，静置30s，弃上清；
f.室温放置2～5min，待磁珠干燥，再加入32μlddh2o，重悬磁珠，于室温静置5min，离心后磁力架上放置5min至上清澄清；
二次pcr反应体系为：25μlindexingpcrmastermix+14μlnuclease-freewater(无核酸酶水)+4μlpi700pillarindex(pi700序列标签)+4μlpi500pillarindex(pi500序列标签)+3μl纯化后产物；
二次pcr反应程序为：
[95℃,2min]；
[95℃,30s；66℃,30s；72℃,60s]6cycles；
[72℃,5min]；
[8℃,∞]；
rna文库构建：以rna为模板反转录合成cdna，并进行特异性pcr扩增反应、特异性引物消化，纯化产物后，再对其进行二次pcr扩增反应，纯化并质控文库；
其中，特异性pcr反应体系为：25μlgspcrmmx(高保真pcr混合液)+10μl5xsfoligopool(sf引物)+15μlcdna；
特异性pcr反应程序为：
[95℃,15min]；
[95℃,1min；58℃,1min；60℃,2min；64℃,30s；72℃,1min]5cycles；
[95℃,30s；66℃,3min]24cycles；
[8℃,∞]；
rna文库构建中特异性引物消化方法为：向50μl特异性pcr扩增后混合液中滴加3μlexonuclease、2μl10xexonucleaseibuffer，于37℃震荡反应20min，升温至80℃，震荡反应10min，再降温至8℃，备用；
所述rna文库构建中纯化产物方法为：
a.将agencourtampurexpbeads提前平衡至室温，加入66μl至产物中，混匀，室温孵育5min；
b.置于磁力架上5min，弃上清；
c.加入150.0μl新鲜配置的70％乙醇，静置30s，弃上清；
d.加入150.0μl新鲜配置的70％乙醇，静置30s，弃上清；
e.室温放置2～5min，待磁珠干燥，再加入32μlddh2o，重悬磁珠，于室温静置5min，离心后磁力架上放置5min至上清澄清；
二次pcr反应体系为：25μlindexingpcrmastermix+5μlnuclease-freewater+4μlpi700pillarindex+4μlpi500pillarindex+12μl纯化后产物；
二次pcr反应程序为：
[95℃,2min]；
[95℃,30s；66℃,30s；72℃,60s]5cycles；
[72℃,5min]；
[8℃,∞]；
所述dna或rna文库构建中纯化并质控文库方法为：
a.室温下，取50.0μlagencourtampurexpbeads与产物混匀，室温孵育5min；
b.置于磁力架上5min，弃上清；
c.加入150.0μl70％乙醇，静置30s，弃上清；
d.加入150.0μl70％乙醇，静置30s，弃上清；
e.室温放置2～5min，待磁珠干燥；
f.加入32.0μlddh2o，重悬磁珠，室温静置5min，离心后磁力架上放置2min至上清澄清；
g.转移30.0μl上清至新0.2mlpcr管中；
h.用qubit3.0将终文库进行浓度测定；
i.采用agilent2100生物分析仪检测文库片段大小；
s3：上机测序：将高通量测序文库上机，并运行设备，进行illumina平台测序；
所述高通量测序文库的制备方法为：
a.用rsbbuffer先将文库稀释成1.0nm；
b.将5μl1.0nm文库与5μl0.2nnaoh充分混匀，室温静置5min变性；
c.加入5μl200mmtris-hcl，将985μlhybridizationbuffer加入到变性完毕的文库中，振荡混匀，放置冰上防止复性，待进一步稀释；
d.取120μl上述稀释的文库与380μlhybridizationbuffer充分混匀，即得0.5ml高通量测序文库；
s4：数据生物信息学处理分析：将测序得到的fastq格式文件上传至真固生物配套的生信分析软件系统进行自动分析即可；
s5：质控：
阳性质控：以panel检测范围内已知突变标本核酸为模板，与样本平行实验，每批次1个；
阴性质控：以无检测范围内或检测范围外突变标本核酸为模板，与样本平行实验，每批次1个。试剂清单如表1所示：
表1检测用试剂清单
表2列出检测基因名称及突变类型：
表2检测基因名称及突变类型
参见图2，本发明另一实施例还提供了一种dna和rna双建库用于ngs标定肺癌靶向用药和化疗用药基因组的系统，包括：
核酸提取模块，用于按照《ffpe组织基因组dna提取标准操作流程》提取dna，按照《组织rna提取标准操作流程》提取rna，并测定dna/rna的浓度；
文库构建模块，用于：
dna文库构建：对基因组dna进行特异性pcr扩增反应、特异性引物消化，纯化产物后，再对其进行二次pcr扩增反应，纯化并质控文库；
其中，特异性pcr反应体系由高保真pcr混合液、chs298引物、dna按照(10～14)：(3～5)：(6.5～9.5)的体积比混合而成；
二次pcr反应体系由indexingpcrmastermix、无核酸酶水、pi700序列标签、pi500序列标签、纯化后产物按照(20～30)：(12～16)：(3～5)：(3～5)：(2.5～3.5)的体积比混合而成；
rna文库构建：以rna为模板反转录合成cdna，并进行特异性pcr扩增反应、特异性引物消化，纯化产物后，再对其进行二次pcr扩增反应，纯化并质控文库；
其中，特异性pcr反应体系由高保真pcr混合液、5xsf引物、cdna按照(20～30)：(8～12)：(14～16)的体积比混合而成；
二次pcr反应体系由indexingpcrmastermix、无核酸酶水、pi700序列标签、pi500序列标签、纯化后产物按照(20～30)：(4～6)：(3～5)：(3～5)：(11～13)的体积比混合而成；
上机测序模块，用于将高通量测序文库上机，并运行设备，在illumina的miniseq平台测序；
处理分析模块，用于将测序得到的fastq格式文件上传至真固生物配套的生信分析软件系统进行自动分析即可；以及
质控模块，用于：
阳性质控：以panel检测范围内已知突变标本核酸为模板，与样本平行实验，每批次1个；阴性质控：以无检测范围内或检测范围外突变标本核酸为模板，与样本平行实验，每批次1个。
本发明实施例的dna和rna双建库用于ngs标定肺癌靶向用药和化疗用药基因组的系统的实施过程和工作原理可参考上述任一项对dna和rna双建库用于ngs标定肺癌靶向用药和化疗用药基因组的方法描述，在此不再赘述。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。
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