一种表观遗传学药物凋亡诱导模型的构建方法与流程

本发明涉及表观遗传学技术领域，尤其指一种表观遗传学药物凋亡诱导模型的构建方法。

背景技术：

表观遗传学修饰与肿瘤的发生发展密切相关，其主要通过dna甲基化、组蛋白修饰、非编码rna调控和染色质结构重构等方式对基因功能和表达水平进行调控，从而影响肿瘤的进展。目前针对表观遗传学的药物已经逐渐应用于恶性肿瘤的治疗，常见的药物类型包括dna甲基转移酶抑制剂和组蛋白去乙酰化酶抑制剂，但此类药物仍存在诸多不足之处广泛的临床应用仍需要进一步的研究，令人鼓舞的是表观遗传药物与多种抗肿瘤药物联合应用已表现出巨大的应用潜力。表观遗传学的主要研究内容包括：dna甲基化、组蛋白修饰、非编码rna调控和染色质结构重构。表观遗传的修饰在不改变dna序列的同时能调控基因的表达和(或)转录从而影响胚胎发育、干细胞的分化、衰老和肿瘤发生等过程。

dna甲基化是指在甲基转移酶(dnmt1、dnmt3a和dnmt3b)的催化下，将s腺苷甲硫氨酸(s-adenosylmethionine,sam)提供的甲基转移到胞嘧啶5位的碳原子，形成5′甲基胞嘧啶。dnmt1主要是维持dna甲基化，通过dna复制将亲代甲基化dna遗传到子代dna。dnmt3a和dnmt3b能将未甲基化的cpg位点甲基化，这在胚胎发育和肿瘤发生中起着重要作用。dnmt2是一种trna甲基转移酶，而dnmt3l是在胚胎发育过程中协调dnmt3a和dnmt3b的结构蛋白[10]。dnmt3c最近由barau等发现，主要涉及雄性生殖细胞系的反转录转座子启动子的甲基化。肿瘤特异性甲基化的基因能在循环肿瘤细胞(circulatingtumorcells,ctcs)、血液、尿液及其他体液中被检测，因此常用于早期肿瘤的诊断和预后的研究。在结肠、前列腺、乳腺、肝脏肿瘤和白血病中也发现dnmt3a、dnmt3b和dnmt3l的含量常常升高。研究表明dnmt3a的缺乏会引起部分基因的低甲基化并抑制白血病的转化，但也有证据表明dnmt3a和dnmt3b是抑制淋巴系统恶性肿瘤的肿瘤抑制基因。

组蛋白是由h1、h3、h2a、h2b和h4这5种类型的核心蛋白组成的高度保守的蛋白质，并与dna共同构成核小体。组蛋白氨基末端会在翻译后被修饰，组蛋白修饰后的类型和dna甲基化的程度将会决定特定的染色质结构。组蛋白修饰包括磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化、糖基化、adp核糖基化、去氨基化、类泛素化和脯氨酸异构化等。组蛋白尾部残端不同的修饰类型与特定蛋白相互作用，从而将染色质分为异染色质和常染色质。组蛋白修饰不仅可逆性抑制或促进基因转录而且还可以影响dna修复、复制、干细胞形成和细胞状态变化等过程。

与肿瘤的遗传因素相比，可逆的表观遗传变异可以通过化学药物调节，在癌症治疗中具有广泛的前景。目前针对表观遗传学的药物正在逐步被开发并用于肿瘤的治疗。主要包括：dna甲基转移酶抑制剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂和联合用药。

dna甲基转移酶抑制剂(dnamethyltransferaseinhibitors,dnmtis)通过抑制dnmts的活性来促进抑癌基因的表达从而减少肿瘤细胞的产生，所以dnmts可以作为特异性抗肿瘤药物的有效靶点，其主要包括核苷类和非核苷类。核苷类抑制剂主要包括azacitidine(aza)和decitabine。非核苷类dnmt抑制剂：非核苷类dnmt抑制剂在白血病，前列腺和乳腺癌中表现出良好的抗肿瘤作用

组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histonedeacetylaseinhibitor,hdaci)组蛋白去乙酰化酶是一组从组蛋白赖氨酸尾部去除乙酰基的高度保守的酶。hdac对组蛋白的去乙酰化促进了染色质的闭合和抑制基因转录。此外非组蛋白的乙酰化也非常重要。因此乙酰化和去乙酰化共同维持基因的正常转录。hdaci是一种新的抗肿瘤药物，通过调节基因表达发挥其作用。其对恶性肿瘤有广泛的作用，主要包括抑制细胞分化、抑制细胞周期生长、抑制血管生成、细胞凋亡和免疫调节。现在vorinostat和romidepsin在美国已经被批准用于皮肤t细胞淋巴瘤的治疗。在动物模型中研究发现hdac抑制剂通过下调正细胞周期调节因子如细胞周期蛋白d1、c-myc和akt来重建黑色素瘤细胞的凋亡、诱导细胞分化、抑制肿瘤生长和诱导抗恶性肿瘤增殖的基因表达。

针对表观遗传学药物在肿瘤细胞凋亡诱导模型的建立有利于指导用药，给肿瘤的治疗提供指导，但是目前针对表观遗传学药物在肿瘤细胞凋亡诱导模型的建立方法存在过程复杂、结果可信度低等缺点。

技术实现要素：

针对上述现有技术存在的技术问题，本发明提供一种过程简单、结果可信度高的表观遗传学药物凋亡诱导模型的构建方法。

为了达成上述技术目的，本发明采用如下技术方案：

一种表观遗传学药物凋亡诱导模型的构建方，包括以下步骤：

1)选取表观遗传学相关肿瘤细胞，采用细胞培养液进行体外培养；

所述肿瘤细胞包括骨髓增生异常综合征肿瘤细胞、皮肤t细胞淋巴瘤细胞、非小细胞肺癌细胞、乳腺癌细胞和前列腺癌细胞；

所述细胞培养液包括含10％胎牛血清的rpmi-1640培养液；

所述体外培养包括37℃二氧化碳培养箱中培养；

2)待肿瘤细胞生长至对数生长期后，将肿瘤细胞转移至4℃环境，使细胞生长同步化；

3)将步骤2)完成同步化生长的细胞分成不少于5组，分别向其中添加梯度浓度的表观遗传学药物，放入37℃二氧化碳培养箱中培养；

所述表观遗传学药物包括dna甲基转移酶抑制剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂和联合剂；

所述联合剂采用dna甲基转移酶抑制剂和组蛋白去乙酰化酶抑制剂混合制成。

4)将步骤3)培养后的细胞更换无表观遗传学药物细胞培养液，继续放入37℃二氧化碳培养箱中培养；

所述无表观遗传学药物细胞培养液包括含10％胎牛血清的rpmi-1640培养液；

5)收集步骤4得到细胞，提取dna进行琼脂糖凝胶电泳，记录dna琼脂糖凝胶电泳结果，并通过dna电泳结果来衡量细胞凋亡的进程；

6)收集步骤4得到细胞，采用透射电镜进行细胞形态观察，通过细胞形态结果衡量细胞凋亡的进程；

7)收集步骤4得到细胞，采用流式细胞仪进行细胞生长周期检测，通过检测的g1期细胞、s期细胞、g2期细胞的占比来衡量细胞凋亡的进程。

进一步地，所述步骤3)中的培养时长为1-2小时。

进一步地，所述步骤4)中的培养时长为6-10小时。

进一步地，所述步骤6)中的细胞经过戊二醛溶液固定后，再经丙酮脱水，电子染色后采用透射电镜进行细胞形态观察。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明采用肿瘤细胞体外培养的方式，在培养液中添加梯度浓度的表观遗传学药物进行处理，并通过dna琼脂糖凝胶电泳、透射电镜进行细胞形态观察和流式细胞仪检测细胞的g1期细胞、s期细胞、g2期细胞的占比，来建立表观遗传学药物凋亡诱导模型，操作简单、结果准确，有利于指导表观遗传学药物在肿瘤治疗中的应用。

具体实施方式

以下对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。

实施例1

1)选取非小细胞肺癌细胞，采用含10％胎牛血清的rpmi-1640培养液进行体外37℃二氧化碳培养箱中培养；

2)待肿瘤细胞生长至对数生长期后，将肿瘤细胞转移至4℃环境，放置8小时，使细胞生长同步化；

3)将完成同步化生长的细胞分成6组，分别向其中5组添加5mmol/l、15mmol/l、25mmol/l、35mmol/l、45mmol/l的dna甲基转移酶抑制剂，另外一组作为空白对照组，将六组放入37℃二氧化碳培养箱中培养2小时；

4)将六组细胞更换无表观遗传学药物的10％胎牛血清的rpmi-1640培养液，继续放入37℃二氧化碳培养箱中培养10小时；

5)收集步骤4得到细胞，提取dna进行琼脂糖凝胶电泳，记录dna琼脂糖凝胶电泳结果；采用透射电镜进行细胞形态观察；采用流式细胞仪进行细胞生长周期检测，检测的g1期细胞、s期细胞、g2期细胞的占比。结果显示添加45mmol/l的dna甲基转移酶抑制剂实验组dna琼脂糖凝胶电泳出现梯状带型，透射电镜观察到细胞形态明显小于对照组，且可见凋亡小体，流式细胞仪检测结果显示细胞生长明显受阻，由此可见在5mmol/l的dna甲基转移酶抑制剂对于细胞凋亡有着明显的诱导作用。

实施例2

1)选取皮肤t细胞淋巴瘤细胞，采用含10％胎牛血清的rpmi-1640培养液进行体外37℃二氧化碳培养箱中培养；

2)待肿瘤细胞生长至对数生长期后，将肿瘤细胞转移至4℃环境，放置8小时，使细胞生长同步化；

3)将完成同步化生长的细胞分成6组，分别向其中5组添加1.5mmol/l、3mmol/l、6mmol/l、12mmol/l、24mmol/l的组蛋白去乙酰化酶抑制剂，另外一组作为空白对照组，将六组放入37℃二氧化碳培养箱中培养2小时；

4)将六组细胞更换无表观遗传学药物的10％胎牛血清的rpmi-1640培养液，继续放入37℃二氧化碳培养箱中培养10小时；

5)收集步骤4得到细胞，提取dna进行琼脂糖凝胶电泳，记录dna琼脂糖凝胶电泳结果；采用透射电镜进行细胞形态观察；采用流式细胞仪进行细胞生长周期检测，检测的g1期细胞、s期细胞、g2期细胞的占比。结果显示添加12mmol/l的组蛋白去乙酰化酶抑制剂实验组dna琼脂糖凝胶电泳出现梯状带型，透射电镜观察到细胞形态明显小于对照组，且可见凋亡小体，流式细胞仪检测结果显示细胞生长明显受阻，由此可见在12mmol/l的组蛋白去乙酰化酶抑制剂对于细胞凋亡有着明显的诱导作用。

从以上实施例可以看出，本发明操作简单、结果准确，有利于指导表观遗传学药物在肿瘤治疗中的应用。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的简单修改或变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

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