HS90A作为鉴别牙髓干细胞和牙周膜干细胞的标志物的应用、鉴别二者的试剂盒及方法与流程

本发明涉及生物
技术领域：
，尤其是涉及一种hs90a作为鉴别牙髓干细胞和牙周膜干细胞的标志物的应用、鉴别二者的试剂盒及方法。
背景技术：
：人成体干细胞被认为是一种很好的临床材料，可以被应用在多种疾病中的细胞移植疗法。由于没有伦理问题，且无需加入外源基因，成体干细胞被认为是一种来源于胚胎的干细胞和诱导多功能干细胞的替代物。从人的口腔组织中可以分离得到多种成体干细胞，包括来源于成人牙齿的牙髓干细胞（dpscs），来自脱落乳牙的牙髓干细胞（shed），从牙周膜或者牙周韧带分离的牙周干细胞（pdlscs），来自牙龈组织的牙龈干细胞（gmscs）等等。dpscs和pdlscs都是一种很好的潜在的细胞材料，具有很多优秀的性能。首先，两种干细胞都可以自我更新和高度增殖。其次，他们都可以进行多谱系分化的潜能，在一定条件下分化成骨，成脂，成软骨和成神经。另外，这两种干细胞的都可以从牙科手术的医疗丢弃物组织中进行提取，材料易得。值得一提的是，牙科干细胞的胚胎来源是神经嵴，免疫原性低，在移植治疗中也没有免疫排斥问题。由于dpscs和pdlscs的细胞形态不存在差异，表面标志物特征都是阳性表达间充质标志物，不表达造血干细胞标志物，所以在形态学和表面特征上难以区分两种细胞。但是，dpscs和pdlscs的应用存在差异，比如dpscs更加适用于形成牙科骨组织的再生，pdlscs更适合于牙周膜组织损伤的修复，所以区分两种干细胞是非常必要的。但是目前还没有一种可以有效区分dpscs和pdlscs的方法和产品。有鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：本发明的第一个目的在于提供hs90a基因和/或hs90a蛋白作为鉴别牙髓干细胞和牙周膜干细胞的标志物的应用，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。本发明的第二个目的在于提供用于鉴别牙髓干细胞和牙周膜干细胞的试剂盒。本发明的第三个目的在于提供一种鉴别牙髓干细胞和牙周膜干细胞的方法。本发明提供了hs90a基因和/或hs90a蛋白作为鉴别牙髓干细胞和牙周膜干细胞的标志物的应用。进一步的，所述hs90a基因和/或hs90a蛋白在牙髓干细胞中显著高表达，在牙周膜干细胞中显著低表达。本发明还提供了用于鉴别牙髓干细胞和牙周膜干细胞的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测hs90a基因和/或hs90a蛋白的产品。进一步的，所述用于检测hs90a基因的产品包括用于扩增hs90a基因的引物。进一步的，所述用于扩增hs90a基因的引物具有seqidno.1和seqidno.2所示的核苷酸序列，或与seqidno.1和/或seqidno.2具有至少85%同一性的核苷酸序列；优选地，所述用于扩增hs90a基因的引物具有seqidno.3和seqidno.4所示的核苷酸序列，或与seqidno.3和/或seqidno.4具有至少85%同一性的核苷酸序列；优选地，所述用于扩增hs90a基因的引物具有seqidno.5和seqidno.6所示的核苷酸序列，或与seqidno.5和/或seqidno.6具有至少85%同一性的核苷酸序列；优选地，所述用于扩增hs90a基因的引物具有seqidno.7和seqidno.8所示的核苷酸序列，或与seqidno.7和/或seqidno.8具有至少85%同一性的核苷酸序列；优选地，所述用于扩增hs90a基因的引物具有seqidno.9和seqidno.10所示的核苷酸序列，或与seqidno.9和/或seqidno.10具有至少85%同一性的核苷酸序列；优选地，所述用于扩增hs90a基因的引物具有seqidno.11和seqidno.12所示的核苷酸序列，或与seqidno.11和/或seqidno.12具有至少85%同一性的核苷酸序列。进一步的，所述用于扩增hs90a基因的引物具有seqidno.1和seqidno.2所示的核苷酸序列；优选地，所述用于扩增hs90a基因的引物具有seqidno.3和seqidno.4所示的核苷酸序列；优选地，所述用于扩增hs90a基因的引物具有seqidno.5和seqidno.6所示的核苷酸序列；优选地，所述用于扩增hs90a基因的引物具有seqidno.7和seqidno.8所示的核苷酸序列；优选地，所述用于扩增hs90a基因的引物具有seqidno.9和seqidno.10所示的核苷酸序列；优选地，所述用于扩增hs90a基因的引物具有seqidno.11和seqidno.12所示的核苷酸序列。进一步的，所述试剂盒还包括内参基因的检测引物。进一步的，所述内参基因包括gapdh；优选地，所述内参基因的检测引物具有seqidno.13和seqidno.14所示的核苷酸序列，或与seqidno.13和/或seqidno.14具有至少85%同一性的核苷酸序列。此外，本发明还提供了一种鉴别牙髓干细胞和牙周膜干细胞的方法，以待测生物样品的dna为模板，利用上述的试剂盒进行检测，根据hs90a基因的相对表达水平，确定所述待测生物样品为牙髓干细胞或牙周膜干细胞；当所述hs90a基因的表达水平显著高时，所述待测生物样品为牙髓干细胞；当所述hs90a基因的表达水平显著低时，所述待测生物样品为牙周膜干细胞；优选地，所述检测包括荧光定量pcr检测。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明的发明人通过实验发现，hs90a基因和/或hs90a蛋白在牙髓干细胞和牙周膜干细胞中的表达存在差异，其在牙髓干细胞中显著高表达，在牙周膜干细胞中显著低表达，因此可以作为两种干细胞的特殊标志物用于细胞的区分，具有较高的灵敏度和特异性。基于此，本发明还提供了用于鉴别牙髓干细胞和牙周膜干细胞的试剂盒，包括用于检测hs90a基因和/或hs90a蛋白的产品，上述产品通过检测hs90a基因和/或蛋白的表达量，能够准确、有效地对牙髓干细胞和牙周膜干细胞进行鉴别。本发明提供的鉴别牙髓干细胞和牙周膜干细胞的方法，以待测生物样品的dna为模板，利用本发明提供的引物组进行检测，根据hs90a基因的相对表达水平，即可确定所述待测生物样品为牙髓干细胞或牙周膜干细胞。该方法快捷简便，且不需要昂贵复杂的仪器和操作，临床应用范围广，能够为牙髓干细胞和牙周膜干细胞的鉴别提供快速有效的手段，适于推广应用。附图说明为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本发明实施例1提供的二维凝胶蛋白质组学检测的蛋白质表达的丰度结果图；图2为本发明实施例1提供的对二维电泳的hs90a的统计灰度值的结果图；图3为本发明实施例2提供的用qpcr检测hs90a的mrna相对表达表达量的结果图；图4为本发明实施例3提供的3组引物用qpcr检测hs90a的mrna相对表达表达量的结果图；图5为本发明实施例3提供的引物1-6用qpcr检测时扩增曲线；图6a为本发明实施例3提供的引物1用qpcr检测时溶解曲线；图6b为本发明实施例3提供的引物2用qpcr检测时溶解曲线；图6c为本发明实施例3提供的引物3用qpcr检测时溶解曲线；图6d为本发明实施例3提供的引物4用qpcr检测时溶解曲线；图6e为本发明实施例3提供的引物5用qpcr检测时溶解曲线；图6f为本发明实施例3提供的引物6用qpcr检测时溶解曲线。具体实施方式除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。dpscs和pdlscs的应用存在差异，但二者的细胞形态不存在差异，且表面标志物特征都是阳性表达间充质标志物，不表达造血干细胞标志物，所以在形态学和表面特征上难以区分两种细胞。基于此，本发明提供了hs90a基因和/或hs90a蛋白作为鉴别牙髓干细胞和牙周膜干细胞的标志物的应用。本发明的发明人通过实验发现，hs90a基因和/或hs90a蛋白在牙髓干细胞和牙周膜干细胞中均有表达，但表达量存在差异，其在牙髓干细胞中显著高表达，在牙周膜干细胞中显著低表达，因此可以作为两种干细胞的特殊标志物用于细胞的区分，具有较高的灵敏度和特异性。需要说明的是，“和/或”用于表示所说明的情况的一者或两者均可能发生，例如a和/或b包括（a和b）和（a或b）。hs90a基因和/或hs90a蛋白作为鉴别牙髓干细胞和牙周膜干细胞的标志物的应用指的是，可以单独应用hs90a基因作为鉴别标志物，或者单独应用hs90a蛋白作为鉴别标志物，或者同时应用hs90a基因和hs90a蛋白作为鉴别标志物。上述三种选择均可特异性的实现牙髓干细胞和牙周膜干细胞的鉴别。在一些优选的实施方式中，所述hs90a基因和/或hs90a蛋白在牙髓干细胞中显著高表达，在牙周膜干细胞中显著低表达。优选地，其归一化的表达值计算方法为：δct=|cths90a基因-ct内参基因|，通过计算en=2^（-δct），再进一步计算基因的相对表达值=2^（-δδct）=enhs90a基因/en内参基因。基因水平2^-δct值大于等于0.1，或者相对于对照组所述基因的2^-δδct值大于1.5的为牙髓干细胞。因此，通过检测hs90a基因和/或hs90a蛋白在待测细胞样本中的表达水平，能够准确鉴别牙髓干细胞和牙周膜干细胞。根据本发明的第二个方面，提供了用于鉴别牙髓干细胞和牙周膜干细胞的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测hs90a基因和/或hs90a蛋白的产品。基于hs90a基因和/或hs90a蛋白在牙髓干细胞和牙周膜干细胞中的表达量存在差异，本发明还提供了用于鉴别牙髓干细胞和牙周膜干细胞的试剂盒，上述产品通过检测hs90a基因和/或蛋白的表达量，能够准确、有效地对牙髓干细胞和牙周膜干细胞进行鉴别。需要说明的是，在本发明中，可以使用任意合适的检测上述基因和/或蛋白的产品、方法，其都视为包含在本发明的保护范围之内。例如，聚合酶链式反应（pcr），如qpcr；逆转录聚合酶链式反应（rtpcr）；原位杂交（fish）；转录介导的扩增（tma）；连接酶链式反应（lcr）；链置换扩增（sda）和基于核酸序列的扩增（nasba）；微阵列；southern或northern印迹；高通量测序方法。作为优选，在本发明的一些实施方式中，所述用于检测hs90a基因的产品包括用于扩增hs90a基因的引物。作为进一步优选地，所述用于扩增hs90a基因的引物具有seqidno.1和seqidno.2所示的核苷酸序列，或与seqidno.1和/或seqidno.2具有至少85%同一性的核苷酸序列；或者，所述用于扩增hs90a基因的引物具有seqidno.3和seqidno.4所示的核苷酸序列；或者，所述用于扩增hs90a基因的引物具有seqidno.5和seqidno.6所示的核苷酸序列；或者，所述用于扩增hs90a基因的引物具有seqidno.7和seqidno.8所示的核苷酸序列；或者，所述用于扩增hs90a基因的引物具有seqidno.9和seqidno.10所示的核苷酸序列；或者，所述用于扩增hs90a基因的引物具有seqidno.11和seqidno.12所示的核苷酸序列。本发明中的术语“同一性”指的是序列之间的相似性。“同一性”包括与本发明所述的seqidno.1至seqidno.12所示的核苷酸序列具有至少85%（例如可以为，但不限于85%、88%、90%、92%、95%、99%或者更高）同一性、并且具有相同功能的核苷酸序列。“与seqidno.1和/或seqidno.2具有至少85%同一性的核苷酸序列”指的是例如用于扩增hs90a基因的引物，可以为seqidno.1和seqidno.2、或者为与seqidno.1具有至少85%同一性的核苷酸序列和seqidno.2、或者为与seqidno.2具有至少85%同一性的核苷酸序列和seqidno.1、或者为与seqidno.1具有至少85%同一性的核苷酸序列和与seqidno.2具有至少85%同一性的核苷酸序列。“与seqidno.3和/或seqidno.4具有至少85%同一性的核苷酸序列”、“与seqidno.5和/或seqidno.6具有至少85%同一性的核苷酸序列”、“与seqidno.7和/或seqidno.8具有至少85%同一性的核苷酸序列”、“与seqidno.9和/或seqidno.10具有至少85%同一性的核苷酸序列”以及“与seqidno.11和/或seqidno.12具有至少85%同一性的核苷酸序列”的释义同上，在此不再赘述。当选择seqidno.1和seqidno.2所示的核苷酸序列作为本发明提供的用于扩增hs90a基因的引物时，具有更强的特异性及更高的灵敏度。本发明对各引物对之间的配比没有要求，例如可以为但不限于1:1、1:1.2或1:1.5，可以根据实际使用情况进行调整。在一些优选的实施方式中，所述试剂盒还包括内参基因的检测引物。通过对内参基因进行同步检测，能够进一步保证检测结果的有效率。优选地，所述内参基因包括gapdh。更优选地，所述内参基因的检测引物具有seqidno.13和seqidno.14所示的核苷酸序列，或与seqidno.13和/或seqidno.14具有至少85%同一性的核苷酸序列。当选择seqidno.13和seqidno.14所示的核苷酸序列作为本发明提供的用于扩增gapdh基因的引物时，具有更强的特异性及更高的灵敏度。此外，本发明提供的试剂盒中还可以包括pcr反应液和试剂盒说明书。所述pcr反应液包括dntp、mg2+、taq酶、荧光染料及buffer缓冲液等常规试剂。根据本发明的第三个方面，还提供了一种鉴别牙髓干细胞和牙周膜干细胞的方法，以待测生物样品的dna为模板，利用上述的试剂盒进行检测，根据hs90a基因的相对表达水平，确定所述待测生物样品为牙髓干细胞或牙周膜干细胞；当所述hs90a基因的表达水平显著高时，所述待测生物样品为牙髓干细胞；当所述hs90a基因的表达水平显著低时，所述待测生物样品为牙周膜干细胞。本发明提供的鉴别牙髓干细胞和牙周膜干细胞的方法，以待测生物样品的dna为模板，利用本发明提供的引物组进行检测，根据hs90a基因的相对表达水平，即可确定所述待测生物样品为牙髓干细胞或牙周膜干细胞。该方法快捷简便，且不需要昂贵复杂的仪器和操作，临床应用范围广，能够为牙髓干细胞和牙周膜干细胞的鉴别提供快速有效的手段，适于推广应用。本发明中待测生物样品例如可以为，但不限于细胞。在一些具体的实施方式中，鉴别牙髓干细胞和牙周膜干细胞的方法包括如下步骤：（1）细胞培养后提取总rna，随后反转录成cdna；细胞经过去掉上清，洗涤后，并依次加入氯仿、异丙醇和乙醇，在4℃12000rpm下离心获得rna沉淀。加入随机引物和碱基后，在37℃反转录15min，然后85℃反应5s终止后获得cdna。（2）荧光定量pcr扩增：使用针对hs90a的引物检测hs90amrna的表达水平，采用的内参为gapdh基因，针对hs90a的引物分别是seqidno：1-2、或者seqidno：3-4、或者seqidno：5-6、或者seqidno：7-8、或者seqidno：9-10、或者seqidno：11-12，针对gapdh的引物为seqidno：13-14；以gapdh为内参作为校正，计算2^-△△ct为基因相对表达量。（3）结果判断：表达水平显著高的为牙髓干细胞，表达水平显著低的为牙周膜干细胞。下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。本发明实施例中用到的主要试剂信息如下：名称品牌产地dmem培养基bi以色列胎牛血清bi以色列0.25%胰酶（含edta）bi以色列青霉素-链霉素bi以色列pbsbi以色列8mureaxilongscientific中国teabthermofisherscientific美国dttmacklin中国iaamacklin中国trypsinsigma美国trizolcwbio中国异丙醇tgreag中国三氯甲烷tgreag中国无水乙醇tgreag中国depc水leagene中国rt-pcrkitcwbio中国ultrasybrmixturecwbio中国实施例1牙髓干细胞和牙周膜干细胞标志物的筛选1、本实施例采用了分别来自3组不同个体的牙髓干细胞和样品和对应的牙周膜干细胞样品。细胞全蛋白被分散在水化液中，然后第一相在immobilinedrystripgels（24cm，ph3-11）胶条中进行蛋白质的初次分离在ipg聚焦系统中。并在10%的sds-page中进行第二相的蛋白质重新分布。蛋白质斑点被切下，并在dtt和iaa中分别还原化和烷基化，然后在胰酶中被消化成肽段。肽段被重新溶解于分散剂中，然后在maldi-tof-ms中被检测并在mascot中被鉴定。2、实验结果在二维电泳结果经过考马斯亮蓝染色后，可以从牙髓干细胞样品组和牙周膜干细胞样品组的结果进行斑点检测。灰度值的统计结果显示，牙髓干细胞组的hs90a蛋白丰度更高，牙周膜干细胞组hs90a丰度低（如图1和图2所示）。实施例2牙髓干细胞和牙周膜干细胞鉴定标志物的鉴定1、牙髓干细胞和牙周膜干细胞的总rna提取本实施例采用了分别来自5组不同个体的牙髓干细胞和样品和对应的牙周膜干细胞样品。1）倒去培养皿/瓶中的培养基，pbs洗2-3次，加入trizol溶液，转移到1.5ml离心管中，再在培养皿加入0.5ml的trizol冲洗培养皿收获剩下未完全吹散下来的细胞。2）直接加入200μl氯仿，漩涡震荡15s混匀后室温放置2-3min。3）4℃，12000rpm离心20min。4）离心后，混合物分成三相，吸取上层水相约400μl至另一离心管中。5）加入500μl异丙醇混匀，室温放置10min。6）4℃，12000rpm离心20min，rna形成白色小团沉于管底，弃上清。7）加入0.5-1.0ml无水乙醇，漂洗，倒掉，2次。8）在室温环境，无菌操作台中，吹干5-10min9）用20μldepc处理水，吹匀，并测量rna浓度和纯度。2、荧光定量pcr：在200µlpcr管配制反应体系：引物混合液1µl，mastermix混合物18µl，模板cdna1µl，加盖密封，将上述反应放荧光定量pcr仪中，第一步预变性95℃反应10min；第二步变性95℃反应10s；第三步退火60℃反应30s；第四步延伸72℃反32s；第二步到第四步循环40次；进入溶解程序，依次进行95℃反应15s；60℃反应1min；95℃反应15s；60℃反应15s；所述引物混合液含有上述的4条特异性引物（seqidno.1、2、13、14），其中，所有引物的浓度为2pmol/µl。所述反应液主要是含有1×ultrasybrmixture混合液，用gapdh作为参考基因组（δct）将ct值标准化，并使用建立的基于效率的δδct方法将每个样品与进行比较。为了评估表达强度，将归一化的ct值（δct）转换为归一化的表达值，根据下式：en=2^（-δct），计算2^（-δδct），作图分析。3、实例结果牙髓干细胞样品组的平均值和牙周膜干细胞样品组的平均值进行比较。mrna表达测试结果表明，牙髓干细胞组hs90a表达高，牙周膜干细胞组hs90a表达低（如图3所示）。实施例3本实施例所采用的方法与实施例2并无不同，唯一的区别是分别应用引物1-6对样品进行hs90a基因的检测。所述引物混合液分别含有seqidno：13-14所示的内参基因的引物以及seqidno：1-2所示的引物（引物1）、或者seqidno：3-4（引物2）所示的引物、或者seqidno：5-6（引物3）所示的引物、或者seqidno：7-8（引物4）、或者seqidno：9-10（引物5）所示的引物、或者seqidno：11-12（引物6）所示的引物，其中，所有引物的浓度为2pmol/µl。结果：引物1-6都可以正常扩增，但是扩增的效率不同，先达到平台期的时间各不相同（如图5所示）。溶解曲线可以看出，不同引物在溶解时表现了不同的溶解状态，其中引物1表现最好，呈现单一尖峰（如图6a-6f所示）。其中，应用引物3-5进行qpcr检测hs90a的mrna相对表达表达量的结果如图4所示。最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。sequencelisting<110>康妍葆(北京)干细胞科技有限公司<120>hs90a作为鉴别牙髓干细胞和牙周膜干细胞的标志物的应用、鉴别二者的试剂盒及方法<160>14<170>patentinversion3.5<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1gctccaagggttgacatggt20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2gtaactcatggacgcagggg20<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<400>3tacatcatgaccgtgggctg20<210>4<211>17<212>dna<213>人工序列<400>4ccctgcaggttgtcggg17<210>5<211>19<212>dna<213>人工序列<400>5tgacccgcattggtcacat19<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列<400>6gggtcccaccatttcaagtt20<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列<400>7cccgcattggtcacatacag20<210>8<211>21<212>dna<213>人工序列<400>8ttggggtcccaccatttcaag21<210>9<211>19<212>dna<213>人工序列<400>9atcccttgacccgcattgg19<210>10<211>21<212>dna<213>人工序列<400>10ggggtcccaccatttcaagtt21<210>11<211>20<212>dna<213>人工序列<400>11gtcaagccggatgcctaagt20<210>12<211>20<212>dna<213>人工序列<400>12gtcaacccttggagcagcta20<210>13<211>18<212>dna<213>人工序列<400>13gagcgagatccctccaaa18<210>14<211>20<212>dna<213>人工序列<400>14atgacgaacatgggggcatc20当前第1页1 2 3 

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