特发性肺纤维化疾病诊断标志物CCT6A及其在制备诊断或预后工具中的应用的制作方法

本发明属于医学诊断标志物及工具技术领域，具体涉及一种特发性肺纤维化疾病诊断标志物cct6a及其在制备诊断或预后工具中的应用。

背景技术：

肺纤维化是一种慢性进行性致死疾病，其病理学特点为肺实质破坏、肺泡上皮细胞表型显著变化、细胞外基质的沉积以及成纤维细胞异常增殖与积累。现在已知200多种原因可以引起肺纤维化，如遗传性疾病、自身免疫性疾病、暴露于环境中有毒物质、药物和放射等。越来越多的证据表明，在肺纤维化的发生发展过程中，不仅广泛存在着个体间异质性(inter-heterogeneity)和个体内组织细胞的异质性(intra-heterogeneity)，而且还广泛存在着个体在细胞和分子等各种层次的动态变化。利用多组学的技术能够更好地全面理解复杂疾病的机制、筛选疾病标志物、研究药物作用靶点、筛选特殊功能蛋白质等。据统计，全球每年约新增肺纤维化患者500万人左右，预后较差，诊断后中位生存期为2-3年。肺纤维化的病因不明确、早期诊断易混淆等特点，在临床上用于诊断肺纤维化的手段往往缺乏特异性，迫切需要更高效、稳定的手段来预警或判断肺纤维化。因此开发一种可用于准确诊断特发性肺纤维化的方法是亟待解决的问题。

在真核生物中，cct6a编码的蛋白质是分子伴侣蛋白，它是包含tcp1复合物(cct)(也称为tcp1环复合物(tric)的伴侣蛋白的成员，包含两个相同的堆叠环，每个环包含八个不同的同源蛋白(1-8或α-θ)，该复合物以atp依赖性方式折叠多种蛋白质，包括肌动蛋白和微管蛋白。据报道，5％-10％新合成的胞质蛋白经cct折叠，表明它在细胞骨架组织和细胞周期中的关键调控作用。研究已经表明，cct6a在多种人类肿瘤细胞系中的表达水平显著升高，可调控多种细胞生存和凋亡相关基因，如转导和转录激活因子3(stat3)，lox-1，vhl和p53等。此外，cct6a已被确定为内源性细胞外信号调节激酶(erk)1/2信号复合物的特定成分，该复合物具有丝裂原激活的蛋白激酶(mapk)/erk的磷酸化位点。

技术实现要素：

本发明的目的是提供了一种特发性肺纤维化疾病诊断标志物cct6a及其在制备诊断或预后工具中的应用，本发明通过实验研究发现cct6a在特发性肺纤维化患者的血液中的含量比正常人高，且人特发性肺纤维化患者肺切片的免疫组化结果表明，cct6a在成纤维细胞中表达水平上升。成纤维细胞在ecm的合成、异常沉积和重塑中起到重要作用，直接或间接参与了纤维化的形成，cct6a在特发性肺纤维化患者中的表达升高，表明其可能在肺纤维化的形成过程中发挥着重要的调控作用，因此可以开发诊断特发性肺纤维化疾病的工具。

本发明为实现上述目的采用如下技术方案，特发性肺纤维化疾病诊断标志物cct6a，其特征在于该诊断标志物为cct6a基因表达产物，cct6a基因的编码序列包括以下任意一种dna分子：

(1)序列表中seqidno.1所示的dna序列；

(2)在严格条件下与(1)限定的dna序列杂交且编码相同功能蛋白质的dna序列；

(3)与(1)或(2)限定的dna序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的dna序列。

优选的，所述cct6a基因表达产物包括cct6a蛋白、cct6a蛋白的功能等同物以及cct6a蛋白的部分肽，其中cct6a蛋白的部分肽含有与特发性肺纤维化相关的功能域；cct6a蛋白的功能等同物包括cct6a蛋白保守性变异蛋白质，或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与cct6a的dna杂交的dna所编码的蛋白质。

优选的，所述cct6a蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：

(1)由序列表中seqidno.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)将seqidno.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与seqidno.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由seqidno.2所示的氨基酸序列衍生的蛋白质，取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个；

(3)与seqidno.2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列构成的多肽，又称为序列同一性的多肽。

优选的，所述cct6a基因及其表达产物的来源包括但不限于血液、组织液、尿液、唾液、肺组织、支气管肺泡灌洗样本或呼出气冷凝液或脊髓液。

本发明所述的特发性肺纤维化疾病诊断标志物cct6a在制备诊断或预后工具中的应用，其特征在于：该诊断或预后工具包括通过rt-pcr、实时定量pcr、免疫组织化学、原位杂交、芯片、高通量测序平台或lc-ms/ms质谱检测cct6a基因的表达水平以诊断特发性肺纤维化疾病的产品，在ipf患者血清中发现了水平较高的cct6a，且在ipf患者肺成纤维细胞中发现了高表达的cct6a，说明cct6a可能在肺纤维化过程中调控成纤维细胞的活动，进一步调控了肺纤维化的过程。

优选的，通过rt-pcr诊断特发性肺纤维化的产品至少包括一对特异扩增cct6a基因的引物；通过实时定量pcr诊断特发性肺纤维化的产品至少包括一对特异扩增cct6a基因的引物；通过免疫检测诊断特发性肺纤维化的产品包括与cct6a基因表达产物特异性结合的抗体；通过原位杂交诊断特发性肺纤维化的产品包括与cct6a基因的核酸序列杂交的探针；通过芯片诊断特发性肺纤维化的产品包括蛋白芯片和基因芯片，其中蛋白芯片包括与cct6a蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与cct6a基因的核酸序列杂交的探针。

优选的，通过实时定量pcr诊断特发性肺纤维化的产品至少包括一对特异扩增cct6a基因的引物，该引物序列中正向引物序列如seqidno.3～seqidno.7所示，对应的反向引物序列如seqidno.9～seqidno.13所示。

优选的，所述工具通过检测样本中cct6a基因的表达来诊断特发性肺纤维化，该工具包括芯片、试剂盒、试纸或高通量测序平台。

优选的，所述芯片包括基因芯片或蛋白质芯片，所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，该寡核苷酸探针包括用于检测cct6a基因转录水平的针对cct6a基因的寡核苷酸探针，所述基因芯片用于检测包括cct6a基因在内的多个基因的表达水平；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的cct6a蛋白的特异性抗体，该蛋白质芯片可用于检测包括cct6a蛋白在内的多个蛋白质的表达水平；所述试剂盒包括基因检测试剂盒、酶联免疫吸附测定试剂盒或蛋白免疫检测试剂盒，所述基因检测试剂盒包括用于检测cct6a基因转录水平的试剂，所述酶联免疫吸附测定试剂盒包括结合抗体和检测抗体的试剂，所述蛋白免疫检测试剂盒包括cct6a蛋白的特异性抗体；所述试纸包括使用rt-pcr、实时定量pcr、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测cct6a基因表达水平过程中所需的试剂；所述高通量测序平台包括用于检测cct6a基因转录水平的试纸，所述试纸包括试纸载体和固定在试纸载体上的寡核苷酸，该寡核苷酸能够检测cct6a基因的转录水平，与cct6a基因的核酸序列杂交的探针为dna、rna、dna-rna嵌合体、pna或其它衍生物，该探针能够完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合。

优选的，所述cct6a蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体或多克隆抗体，所述cct6a蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰。

本发明与现有技术相比具有以下有益效果：本发明发现cct6a编码的蛋白质是分子伴侣蛋白，在细胞骨架组织和细胞周期中的关键调控中具有关键作用，本发明通过检测cct6a基因的表达及其表达产物进而实现临床诊断。本研究在ipf患者血清中发现了水平较高的cct6a，且在ipf患者肺成纤维细胞中发现了高表达的cct6a，说明cct6a可能在肺纤维化过程中调控成纤维细胞的活动，进一步调控了肺纤维化的过程。本发明的研究成果为临床上进行特发性肺纤维化的早期诊断提供了一种无创的方法，适于进一步临床推广应用。

附图说明

图1是利用lc-ms/ms质谱检测特发性肺纤维化和正常人相比cct6a蛋白的差异表达；

图2是利用elisa检测特发性肺纤维化和正常人相比cct6a蛋白的差异表达；

图3是利用qpcr检测特发性肺纤维化和正常人相比cct6a基因的差异表达；

图4是利用免疫组化检测特发性肺纤维化和正常人相比cct6a蛋白的差异表达。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。

本发明实验研究发现cct6a在特发性肺纤维化患者的血液中的含量比正常人高，且人特发性肺纤维化患者肺切片的免疫组化结果表明，cct6a在成纤维细胞中表达水平上升。成纤维细胞在ecm的合成、异常沉积和重塑中起到重要作用，直接或间接参与了纤维化的形成，cct6a在特发性肺纤维化患者中的表达升高，表明其可能在肺纤维化的形成过程中发挥着重要的调控作用，因此可以开发诊断特发性肺纤维化疾病的工具。

根据本发明的一个方面，本发明提供了检测cct6a基因表达的产品在制备诊断特发性肺纤维化的工具中的应用。

进一步，上面所提到的检测产品包括：通过rt-pcr、实时定量pcr、免疫组织化学、原位杂交、芯片、elisa或高通量测序平台、lc-ms/ms质谱检测cct6a蛋白的表达水平以诊断特发性肺纤维化的产品。

进一步，所述用rt-pcr诊断特发性肺纤维化的产品至少包括一对特异扩增cct6a基因的引物；所述用实时定量pcr诊断特发性肺纤维化的产品至少包括一对特异扩增cct6a基因的引物；所述用免疫组化诊断特发性肺纤维化的产品包括：与cct6a蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断特发性肺纤维化的产品包括：与cct6a基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断特发性肺纤维化的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与cct6a蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与cct6a基因的核酸序列杂交的探针。

在本发明的具体实施方案中，所述用实时定量pcr诊断特发性肺纤维化的产品至少包括一对特异扩增cct6a基因的引物的序列如seqidno.3～seqidno.7和seqidno.9～seqidno.13所示。

本发明所述工具包括芯片、试剂盒、试纸或高通量测序平台。其中，高通量测序平台是一种特殊的诊断工具，检测cct6a基因表达的产品可以应用于该平台实现对cct6a基因的表达情况的检测。随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知cct6a基因的异常与特发性肺纤维化相关也属于cct6a基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种诊断特发性肺纤维化的工具，所述产品包括芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序/质谱平台。

其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测cct6a基因转录水平的针对cct6a基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的cct6a蛋白的特异性抗体；所述基因芯片可用于检测包括cct6a基因在内的多个基因(例如，与特发性肺纤维化相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括cct6a蛋白在内的多个蛋白质(例如与特发性肺纤维化相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与特发性肺纤维化的标志物同时检测，可大大提高特发性肺纤维化诊断的准确率。

其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒、酶联免疫吸附测定试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测cct6a基因转录水平的试剂；所述酶联免疫吸附测定试剂盒包括结合抗体和检测抗体的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括cct6a蛋白的特异性抗体。进一步，所述试剂包括使用rt-pcr、实时定量pcr、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测cct6a基因表达水平过程中所需的试剂。优选地，所述试剂包括针对cct6a基因的引物和/或探针。根据cct6a基因的核苷酸序列信息容易设计出可以用于检测cct6a基因表达水平的引物和探针。

进一步，所述高通量测序平台包括检测cct6a基因表达水平的试剂。所述试纸包括试纸载体和固定在试纸载体上的寡核苷酸，所述寡核苷酸能够检测cct6a基因的转录水平。与cct6a基因的核酸序列杂交的探针可以是dna、rna、dna-rna嵌合体、pna或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。

进一步，所述cct6a蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述cct6a蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰。只要所述片段能够保留与cct6a蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。

在本发明的具体实施方案中，所述针对cct6a基因的引物序列如seqidno.3～seqidno.14所示。

用于诊断特发性肺纤维化的cct6a基因及其表达产物的来源包括但不限于血液、组织液、尿液、唾液、肺组织、支气管肺泡灌洗样本或呼出气冷凝液、脊髓液等体液。在本发明的具体实施方案中，用于诊断特发性肺纤维化的cct6a基因及其表达产物的来源是血液。在发明的具体实施方案中，血液是取自特发性肺纤维化患者和正常人的外周血液。

本发明的cct6a基因(nm_001009186.2)的具体序列可在国际公共核酸序列数据库genebank中查询到。

本发明的cct6a基因的编码序列包括以下任意一种dna分子：

(1)序列表中seqidno.1所示的dna序列；

(2)在严格条件下与1)限定的dna序列杂交且编码相同功能蛋白质的dna序列；

(3)与(1)或(2)限定的dna序列具有70％、优选的，90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的dna分子。

在本发明的具体实施方案中，所述cct6a基因的编码序列是seqidno.1所示的dna序列。

在本发明的上下文中，cct6a基因表达产物包括cct6a蛋白以及cct6a蛋白的部分肽。所述cct6a蛋白的部分肽含有与特发性肺纤维化相关的功能域。

cct6a蛋白包括cct6a蛋白以及cct6a蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括cct6a蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与cct6a的dna杂交的dna所编码的蛋白质。

本发明所述cct6a蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：

(1)由序列表中seqidno.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

(2)将seqidno.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与seqidno.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由seqidno.2所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个。

(3)与seqidno.2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(又称为序列同一性)，更优选地，与seqidno.2所示的氨基酸序列至少约90％至95％的同源性，常为96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列构成的多肽。

在本发明的具体实施方案中，所述cct6a蛋白是具有seqidno.2所示的氨基酸序列的蛋白质。

通常，已知的是一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。

本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。

通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是cct6a蛋白的融合蛋白。对于与cct6a蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留cct6a蛋白的生物学活性即可。

本发明的cct6a蛋白也包括对seqidno.2所示的氨基酸序列的非保守修饰，只要经过修饰的蛋白质仍然能够保留cct6a蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。

在本发明的上下文中，诊断特发性肺纤维化既包括待检测者是否已经患有特发性肺纤维化、也包括判断待检测者是否存在患有特发性肺纤维化的风险，还包括预测特发性肺纤维化患者的预后。

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

利用质谱筛选特发性肺纤维化患者和正常人中差异表达的基因的蛋白组学分析

1、临床研究对象：

选取特发性肺纤维化患者30例，其中男性17例，女性13例，年龄范围40-83岁，诊断标准均符合ats年修订的《特发性肺纤维化诊疗规范》。

排除标准：(1)合并其它肺部疾病者，如支气管哮喘、肺间质纤维化、肺癌等；(2)有其它部位感染者；(3)伴有严重心脑血管疾病、糖尿病、血液系统疾病、恶性肿瘤、脏器功能衰竭、肝炎者；(4)患免疫系统疾病或者近期使用过免疫抑制剂者。

正常对照：选取体检的健康人30人，其中男性18人，女性12人，年龄范围52-76。

入选标准：无慢性咳嗽、咳痰、喘息等病史；近期无上呼吸道感染、肺部感染史；无全身其他部位感染者；无其他肺部疾病者；近期未使用免疫抑制剂或者无全身免疫系统疾病者；无器官功能衰竭或者严重心脑血管疾病、肿瘤者；无过敏性疾病者。入选对象行肺功能检查均排除并与特发性肺纤维化组对比，在性别、年龄上差异均无统计学意义具有可比性。

所有研究对象均签署了知情同意书。

2、样本采集

所有研究对象于清晨空腹状态下，抽取外周静脉血10ml，edta抗凝。

研究对象：按照实施例1的方法选择特发性肺纤维化患者30例，正常人30例。

3、血液总肽段提取，质谱检测，生物信息学分析，筛选出差异蛋白。基于前期高通量测序的结果，根据pvalue的大小，我们选择cct6a基因(其表达在特发性肺纤维化患者中上调)。

实施例2

利用qpcr验证特发性肺纤维化患者和正常人中基因mrna的表达差异

1、研究对象：

同实例1。

2、血液总rna提取

使用qiagen血液rna提取试剂盒进行血液总rna的提取：

(1)取全血250μl(或0.25g)至rnase-free过滤柱中，13000rpm离心2分钟，收集底液，加入0.75ml裂解液rls。

(2)将匀浆样品剧烈震荡混匀，在15-30℃条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解。

(3)可选步骤：4℃的条件下12000rpm离心10分钟，小心取上清转入一个新的无rna酶的离心管中。

(4)每1mlrls加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖，剧烈振荡15秒并将其在室温下孵育3分钟。

(5)于4℃12000rpm离心10分钟，样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，rna存在于水相中。水相层的容量大约为所加rls体积的60％，把水相转移到新管中，进行下一步操作。

(6)加入1倍体积70％乙醇，颠倒混匀(此时可能会出现沉淀)，得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱ra中(吸附柱套在收集管内)。

(7)10000rpm离心45秒，弃掉废液，将吸附柱重新套回收集管。

(8)加入500μl去蛋白液re，12000rpm离心45秒，弃掉废液。

(9)加入700μl漂洗液rw，12000rpm离心60秒，弃掉废液。

(10)加入500μl漂洗液rw，12000rpm离心60秒，弃掉废液。

(11)将吸附柱ra放回空收集管中，12000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

(12)取出吸附柱ra，放入一个无rna酶的离心管中，根据预期rna产量在吸附膜中间部位加50-80μl无rna酶的水，室温放置2分钟，12000rpm离心1分钟，收集洗脱液。

3、rna样品的浓度及纯度测定

利用nanodrop2000对所提rna的浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测rna完整性。

4、逆转录合成mrnacdna

用逆转录缓冲液对1μg总rna进行逆转录合成cdna。采用25μl反应体系，每个样品取1μg总rna作为模板rna，在pcr管中分别加入以下组分：depc水，5×逆转录缓冲液，10mmol/ldntp，0.1mmol/ldtt，30μmmol/loligodt，200u/μlm-mlv，模板rna。42℃孵育1h，72℃10min，短暂离心。

5、qpcr

(1)引物设计

根据genbank中cct6a基因和β-actin基因的编码序列设计qpcr扩增引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：

cct6a基因：

正向引物为5'-gtggcgattcagataaagg-3'；

反向引物为5'-aatgtgacagaacgagggt-3'。

β-actin基因：

正向引物为5'-gtcaccaactgggacgacat-3'；

反向引物为5'-tagcaacgtacatggctggg-3'。

(2)扩增

反应体系：25μl反应体系，每个样本设置3个平行管。配制以下反应体系：sybrgreen聚合酶链式反应体系12.5μl，正向引物(5μm)1μl，反向引物(5μm)1μl，模板cdna2.0μl，无酶水8.5μl；各项操作均于冰上进行。

扩增程序：95℃5min，(95℃5s，60℃60s)*40个循环。以sybrgreen作为荧光标记物，在lightcycler荧光实时定量pcr仪上进行pcr反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，δδct法进行相对定量。

6、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用spss13.0统计软件来进行统计分析的，不同组之间的差异采用t检验，认为当p<0.05时具有统计学意义。

实施例3

elisa验证cct6a在特发性肺纤维化患者的表达

1、研究对象：

同实例1。

2、包被捕获抗体：

用缓冲液将抗体稀释至1-10ug/ml。在反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次。

3、加样洗涤：

加一定稀释的待检样品50ul于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。

4、加酶标抗体：

于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)50ul。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。

5、加底物液显色：

于各反应孔中加入临时配制的tmb底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。

6、终止反应：

于各反应孔中加入2m硫酸0.05ml。

7、od值测定：

在多功能酶标仪上，于450nm，以空白对照孔调零后测各孔od值，以对比各样品中cct6a表达水平。

实施例4

免疫组化分析cct6a在特发性肺纤维化患者肺组织中的表达

(1)将切片放入烘箱中，温度设为60℃，烘片1小时。

(2)脱蜡水化：二甲苯ⅰ，10分钟→二甲苯ⅱ，10分钟→无水乙醇ⅰ，5分钟→无水乙醇ⅱ，5分钟→体积分数95％酒精，5分钟→体积分数90％酒精，5分钟→体积分数80％酒精，5分钟→体积分数70％酒精，5分钟→蒸馏水，5分钟。

(3)用3wt％triton-100室温孵育5分钟，pbs冲洗3次，每次2分钟。

(4)滴加内源性过氧化物酶封闭液，室温孵育10分钟，pbs清晰3次，每次2分钟。

(5)将切片浸入柠檬酸盐缓冲液，然后放入微波炉加热至95℃并保持温度10分钟进行抗原修复，待室温取出切片，pbs清洗3次，每次5分钟。

(6)滴加免疫染色封闭液，37℃孵育20分钟。

(7)滴加适当浓度的一抗工作液37℃孵育2小时或4℃过夜孵育。

(8)pbs清洗三次，每次3分钟。

(9)添加二抗工作液，37℃孵育30分钟。

(10)pbs清洗三次，每次3分钟。

(11)加入辣根过氧化物酶标记的工作液，37℃孵育20分钟。

(12)pbs清洗三次，每次3分钟。

(13)添加dab显色液，37℃显色5分钟或室温显色10分钟，蒸馏水终止显色。

(14)苏木素复染，自来水终止染色。

(15)脱水透明：与步骤(2)顺序相反，用中性树脂封片。

(16)显微镜下观察染色情况，选取视野拍照并分析。

结果如图1显示，与正常人相比，特发性肺纤维化患者血液中cct6a蛋白的表达水平高于正常人(图1)；图2的elisa结果进一步显示特发性肺纤维化患者血液中cct6a基因的表达水平显著升高，差异具有统计学意义(p<0.05)，结果同蛋白质组学实验；图3显示特发性肺纤维化患者肺组织中cct6a基因的mrna水平显著升高；免疫组化结果表明在特发性肺纤维化患者肺成纤维细胞中表达显著提高(图4)。

以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。

序列表

<110>河南师范大学

<120>特发性肺纤维化疾病诊断标志物cct6a及其在制备诊断或预后工具中的应用

<130>2020

<160>14

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>2449

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

agaagacccggatagttcctcccggccacgccgcgccggctctgggcactcagcatcgtt60

tccttttcctccgctggagcagctatggcggcggtgaagaccctgaaccccaaggccgag120

gtggcccgagcgcaggcggcgctggcggtcaacatcagcgcagcgcggggtctgcaggac180

gtgctaaggaccaacctggggcccaagggcaccatgaagatgctcgtttctggcgctgga240

gacatcaaacttactaaagacggcaatgtgctgcttcacgaaatgggccttcatcctaga300

ataatcactgaaggatttgaagctgcaaaggaaaaggcccttcagtttttggaagaagtc360

aaagtaagcagagagatggacagggaaacacttatagatgtggccagaacatctcttcgt420

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