一种提高新霉素产量的生产方法与流程

2021-02-02 18:02:17|

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本发明涉及一种提高新霉素产量的生产方法，属于微生物发酵技术领域。

背景技术：

新霉素是由弗氏链霉菌(streptomycesfradiae)发酵产生的一种氨基糖苷类抗生素，其主要成分有新霉素a、新霉素b、新霉素c三种。其中以新霉素b为主要有效成分，新霉素c为次要成分，新霉素a为杂质。

新霉素抗菌谱广，对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和结核杆菌均有良好的抑制作用，是重要的抗感染药物。作为一种常用兽药，新霉素用于抑制家畜、家禽的细菌性胃肠道感染己有30余年的历史，新霉素作为饲料抗生素添加剂使用，用于预防畜禽、尤其是幼龄鸡细菌感染引起的早期损失和肠炎，提高饲料利用率，促进畜禽生长。在兽医临床上，新霉素是治疗畜禽细菌性肠炎的首选药物之一，其功效特佳；另外，新霉素还被普遍用于治疗乳腺炎、角膜炎、结膜炎、耳炎、皮炎、外伤感染、足腐烂等疾病。

目前对微生物发酵法生新霉素的研究主要是菌种选育和发酵条件优化两个方面，同时提取方面也进行了大量的研究工作。如中国专利文献cn105400852a(申请号201510991909.2)公开了采用氨基酸发酵菌渣替代发酵原料生产新霉素的方法。中国专利文献cn107557413a(申请号201710959459.8)公开了在发酵培养的过程中采用流加或一次性顿补的方式加入酵母粉和/或半胱氨酸和/或s-腺苷-l-蛋氨酸和/或硫酸铵和/或硫酸亚铁和/或硫酸镁和/或硫酸锰的方法，放罐后发酵液中各有关物质的含量分别为新霉素b≥80％，新霉素c≤15％。目前可见报道的最高水平，为中国专利文献cn106086119a(申请号201610719923.1)公开的发酵单位31060u/ml，发酵周期控制在230h以内。但是上述现有技术都存在新霉素产量有待进一步提高或发酵周期较长的问题。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，尤其针对现有技术的发酵周期长，中间补料控制不严谨的现状，本发明提供了一种提高新霉素产量的生产方法。

本发明的技术方案如下：

一种提高新霉素产量的生产方法，包括斜面培养、种子培养和发酵培养，采用弗氏链霉菌(streptomycesfradiae)在发酵培养基中进行发酵培养15～25h，然后每6-8h补加一次料液，每次补加料液的量为发酵液体积的1.5％～2.0％，补加的料液为玉米淀粉、米粉、玉米蛋白粉、硫酸铵和淀粉酶的混合溶液，发酵培养结束后得含有新霉素的发酵液。

根据本发明优选的，所述补加的料液组分如下，均为质量百分比：玉米淀粉10.00～15.00％，米粉25.00～35.00％，玉米蛋白粉7.00～9.00％，硫酸铵0.20～0.40％，淀粉酶0.10～0.20％，溶剂水；优选的，所述淀粉酶的酶活为3000-4000u/g。

进一步优选的，所述补加的料液组分如下，均为质量百分比：包括玉米淀粉15.00％，米粉30.00％，玉米蛋白粉8.00％，硫酸铵0.20％，淀粉酶0.10％，溶剂水。

根据本发明优选的，所述发酵培养基的组分如下，均为质量百分比：葡萄糖1.50～3.00％、米粉7.00～9.00％、花生饼粉1.50～3.00％、酵母粉1.00～2.00％、蛋白胨1.00～2.00％、硫酸铵0.20～3.00％、玉米浆0.03～0.50％、淀粉酶0.30～0.60％、玉米蛋白粉0.50～1.50％、氯化钠0.50～0.80％、碳酸钙0.50～1.00％、磷酸二氢钾0.05-0.10％、豆油0.20～0.50％、磷酸氢二钠0.01～0.10％，余量水，ph自然；优选的，所述淀粉酶的酶活为3000-4000u/g。

根据本发明优选的，所述提高新霉素产量的生产方法，具体包括如下步骤：

(1)斜面培养：取弗氏链霉菌(streptomycesfradiae)接种于斜面培养基中，在温度29～30℃、湿度30～60％的条件下培养96～168h，制得斜面孢子；

(2)种子培养：将步骤(1)制得的斜面孢子接种于种瓶培养基中，在温度29～30℃、湿度30～60％、220～240rpm的条件下培养24～40h，制得菌体浓度为1～9×10⁸cfu/ml的种子液；

(3)发酵培养：将步骤(2)制得的种子液按体积百分比5～8％接种于发酵培养基中，在温度33～35℃、罐压0.01～0.02mpa、溶氧55～80mg/l的条件下发酵培养15～25h，然后每6-8h补加一次料液，每次补加料液的量为发酵液体积的1.5％～2.0％，补加的料液为玉米淀粉、米粉、玉米蛋白粉、硫酸铵和淀粉酶的混合溶液，发酵培养结束后得含有新霉素的发酵液。

采用本发明的生产方法生产新霉素，使得发酵周期控制在184h以内，最终新霉素发酵单位达到28000u/ml以上。

进一步优选的，步骤(1)中所述斜面培养基组分如下，均为质量百分比：琼脂2.0～2.2％、葡萄糖0.8～1.2％、蛋白胨0.4～0.6％、磷酸氢二钾0.04～0.06％、牛肉膏0.2～0.4％，余量水，ph自然。冷冻孢子在斜面培养基上培养后，斜面上的孢子丰满，颜色均匀一致，孢子层厚。

进一步优选的，步骤(1)中所述斜面培养的湿度为40～50％，培养时间为115h。该条件下培养获得的孢子丰满，颜色均匀一致，孢子层厚。

进一步优选的，步骤(2)中所述种瓶培养基组分如下，均为质量百分比：可溶性淀粉1.00～2.00％、麦芽糖0.60～1.00％、酵母粉0.60～1.00％、磷酸二氢钾0.05～0.10％、硫酸镁0.05～0.10％、余量水，ph自然。斜面孢子接种于种瓶培养基中，培养完成后镜检次生菌丝大量繁殖成网状，开始变细，美兰染色由深变浅，达到优良种子液标准。

进一步优选的，步骤(2)中所述种子培养的湿度为40～50％，转速为220rpm，培养的时间为25h。该条件下培养获得的孢子丰满，颜色均匀一致，孢子层厚。

进一步优选的，步骤(3)中所述发酵培养的溶氧为70mg/l，发酵培养20h后开始加入补加料液，发酵培养的总时间184h。

进一步优选的，步骤(3)中所述每次补加料液的量为发酵液体积的1.5％。

有益效果：

1、本发明通过在发酵培养过程中的特定时间段补加料液，尤其是补加的料液中以淀粉和米粉经淀粉酶酶解后的产物作为持续碳源，以玉米蛋白粉作为迟效氮源和以硫酸铵作为速效氮源的组合方式，充分利用玉米蛋白粉富含含硫氨基酸和亮氨酸等多种氨基酸的优势，进行发酵培养过程中的缓释，从而使得新霉素发酵单位大幅度提高，培养完成后发酵效价可达到28500u/ml，发酵周期仅为184h。

2、本发明选择发酵培养15～25h之后开始补加料液，是因为在发酵前期，菌体主要是利用基础培养基中的营养成分，进行快速的繁殖增生，基础培养基中各类营养元素丰富；而生长到15～25h，菌体的生长已经有了营养组分方面的限制性因素，促使菌体由初级代谢向次级代谢转换，因此将此阶段作为补料的起始点。在发酵过程中，频繁的流加补料会导致发酵罐内环境的变化，容易造成代谢异常，而本发明中的补料周期定为每6-8h补加一次，并优化了补加料液的组分，以不易快速利用的迟效碳源、迟效氮源为主，能够达到持续缓慢释放营养的目的。

3、本发明还调整了发酵培养基组分，增加玉米蛋白粉，充分利用玉米蛋白粉蛋白含量高、氨基酸种类丰富，尤其是含硫氨基酸和亮氨酸含量高的特性，作为发酵前期的迟效氮源使用，在发酵前期的培养过程中持续缓慢的水解、释放氨基酸，为菌体的生长提供营养物质。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明所述技术方案做进一步详细的说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。实施例中所采用的实验方法，若无特殊说明，均按照现有技术；实施例中涉及的药品、试剂、原料，若无特殊说明，均为普通市售产品。

原料来源：

淀粉酶(酶活3000u/g)，河北邢台万达生物工程有限公司有售；

玉米蛋白粉，普通市售产品，指标符合农副产品玉米蛋白粉的行业标准；

淀粉，普通市售产品，指标符合农副产品淀粉的行业标准；

米粉，普通市售产品，指标符合农副产品淀粉的行业标准。

菌株来源：

新霉素生产菌为弗氏链霉菌(streptomycesfradiae)，是新霉素微生物发酵生产的常用菌株，可从商业途径购买得到。

新霉素的发酵单位效价检测方法如下：

抗生素微生物检定法：利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，采用量反应平行线原理设计，通过比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，测量供试品效价。

实施例1

一种提高新霉素产量的生产方法，包括如下步骤：

(1)斜面培养：取弗氏链霉菌(streptomycesfradiae)的冷冻孢子接种于斜面培养基中，每支斜面培养基的冷冻孢子接种量为0.06ml，在温度29℃、湿度50％的条件下培养115h，制得斜面孢子；

所述斜面培养基组分如下，均为质量百分比：琼脂2.0％、葡萄糖1.0％、蛋白胨0.5％、磷酸氢二钾0.05％、牛肉膏0.3％，余量水，ph自然；冷冻孢子在斜面培养基上培养后，斜面上的孢子丰满，颜色均匀一致，孢子层厚；

(2)种子培养：将步骤(1)制得的斜面孢子按1.0cm²/l的接种量接种于种瓶培养基中，种瓶培养基装于750ml摇瓶中，装液量为80ml，在温度29℃、湿度50％、220rpm的条件下培养25h，制得菌体浓度为5.0×10⁸cfu/ml的种子液；

所述种瓶培养基组分如下，均为质量百分比：可溶性淀粉1.50％、麦芽糖0.80％、酵母粉0.80％、磷酸二氢钾0.08％、硫酸镁0.08％、余量水，ph自然；斜面孢子接种于种瓶培养基中，培养完成后镜检次生菌丝大量繁殖成网状，开始变细，美兰染色由深变浅，达到优良种子液标准；

(3)发酵培养：将步骤(2)制得的种子液按体积百分比5％接种于发酵培养基中，在温度34℃、罐压0.01～0.02mpa、溶氧70mg/l的条件下发酵培养20h，然后每6h补加一次料液，每次补加料液的量为发酵液体积的1.5％，继续发酵培养164h，得含有新霉素的发酵液；

所述发酵培养基的组分如下，均为质量百分比：

葡萄糖2.00％、米粉7.50％、花生饼粉2.50％、酵母粉1.00％、蛋白胨1.00％、硫酸铵0.50％、玉米浆0.30％、淀粉酶(酶活3000u/g)0.30％、玉米蛋白粉1.00％、氯化钠0.60％、碳酸钙0.50％、磷酸二氢钾0.05％、豆油0.50％、磷酸氢二钠0.06％，余量水，ph自然；

所述补加的料液组分如下，均为质量百分比：

玉米淀粉15.00％，米粉25.00％，玉米蛋白粉8.00％，硫酸铵0.20％，淀粉酶(酶活3000u/g)0.10％，溶剂水。

将制备得到的含有新霉素的发酵液进行检测，测得新霉素的发酵单位为28900u/ml，发酵周期为184h。

将含有新霉素的发酵液进行酸化预处理、离子交换树脂吸附、解吸得到洗脱液，洗脱液经过浓缩、脱色、结晶、干燥最终得到新霉素。

实施例2

一种提高新霉素产量的生产方法，包括如下步骤：

(1)斜面培养：取弗氏链霉菌(streptomycesfradiae)的冷冻孢子接种于斜面培养基中，每支斜面培养基的冷冻孢子接种量为0.07ml，在温度29℃、湿度40％的条件下培养105h，制得斜面孢子；

所述斜面培养基组分如下，均为质量百分比：琼脂2.2％、葡萄糖1.1％、蛋白胨0.5％、磷酸氢二钾0.05％、牛肉膏0.3％，余量水，ph自然；冷冻孢子在斜面培养基上培养后，斜面上的孢子丰满，颜色均匀一致，孢子层厚；

(2)种子培养：将步骤(1)制得的斜面孢子按0.75cm²/l的接种量接种于种瓶培养基中，种瓶培养基装于750ml摇瓶中，装液量为80ml，在温度29℃、湿度50％、230rpm的条件下培养38h，制得菌体浓度为8.5×10⁸cfu/ml的种子液；

所述种瓶培养基组分如下，均为质量百分比：可溶性淀粉1.50％、麦芽糖1.00％、酵母粉0.80％、磷酸二氢钾0.05％、硫酸镁0.08％、余量水，ph自然；斜面孢子接种于种瓶培养基中，培养完成后镜检次生菌丝大量繁殖成网状，开始变细，美兰染色由深变浅，达到优良种子液标准；

(3)发酵培养：将步骤(2)制得的种子液按体积百分比7％接种于发酵培养基中，在温度34℃、罐压0.01～0.02mpa、溶氧60mg/l的条件下发酵培养20h，然后每6h补加一次料液，每次补加料液的量为发酵液体积的1.8％，继续发酵培养164h，得含有新霉素的发酵液；

所述发酵培养基的组分如下，均为质量百分比：

葡萄糖3.00％、米粉7.00％、花生饼粉2.50％、酵母粉2.00％、蛋白胨1.00％、硫酸铵0.50％、玉米浆0.30％、淀粉酶(酶活3000u/g)0.30％、玉米蛋白粉1.50％、氯化钠0.60％、碳酸钙0.50％、磷酸二氢钾0.05％、豆油0.50％、磷酸氢二钠0.06％，余量水，ph自然；

所述补加的料液组分如下，均为质量百分比：

玉米淀粉10.00％，米粉25.00％，玉米蛋白粉7.00％，硫酸铵0.40％，淀粉酶(酶活3000u/g)0.10％，溶剂水。

将制备得到的含有新霉素的发酵液进行检测，测得新霉素的发酵单位为28500u/ml，发酵周期为184h。

将含有新霉素的发酵液进行酸化预处理、离子交换树脂吸附、解吸得到洗脱液，洗脱液经过浓缩、脱色、结晶、干燥最终得到新霉素。

实施例3

一种提高新霉素产量的生产方法，包括如下步骤：

(1)斜面培养：取弗氏链霉菌(streptomycesfradiae)的冷冻孢子接种于斜面培养基中，每支斜面培养基的冷冻孢子接种量为0.06ml，在温度30℃、湿度60％的条件下培养130h，制得斜面孢子；

所述斜面培养基组分如下，均为质量百分比：琼脂2.0％、葡萄糖1.2％、蛋白胨0.6％、磷酸氢二钾0.06％、牛肉膏0.4％，余量水，ph自然；冷冻孢子在斜面培养基上培养后，斜面上的孢子丰满，颜色均匀一致，孢子层厚；

(2)种子培养：将步骤(1)制得的斜面孢子按0.5cm²/l的接种量接种于种瓶培养基中，种瓶培养基装于750ml摇瓶中，装液量为80ml，在温度30℃、湿度60％、230rpm的条件下培养25h，制得菌体浓度为1.5×10⁸cfu/ml的种子液；

所述种瓶培养基组分如下，均为质量百分比：可溶性淀粉1.50％、麦芽糖1.00％、酵母粉0.80％、磷酸二氢钾0.08％、硫酸镁0.08％、余量水，ph自然；斜面孢子接种于种瓶培养基中，培养完成后镜检次生菌丝大量繁殖成网状，开始变细，美兰染色由深变浅，达到优良种子液标准；

(3)发酵培养：将步骤(2)制得的种子液按体积百分比8％接种于发酵培养基中，在温度34℃、罐压0.01～0.02mpa、溶氧55mg/l的条件下发酵培养20h，然后每8h补加一次料液，每次补加料液的量为发酵液体积的2％，继续发酵培养164h，得含有新霉素的发酵液；

所述发酵培养基的组分如下，均为质量百分比：

葡萄糖2.00％、米粉7.50％、花生饼粉3.00％、酵母粉1.00％、蛋白胨1.00％、硫酸铵0.20％、玉米浆0.10％、淀粉酶(酶活3000u/g)0.30％、玉米蛋白粉1.50％、氯化钠0.60％、碳酸钙0.50％、磷酸二氢钾0.05％、豆油0.50％、磷酸氢二钠0.06％，余量水，ph自然；

所述补加的料液组分如下，均为质量百分比：

玉米淀粉10.00％，米粉28.00％，玉米蛋白粉9.00％，硫酸铵0.20％，淀粉酶(酶活3000u/g)0.10％，溶剂水。

将制备得到的含有新霉素的发酵液进行检测，测得新霉素的发酵单位为28100u/ml，发酵周期为184h。

将含有新霉素的发酵液进行酸化预处理、离子交换树脂吸附、解吸得到洗脱液，洗脱液经过浓缩、脱色、结晶、干燥最终得到新霉素。

实施例4

一种提高新霉素产量的生产方法，包括如下步骤：

(1)斜面培养：取弗氏链霉菌(streptomycesfradiae)的冷冻孢子接种于斜面培养基中，每支斜面培养基的冷冻孢子接种量为0.07ml，在温度30℃、湿度30％的条件下培养125h，制得斜面孢子；

所述斜面培养基组分如下，均为质量百分比：琼脂2.2％、葡萄糖0.8％、蛋白胨0.5％、磷酸氢二钾0.04％、牛肉膏0.4％，余量水，ph自然；冷冻孢子在斜面培养基上培养后，斜面上的孢子丰满，颜色均匀一致，孢子层厚；

(2)种子培养：将步骤(1)制得的斜面孢子按0.8cm²/l的接种量接种于种瓶培养基中，种瓶培养基装于750ml摇瓶中，装液量为80ml，在温度30℃、湿度35％、240rpm的条件下培养29h，制得菌体浓度为5.5×10⁸cfu/ml的种子液；

所述种瓶培养基组分如下，均为质量百分比：可溶性淀粉2.00％、麦芽糖1.00％、酵母粉0.80％、磷酸二氢钾0.10％、硫酸镁0.08％、余量水，ph自然；斜面孢子接种于种瓶培养基中，培养完成后镜检次生菌丝大量繁殖成网状，开始变细，美兰染色由深变浅，达到优良种子液标准；

(3)发酵培养：将步骤(2)制得的种子液按体积百分比5％接种于发酵培养基中，在温度34℃、罐压0.01～0.02mpa、溶氧80mg/l的条件下发酵培养20h，然后每6h补加一次料液，每次补加料液的量为发酵液体积2.0％，继续发酵培养164h，得含有新霉素的发酵液；

所述发酵培养基的组分如下，均为质量百分比：

葡萄糖2.50％、米粉7.50％、花生饼粉2.00％、酵母粉1.00％、蛋白胨1.00％、硫酸铵0.50％、玉米浆0.10％、淀粉酶(酶活3000u/g)0.30％、玉米蛋白粉0.50％、氯化钠0.60％、碳酸钙0.50％、磷酸二氢钾0.05％、豆油0.50％、磷酸氢二钠0.06％，余量水，ph自然；

所述补加的料液组分如下，均为质量百分比：

玉米淀粉10.00％，米粉30.00％，玉米蛋白粉8.00％，硫酸铵0.20％，淀粉酶(酶活3000u/g)0.20％，溶剂水。

将制备得到的含有新霉素的发酵液进行检测，测得新霉素的发酵单位为28400u/ml，发酵周期为184h。

将含有新霉素的发酵液进行酸化预处理、离子交换树脂吸附、解吸得到洗脱液，洗脱液经过浓缩、脱色、结晶、干燥最终得到新霉素。

对比例1

一种新霉素的生产方法，按照实施例1所述的方法，不同之处在于改变了补加料液中玉米蛋白粉的添加量，包括如下步骤：

所述斜面培养基组分如下，均为质量百分比：琼脂2.0％、葡萄糖1.0％、蛋白胨0.5％、磷酸氢二钾0.05％、牛肉膏0.3％，余量水，ph自然；

所述种瓶培养基组分如下，均为质量百分比：可溶性淀粉1.50％、麦芽糖0.80％、酵母粉0.80％、磷酸二氢钾0.08％、硫酸镁0.08％、余量水，ph自然；

所述发酵培养基的组分如下，均为质量百分比：

所述补加料液的组分如下，均为质量百分比：

玉米淀粉15.00％，米粉25.00％，玉米蛋白粉5.00％，硫酸铵0.20％，淀粉酶(酶活3000u/g)0.10％。

将制备得到的含有新霉素的发酵液进行检测，测得新霉素的发酵单位为26800u/ml，发酵周期为184h。

对比例2

一种新霉素的生产方法，按照实施例1所述的方法，不同之处在于将补加料液中的玉米蛋白粉替换为花生饼粉，包括如下步骤：

所述斜面培养基组分如下，均为质量百分比：琼脂2.0％、葡萄糖1.0％、蛋白胨0.5％、磷酸氢二钾0.05％、牛肉膏0.3％，余量水，ph自然；

所述种瓶培养基组分如下，均为质量百分比：可溶性淀粉1.50％、麦芽糖0.80％、酵母粉0.80％、磷酸二氢钾0.08％、硫酸镁0.08％、余量水，ph自然；

所述发酵培养基的组分如下，均为质量百分比：

所述补加料液的组分如下，均为质量百分比：

玉米淀粉15.00％，米粉25.00％，花生饼粉8.00％，硫酸铵0.20％，淀粉酶(酶活3000u/g)0.10％，溶剂水。

将制备得到的含有新霉素的发酵液进行检测，测得新霉素的发酵单位为26000u/ml，发酵周期为184h。

对比例3

一种新霉素的生产方法，按照实施例1所述的方法，不同之处在于改变了补加料液的添加时间，包括如下步骤：

所述斜面培养基组分如下，均为质量百分比：琼脂2.0％、葡萄糖1.0％、蛋白胨0.5％、磷酸氢二钾0.05％、牛肉膏0.3％，余量水，ph自然；

所述种瓶培养基组分如下，均为质量百分比：可溶性淀粉1.50％、麦芽糖0.80％、酵母粉0.80％、磷酸二氢钾0.08％、硫酸镁0.08％、余量水，ph自然；

(3)发酵培养：将步骤(2)制得的种子液按体积百分比5％接种于发酵培养基中，在温度34℃、罐压0.01～0.02mpa、溶氧70mg/l的条件下发酵培养30h，然后每6h补加一次料液，每次补加料液的量为发酵液体积的1.5％，继续发酵培养164h，得含有新霉素的发酵液；

所述发酵培养基的组分如下，均为质量百分比：

所述补加料液的组分如下，均为质量百分比：

玉米淀粉15.00％，米粉25.00％，玉米蛋白粉8.00％，硫酸铵0.20％，淀粉酶(酶活3000u/g)0.10％，溶剂水。

将制备得到的含有新霉素的发酵液进行检测，测得新霉素的发酵单位为25500u/ml，发酵周期为184h。

结果分析：

由上述实施例和对比例的结果可以看出，发酵培养需要与包含有玉米蛋白粉的补料工艺配合达到提高新霉素效价的技术效果。在新霉素的生物合成中，因为涉及氨基糖的产生，氮源的作用不仅限于为细胞提供生长繁殖的氮素，还具体参与抗生素的合成。

玉米蛋白粉中脂肪含量高于冷榨豆饼粉，在必须氨基酸方面，玉米蛋白粉所含的氨基酸总量大于冷榨豆饼粉，其中总含硫氨基酸和亮氨酸含量明显偏高，是抗生素发酵过程很重要的有机氮源。本发明通过对新霉素产生菌的发酵过程中不同成分的需求进行研究，同时结合分子生物学手段，掌握了其代谢过程对补料工艺需求的特点及提高新霉素效价的规律，补料过程通过以淀粉和米粉进行酶解后的产物作为持续碳源，以玉米蛋白粉作为迟效氮源和以硫酸铵作为速效氮源的组合方式，进行发酵培养过程中的缓释控制，缩短了培养周期，实现了新霉素发酵产物效价的大幅提升。

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