一种多酶联合使用提高万寿菊叶黄素提取率的方法与流程

本发明属于中药材提取领域，具体涉及一种可提高中药材万寿菊中叶黄素萃取效率的多酶组合及使用多酶组取万寿菊中叶黄素的方法。

背景技术：

万寿菊，中药名。为菊科万寿菊属植物万寿菊tageteserectal.的花或根。植物万寿菊，在我国各地均有栽培。万寿菊具有清热解毒，化痰止咳之功效，根解毒消肿。花主治上呼吸道感染，百日咳，气管炎，眼角膜炎，咽炎，口腔炎，牙痛；外用治腮腺炎，乳腺炎，痈疮肿毒。鲜草外用主治乳腺炎，无名肿毒，疔疮。

叶黄素(lutein)，别名植物黄体素，是一种类胡萝卜素，化学式为c40h56o2，在蔬菜、水果、花卉等植物中广泛存在，其化学式中含有两个酮环。

万寿菊花中含有丰富的叶黄素。从万寿菊花中制备叶黄素的关键技术是叶黄素萃取。万寿菊花中叶黄素存在于花瓣细胞内的细胞器内。细胞壁和细胞器的膜阻碍了萃取溶媒与叶黄素的接触，导致萃取效率的低下。万寿菊中合成叶黄素的前提物质为α-胡萝卜素，如果将α-胡萝卜素尽可能多的转化为叶黄素，将提高万寿菊叶黄素的提取率。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种用于提高万寿菊鲜花中叶黄素萃取效率的多酶组合及使用该多酶组合提取万寿菊中叶黄素的方法。

本发明是通过以下方式来实现的：

1、一种多酶联合使用提高万寿菊叶黄素提取率的方法：由以下步骤组成：

（1）按照10ml/kg的用量将多酶组合溶液均匀喷洒于万寿菊鲜花表面，压实，密闭环境作用7-9天；

（2）挤压脱水，60℃热风干燥45分钟至含水量≤15％，得到经处理的万寿菊干花；

（3）将万寿菊干花按照1kg加入正己烷3-5l的量加入正己烷，室温下静态萃取30分钟，收集萃取液；

（4）用真空旋转干燥仪，在45℃、-0.06mpa、30rpm条件下浓缩萃取液至无馏出物，萃取物中含有叶黄素，同时包含其前提物质α-胡萝卜素；

（5）将步骤（4）得到的万寿菊萃取液按1:2的体积比加入去离子水，所述的混合液按照10ml:1l比例加入破碎的bl21-petduet-cithyb-citcyp97c重组菌液；25℃-45℃，120rpm反应24-48h；

（6）静置12h后，分离水相和有机相自动，去除水相，收集有机相。

所述的多酶组合溶液，由以下酶按重量分数组合而成：β-1,4-内切木聚糖酶20份，内切β-葡聚糖酶20份、果胶酶45份、角质酶8份、蛋白酶5份、抗氧化剂2份。

所述的bl21-petduet-cithyb-citcyp97c重组菌液，由以下步骤制备得到：

（1）构建工程菌bl21-petduet-cithyb-citcyp97c:用共表达载体petduet-1表达来源于citrussinensis的β-胡萝卜素羟化酶和来源于citrusunshiu的类胡萝卜素ε羟化酶，所述β-胡萝卜素羟化酶序列如seqidno:1所示；所述类胡萝卜素ε羟化酶，序列如seqidno:2所示，重组菌构建以bl21为表达菌株，petduet-1为表达载体，将β-胡萝卜素羟化酶基因和类胡萝卜素ε羟化酶基因整合到petduet-1多克隆位点，构建petduet-cithyb-citcyp97c整合载体，转化bl21菌株，完成重组菌构建；

（2）重组酶表达：重组菌加入终浓度0.1mm的iptg诱导，在30℃诱导4小时；

（3）诱导完成后，离心收集菌体，菌体用pbs缓冲液（ph7.0）重新悬浮后用超声波破碎仪进行细胞破碎，既得重组菌液。

所述β-1,4-内切木聚糖酶与内切β-葡聚糖酶来自于黑曲霉、李氏木霉、绿色木霉的一种或以任何比例的组合；所述的黑曲霉来源的酶的活性为10⁵-10⁶u/g、李氏木霉来源的酶的活性为10⁵-10⁶u/g、绿色木霉来源的酶的活性为10⁵-10⁶u/g。

所述果胶酶为米根霉来源的果胶酶、黑曲霉来源的果胶酶中的一种或以任意比例的组合；其中，米根霉来源的果胶酶的活性为10⁵-10⁶u/g，黑曲霉来源的果胶酶的活性为10⁵-10⁶u/g。

所述蛋白酶为菠萝来源的蛋白酶、枯草芽孢杆菌来源的蛋白酶、米曲霉来源的蛋白酶、地衣芽孢杆菌来源的蛋白酶、黑曲霉来源的蛋白酶中的一种或以任意比例的多种组合；其中，菠萝来源的蛋白酶的活性为10⁵-10⁶u/g、枯草芽孢杆菌来源的蛋白酶的活性为10⁵-10⁶u/g、米曲霉来源的蛋白酶的活性为10⁵-10⁶u/g、地衣芽孢杆菌来源的蛋白酶的活性为10⁵-10⁶u/g、黑曲霉来源的蛋白酶的活性为10⁵-10⁶u/g。

所述的角质酶为米曲霉来源、镰刀菌来源的一种或以任意比例的两种组合；其中，米曲霉来源的角质酶的活性为10⁵-10⁶u/g、镰刀菌来源的角质酶活性为10⁵-10⁶u/g。

所述抗氧化剂包括天然维生素e、dl-α-生育酚、dl-α-生育酚乙酸酯中的一种或以任意比例的多种组合。

本发明的有益效果

（1）应用组合酶：纤维素酶、果胶酶、角质酶和蛋白酶可以最大限度地降解花瓣组织细胞壁、细胞膜和细胞内的叶黄素-蛋白质复合体，使叶黄素分子与萃取溶媒分子之间达到最大限度的接触，从而提高萃取效率。

（2）使用以淬灭自由基为作用机理的抗氧化剂，最大限度地减少叶黄素的损失。

（3）采用bl21-petduet-cithyb-citcyp97c工程菌继续催化，β-胡萝卜素羟化酶和类胡萝卜素ε羟化酶可以有效的将α-胡萝卜素转化为叶黄素，再次提高叶黄素含量。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。

实施例1

（1）按照10ml/kg的用量将多酶组合溶液均匀喷洒于1kg新鲜万寿菊表面，压实，密闭环境中25摄氏度8天；

（2）多酶组合溶液的配比为：β-1,4-内切木聚糖酶20份，内切β-葡聚糖酶20份、果胶酶45份、角质酶8份、蛋白酶5份、抗氧化剂2份；

（3）8天后将新鲜万寿菊烘干。

（4）将万寿菊干花按照1kg加入正己烷3-5l的量加入正己烷，室温下静态萃取30分钟，收集萃取液；

（5）用真空旋转干燥仪，在45℃、-0.06mpa、30rpm条件下浓缩萃取液至无馏出物，萃取物中含有叶黄素，同时包含其前提物质α-胡萝卜素；

（6）挑取单菌落bl21-petduet-cithyb-citcyp97c于5ml含50ug/ml氨苄青霉素的lb液体培养基，37℃、200rpm过夜活化菌种。活化的菌种按1％接种量转接到50ml新鲜lb培养基（50ug/ml氨苄青霉素），37℃、200rpm培养至od600约0.5时，加入终浓度1mmol/l的iptg,30℃诱导6h，9000r/min离心10min，收集菌体。

（7）将步骤（5）得到的万寿菊萃取液按1:2的体积比加入去离子水，所述的混合液按照10ml:1l比例加入破碎的bl21-petduet-cithyb-citcyp97c重组菌液；30℃，120rpm反应36h，既得。测定反应后叶黄素的含量为0.98‰（w/dw）。

实施例2

常规的萃取工艺：采用正己烷浸提，过滤得万寿菊叶黄素浸提液，用重量为正己烷20%、质量百分比浓度为1.0-1.2%的盐水，对万寿菊叶黄素浸提液分离去杂，既得叶黄素，测定叶黄素的含量为0.36‰（w/dw）。

实施例3

本实施例与实施例1的不同之处在于未采用bl21-petduet-cithyb-citcyp97c工程菌继续催化，其余同实施例1。测定叶黄素的含量为0.46‰（w/dw）。

序列表

<110>江西邦泰绿色生物合成生态产业园发展有限公司

<120>一种多酶联合使用提高万寿菊叶黄素提取率的方法

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