一种基于总核酸和宏基因组学构建病原微生物测序文库的方法及试剂盒与流程

2021-02-02 18:02:01|

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本发明属于微生物检测
技术领域：
，涉及一种构建病原微生物的测序文库的方法，尤其涉及一种基于总核酸和宏基因组学构建病原微生物测序文库的方法。
背景技术：
：感染性疾病是临床常见疾病之一，多为细菌、病毒和真菌等病原体及其产物引起的局部或全身性炎症或器官功能障碍，具有较大的危害性和较高的病死率。感染是急危重症患者死亡的主要原因之一。重症感染起病急、进展快、病原体复杂，短时间内能否明确致病病原微生物至关重要。在感染性疾病领域中已有多种方式检测病原微生物。其中，(1)获得病原体的活体是感染性疾病诊断的金标准，对于细菌、真菌、病毒而言，主要是培养阳性，但病原体的体外培养耗时普遍较长，操作步骤繁琐，且绝大多数病原体不可培养；(2)利用免疫学方法，如补体结合试验、中和试验、酶联免疫吸附实验、免疫荧光法和酶标斑点免疫法等检测病原微生物，虽然操作较为简单，但由于病原体种类繁多，已研发的抗原、抗体数量远远不能满足市场需求；(3)pcr检测病原微生物具有极高的灵敏度和特异性，但无法完成高通量筛查，检出率较低；(4)基因芯片技术只能对已知的病原体基因组进行意向性筛查，而无法检测新的未知病原体。然而，上述传统检测方法仍然存在无法快速准确地确定病原体信息等问题，容易导致感染性疾病患者不能得到及时有效地救治，从而使病情恶化。因此，快速、特异且高通量的病原体检测方法，对有效诊断和及时防治感染性疾病具有重要的意义。基于宏基因组学测序(mngs)的病原学诊断技术是一种非靶向的广谱病原学筛查技术，近几年越来越多的研究表明其在重症感染领域，特别是疑难、罕见病导致的重症感染中发挥了关键性作用。但仍存在一些挑战，例如：(1)背景菌的影响，在mngs报告结果中，要结合样本采集类型、微生物背景、患者的临床特征、传统病原体的检测报告和辅助检查等判断是定制菌、背景菌还是致病菌。(2)胞内菌/真菌检出率低，主要由于胞内感染菌因释放到体液中含量较少而导致检测敏感性偏低，比如结核分枝杆菌、军团菌、布鲁菌等；(3)耐药检测存在一定困难，主要由于目前报道的耐药基因型与耐药表型的关联程度存在一些差距以及检测方法及检测成本的考虑导致耐药相关基因覆盖度较低；(4)rna病原体的检测，由于人体转录本身具有比基因组更高的丰度和复杂度，且rna容易降解，对运输和保存的要求较高，因此rna病毒的临床检测存在一定困难。目前市场上大都开展的基于dna层面的mngs检测，较少有基于rna的宏转录组检测；可以开展宏基因组和宏转录组测序应用的，也是分dna和rna两部分单独检测，数据合并分析；或者，将rna先经过逆转录和二链合成后，再与dna混合，导致检测成本偏高，不利于检测应用的普及。因此，有必要提供一种试剂盒，可以用于单管反应中同时进行dna和rna建库，既可以节省检测样本使用量，又可节省检测成本和周期。技术实现要素：针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种基于总核酸和宏基因组学构建病原微生物测序文库的方法及试剂盒。该方法在单管反应中同时进行dna和rna的建库，减少了构建步骤，同时还能使得在构建过程中更好地保留样本原有的核酸，因此，在对于样本量较少的情况而言，所述方法具有较高的应用价值。为达此目的，本发明采用以下技术方案：第一方面，本发明提供一种基于总核酸和宏基因组学构建病原微生物测序文库的方法，所述方法包括如下步骤：(1)对病原微生物感染的样本中的dna和rna分别进行提取，并对所述rna进行富集，而后混合所得dna和rna得到总核酸(totalnucleicacid，tna)，得到待测样本；或者，直接提取微生物感染的样本中的tna作为待测样本；(2)所述待测样本中含有病原微生物的dna和rna，而后对所述待测样本中的rna进行片段化，同时进行一链cdna合成；(3)所述一链cdna合成结束后，再进行二链cdna合成得到cdna/dna复合物；(4)使用片段化酶将所述cdna/dna复合物打断，并进行末端修复和加尾反应、接头连接、pcr富集和纯化，得到基于tna构建的测序文库。本发明中所述方法为一种基于总核酸的测序方法，可简记为“tna-seq”，具体包括：微生物病原体总核酸提取，在样本量多时，dna和rna单独抽提，样本量少的提取病原微生物总核酸tna；加入rnafragment酶进行rna的片段化以及一链合成buffer和酶；进行二链合成形成cdna/双链dna的复合物；针对cdna/双链dna的复合物进行酶切片段化和末端修复加a尾；接头连接及纯化，pcr富集，纯化即可获得所述模板为dna/rna的单管共测序文库。所述方法简化了dna和rna分别独立检测的流程，大大降低检测成本，可以显著提高细菌、真菌、病毒等复合感染的致病菌检出率。实现了单管反应内同时检测dna和rna病原体感染情况；同时覆盖面较广，一次检测即可实现全面覆盖临床上多种不同类型的病原体。本发明所述的方法相比于使用tn5转座酶构建文库实现同时检测dna和rna的病原微生物的方法而言，不存在选择偏好性，兼容性较好，且共建库后检出率较高。而使用tn5转座酶的构建方法中，tn5转座酶具有核酸片段选择的偏好性，不适和广泛应用推广，有检测结果漏检的可能；同时使用tn5转座酶的构建方法仅能保证文库构建质量合格，对于dna和rna病原体的检出率来看，无明显共建库的效果。作为本发明优选的技术方案，步骤(1)所述病原微生物包括细菌、真菌、dna病毒、rna病毒、衣原体、支原体或寄生虫中的任意一种或至少两种的组合。本发明中所构建的病原微生物的测序文库的种类可高达13396种。优选地，步骤(1)所述微生物感染的样本包括肺泡灌洗液、痰液、脑脊液、胸腔积液或穿刺组织中的任意一种或至少两种的组合。本发明中，对于待检测的生物样本，可以采用两种不同的方式进行。对于样本量较大的，例如肺泡灌洗液、痰液等样本，可以分别提取样本中的dna和rna；对于样本量较小的，例如脑脊液等样本，可以采用提取样本中总核酸的方式获取样本核酸，从而保证不论在何种情况下，均能得到样本中完整的核酸，防止在提取测序文库的过程中发生遗漏，最终导致微生物病原体的漏检。本发明所述的方法能够对样本中全部的dna和rna病毒的核酸进行建库，从而提高病原体的检出率，灵敏度和特异性得到保证。优选地，所述富集的反应体系中包括turbo脱氧核糖核酸酶(turbodnase)和/或baseline脱氧核糖核酸酶(baselinednase)。优选地，所述富集rna时所采用的试剂盒为zymornaclean&concentratorkit，富集的步骤按该试剂盒的说明书进行，对样本中的rna进行富集。本发明中，当样本量较大时，对样本的dna和rna分别提取后，在对rna进行纯化和富集，随后合并dna和rna，继续进入下一步骤。优选地，步骤(2)的反应体系中包含样本中的dna、rna、逆转录酶、rna片段化酶和dntps。本发明中，所述一链cdna在合成时，所使用的反应体系中包括rnafragmentationmix、1ststrandbuffer和1ststrandenzymemix；其中，1ststrandenzymemix中包含逆转录酶。在此步骤中，样本中dna和rna一同存在与反应液当中，此时，dna的存在并不会影响rna的片段化以及逆转录步骤的发生，一链cdna的合成正常进行。优选地，所述逆转录酶与rna片段化酶的体积比为1:(5～8)。优选地，所述一链cdna合成的反应条件为：先在20～30℃下反应5～10min，而后在40～42℃下反应10～15min，再于65～70℃下反应10～20min。作为本发明优选的技术方案，步骤(3)的反应体系中包含样本中的dna、一链cdna、dna聚合酶和rnaseh。本发明中，在一链cdna合成步骤结束后，立刻进行二链cdna合成。所使用的反应体系中包括一链cdna合成后的产物，2ndstrandbuffer以及2ndstrandenzymemix。优选地，所述二链cdna合成的反应条件为：先在20～30℃下反应20～40min，而后在60～65℃下反应10～15min。二链cdna合成完毕之后，可以采用磁珠对反应液中的核酸进行提取和纯化，得到产物cdna/dna复合物。优选地，步骤(4)所述片段化酶包括dnafragenzyme。优选地，步骤(4)所述末端修复和加尾反应使用的反应体系中包括：末端修复-加a尾酶及对应预混缓冲液(endrepair-atailingenzymemix)、dna片段化酶及对应预混缓冲液(dnafragenzymemix)和dna片段化-加a尾酶增强子及增强预混缓冲液(dnafrag-atailingenhancer)。本发明中，在合成得到cdna/dna复合物后，先使用片段化酶对所得到的复合物进行打断，并采用末端修复和加a尾反应的体系对片段化的产物进行修饰。优选地，所述接头连接的反应温度为22～26℃，反应时间为10～15min。优选地，步骤(4)所述接头连接的反应体系中包含接头(adaptor)，片段化的dna与接头的使用量比值为(15～20)ng:1μl。即本发明中，adaptor的使用量与反应液中的dna含量参考如下比例进行，按照下表所示的使用量，可以保证接头的连接效果较好。dna含量接头用量(μl)接头稀释倍数100ng5不稀释50ng51:210ng51:101ng51:100优选地，步骤(4)所述测序文库的浓度≥2.0ng/μl。优选地，步骤(4)所述测序文库中dna片段的长度为220bp～400bp。优选地，所述方法中纯化核酸使用的方法为磁珠纯化法。优选地，所述方法还包括将所述测序文库进行高通量测序和生物信息学分析的步骤。作为本发明优选的技术方案，所述方法包括如下步骤：(1)对感染患者的肺泡灌洗液、痰液或胸腔积液中的dna和rna分别进行提取，并对所述rna进行富集，而后混合所得dna和rna，得到待测样本；或者，直接提取感染患者脑脊液或穿刺组织中的tna作为待测样本；(2)将所述待测样本与逆转录酶、rna片段化酶和dntps混合，对所述待测样本中的rna进行片段化和逆转录，同时进行一链cdna合成；所述一链cdna合成的反应条件为：先在20～30℃下反应5～10min，而后在40～42℃下反应10～15min，再于65～70℃下反应10～20min；(3)再将所述一链cdna合成得到的产物与dna聚合酶混合，进行二链cdna合成得到cdna/dna复合物；所述二链cdna合成的反应条件为：先在20～30℃下反应20～40min，而后在60～65℃下反应10～15min；(4)使用片段化酶将所述cdna/dna复合物打断，并进行末端修复、加尾反应和接头连接，所述接头连接的反应体系中片段化的dna与接头的使用量比值为(15～20)ng:1μl；所述接头连接完成后，再进行pcr富集和纯化，得到基于tna构建的测序文库，所得测序文库的浓度≥2.0ng/μl，dna片段的长度为220bp～400bp。第二方面，本发明还可以提供一种利用如第一方面所述的方法构建病原微生物测序文库的试剂盒，所述试剂盒包括：dna和rna提取组分；rna富集组分，包括turbo脱氧核糖核酸酶、baseline脱氧核糖核酸酶和rna吸附柱；rna逆转录组分，包括逆转录酶、逆转录反应缓冲液和引物；片段化组分，包括rna片段化酶和dna片段化酶；cdna/dna复合物建库组分，包括dna片段化酶及对应预混缓冲液、末端修复-加a尾酶及对应预混缓冲液、dna片段化-加a尾酶增强子及增强预混缓冲液和接头。示例性地，所述试剂盒中包含如下组分：该试剂盒在共建库过程中，增加了对rna检测环节的模板富集过程，在对感染样本的检测过程中，提升了rna病毒类的检出率，具有检测灵敏度更高的特性。因此，本发明所述的试剂盒能够用于病原微生物的文库构建，所得文库构建之后，进行上机检测，则能够分析得到感染的病原微生物类型。本发明所述的数值范围不仅包括上述例举的点值，还包括没有例举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供的测序文库的构建方法实现了在单管反应内同时构建dna和rna病原体的测序文库，能够全面覆盖临床13396个病原体，为基于tna(dna和rna共建库)测序全面检测病原微生物的方法奠定了基础，所述全面检测病原微生物的方法可适用于症状交错、难以判断的病原体(细菌和真菌、病毒、支原体)的混合感染、罕见病原体(腺病毒、疟原虫等)的感染，以及临床培养多次都是阴性、但是严重怀疑感染的情况；同时，该方法具有样本起始量少，检测周期快，检测成本低，灵敏度高等优势，显著提高了病原体的检出率。具体实施方式下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。以下实施例中，所述室温均为25℃；以下实施例中，turbodnase购自thermofisher；baselinednase购自epicentre，illumina；rnaclean&concentratorkit购自zymoresearch；1ststrandbuffer、1ststrandenzymemix、2ndstrandbuffer和2ndstrandenzymemix购自dynastygene；rna片段化酶及对应预混缓冲液(rnafragmentationmix)、dna片段化酶及对应预混缓冲液(dnafragenzyme)、endrepair-atailingenzymemix、dnafrag-atailingbuffer、dna片段化-加a尾酶增强子及增强预混缓冲液(dnafrag-atailingenhancer)、连接缓冲液(ligationbuffer)、连接酶(ligase)、pcr反应液(pcrmix)以及接头adaptor(il)均购自kapabiosystems；其余未提及的试剂均可由本领域常规试剂厂商购得。实施例1本实施例提供一种宏基因组学和tna构建病原微生物测序文库的方法，同时使用临床样本验证所述检测方法的可靠性。本实施例中，测定60例临床样本，检测的病源类型包含细菌、真菌、病毒、寄生虫、分支杆菌、支原体/衣原体。每种病源类型样本采用临床标准检测技术进行对比，其中，细菌、真菌、支原体采用分离培养方法；病毒、结核杆菌采用pcr方法检测进行结果对比，同时采用标准菌株和健康人核酸分别作为阳性对照和阴性对照。具体检测步骤如下：1、样本准备(1)样本预处理：针对样本较粘稠无法用枪头取样的情况，加入1ml化痰液dtt及pbs缓冲液吹吸混匀，若还是粘稠继续加入1ml化痰液，用移液枪吹吸混匀，可放入37℃金属浴温育15min直至不堵枪头；(2)裂解处理：2ml样本8000g离心5min收集沉淀，加入600μl裂解液rlplus涡旋震荡30s，将所有溶液转移至dna吸附柱中12000rpm(～13,400×g)离心1min收集滤液(滤液用于rna提取)，将dna吸附柱放在收集管中室温或4℃放置至后续提取dna；(3)rna提取：上述向滤液中加入1倍体积70％乙醇混匀，转入rna吸附柱中，12000rpm离心1min去除废液，向rna吸附柱加入700μl去蛋白液rw1，12000rpm离心1min去除废液，向rna吸附柱中加入500μl漂洗液rw(使用前已加入乙醇)，室温静置2min，12000rpm离心1min，漂洗两次；将rna吸附柱置于室温放置5分钟，加入30μl洗脱液，室温放置2min，12000rpm离心1min得到rna溶液；(4)dna提取：向dna吸附柱中加入500μl缓冲液gd(使用前已加入乙醇)，12000rpm离心1min去除废液，向dna吸附柱中加入500μl漂洗液pw，室温静置2min后12000rpm离心1min去除废液，漂洗两次；将dna吸附柱置于室温放置5分钟，加入50μl洗脱液，室温放置2min，12000rpm离心1min得到dna溶液。2、rna富集(所用试剂盒为zymornaclean&concentratorkit)(1)rna吸附柱预处理：为了去除痕量的dna，加入80μldnasei反应液，再将dnasei5μl、dnadigestionbuffer75μl混匀后加入吸附柱，室温下孵育15min；(2)样本裂解：吸取500ml样本直接加入500mltrizol裂解液混匀后室温放置10min，样品裂解完成后4℃12000g离心1min后取出上清，转移至新的离心管中加入等体积的无水乙醇，弃去无法裂解的组织和沉淀；(3)rna吸附：将上述混合物加入已进行预处理的吸附柱中，离心1min。去除滤出液；添加400μl的rnaprepbuffer到吸附柱，12000g离心1min，去除滤出液；(4)添加700μl的rnawashbuffer到吸附柱，12000g离心1min，去除滤出液，重复一次；(5)取出吸附柱，放入一个无rna酶的离心管中，在吸附膜的中间部位加50μlrnase-freewater，室温放置2min，离心1min收集rna。将富集后得到的rna与提取得到的dna混合，继续进行实验。3、一链cdna合成(1)将rnafragmentationmix、1ststrandbuffer从冰箱中拿出解冻，平衡至室温，1ststrandenzymemix置于冰上解冻。按照下表所示在冰上配置一链cdna合成反应体系：组分体积(μl)dna/rna8.5rnafragmentationmix8.51ststrandbuffer71ststrandenzymemix1总体积25使用移液器轻轻吸打10次充分混匀，短离。(2)在pcr仪中运行如下程序，进行第一链cdna合成：结束后立刻进行第二链cdna合成反应。4、二链cdna合成(1)将2ndstrandbuffer从冰箱中拿出解冻，平衡至室温，2ndstrandenzymemix置于冰上解冻。按照下表所示在冰上配置二链cdna合成反应体系：组分体积(μl)上步产物252ndstrandbuffer3.62ndstrandenzymemix6.5nuclease-freewater14.9总量50使用移液器轻轻吸打10次充分混匀，短离。(2)在pcr仪中运行如下程序，进行第二链cdna合成：步骤温度(℃)时间11630min26515min34保持(3)结束后加入90μl的预先室温平衡40min的磁珠dnaquaracceshyperpurebeads，混合均匀，室温放置5min；(4)放置于磁力架上，静置澄清后弃上清液；(5)加入200μl的80％乙醇，静置30s后弃上清，重复此步骤一次；(6)快速离心后用10μl的移液器弃去残余乙醇，室温放置，晾干；(7)从磁力架上取下，加入32μl的nuclease-freewater重悬磁珠，充分吸打混匀，室温静置2min后放置于磁力架上，待溶液澄清后小心吸取31.3μl上清转移至新的无核酸酶的管中，置于冰上备用。5、cdna/dna复合物酶切片段化(1)将dnafragenzyme、endrepair-atailingenzymemix放置于冰上融化，手指轻弹混匀，将dnafrag-atailingbuffer、dnafrag-atailingenhancer放置于冰上融化，旋涡震荡2s；(2)按照下表设置pcr仪，热盖温度设置为70℃，开始程序，等温度达到4℃后暂停；步骤温度(℃)时间141min23222min36530min44保持(3)加入5μldnafrag-atailingbuffer和2.5μldnafrag-atailingenhancer，轻柔吹打混匀6次；(4)每个样本中加入10μl的dnafragenzyme和1.2μl的endrepair-atailingenzymemix，轻柔吹打混匀6次；(5)将混好的样本简短离心至管底后马上转移到已经预冷的pcr仪中，继续运行程序至结束。6、接头连接(1)取出ligationbuffer、adaptor(il)和ligase，按照下表所示，配置接头连接的反应体系：组分体积(μl)上步产物50adaptor(il)5ligationbuffer16连接酶6nuclease-freewater3total80吹打混合均匀，短离，放置于pcr仪上执行以下程序：步骤温度(℃)时间12510min24保持结束后加入64μl的磁珠进行纯化。7、pre-pcr(1)从磁力架上取下反应管，加入15μl的nuclease-freewater重悬磁珠，涡旋振荡器混合均匀，室温放置2min；再加入25μlpcrmix，8μl的pre-primermix，混合均匀，快速离心5s放置于磁力架上1min，取上清转移至新的pcr管中，执行如下pcr反应：其中，n根据dna含量进行确定，具体数值如下：dna循环数(n)100ng6-950ng9-1110ng11-131ng14-16结束后加入40μl的磁珠进行纯化；从磁力架上取下管子，加入21μlnuclease-freewater重悬磁珠，充分吸打混匀，室温静置2min后放置于磁力架上，待溶液澄清后小心，吸取20μl上清转移至新的无核酸酶管中。8、文库质检使用qubit进行定量，文库浓度≥2.0ng/μl，达到上机合格标准；采用agilent2100dna1000芯片进行质控，质控片段大小在220bp～400bp，质检合格。9、对质控合格的文库进行上机测序nextcn500，pe75模式双端index测序，并进行生信流程分析。10、实验结果：所得结果如表1所示，其中mngs为使用本实施中所述的方法得到的检测结果：表1由上表可知，60例样本病源菌类型的一致性为53.3％；60例实验样本中由tna-mngsseq共检测出病毒样本21例，而临床仅检测出3例。目前，临床原微生物检测方法在敏感性、特异性、时效性、信息量等方面存在局限，临床检测分离培养敏感性约为34.2％，因此本发明提供的tna-mngsseq所得到的检测结果在可接受范围内。实施例2本实施例模拟临床阳性的dna病原体样本与临床阳性的rna病原体样本，核酸混合，进行tna的测序，检测结果如下表2所示：表2由上表可知，与单独dna测序结果和单独的rna测序结果检出丰度较高的reads序列一致。因此，所述试剂盒及检测方法可以同时针对dna病毒和rna病毒感染的样本进行检测。综上所述，本发明提供的基于宏基因组学和tna构建病原微生物测序文库的方法具有较高的灵敏度和准确性，且覆盖率高，因此，在检测感染样本的过程中，不易发生漏检的情况，能够为感染患者的病况诊断提供有效的、可靠的依据。申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属
技术领域：
的技术人员应该明了，任何属于本
技术领域：
的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。当前第1页1 2 3

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