一种奶牛乳房炎肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒及检测方法与流程

2021-02-02 17:02:44|

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本发明涉及一种奶牛乳房炎肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒及检测方法，属微生物检测技术领域。

背景技术：

鉴定肺炎克雷伯氏菌常用方法是利用pcr方法，通用引物扩增细菌16srdna，得到目标片段后进行凝胶核酸回收纯化。将纯化后得到的核酸送往测序公司进行基因测序，将得到的基因序列与ncbi上的序列进行比对得出克雷伯氏菌的类型。具体的检测步骤包括①提取乳房炎奶样中dna；②使用pcr方法进行dna扩增；③核酸凝胶电泳，观察目标条带；④凝胶核酸回收；⑤基因测序；⑥ncbiblast比对，确定克雷伯氏菌类型等六个步骤，虽然传统的检测方法可以初步满足检测作业的需要，但一方面传统的检测方法不能针对性的检测出肺炎克雷伯氏菌，且步骤繁琐、耗时较长，检测作业精度相对较差；另一方面传统的检测方法在检测中，需要进行跑胶、收胶、测序等步骤操作，且检测中需要使用到tae原料及切胶等作业，从而导致传统的检测方法的操作步骤复杂且检测成本较高，同时tae原料及切胶作业对检测人员的健康也构成了较大的危害。

因此针对这一现状，需要开发一种全新的奶牛乳房炎肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒及相应的检测方法，以满足实际使用的需要。

技术实现要素：

本发明的目的是提供本发明提供一种奶牛乳房炎肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒及检测方法。

为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种奶牛乳房炎肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒，包括pcr八连管、干粉状检测试剂，其中所述pcr八连管中各试剂管内均设干粉状检测试剂，且所述干粉状检测试剂与pcr八连管各试剂管上端面间间距不大于pcr八连管各试剂管高度的1/4，且不小于2毫米。

进一步的，所述的干粉状检测试剂包括探针、上下游引物、dntp、taq聚合酶，具体由以下重量份数物质构成：tris-hcl（ph=8.3）3%—10%、kcl3%—8%、mgcl0.5%—3%、dntp1%—4.5%、上游引物1%—10%、下游引物1%—10%、探针1%—8%、dmso1%—10%、udg酶0.1%—0.5%、taq酶0.2%—5%，余量为甘油。

进一步的，所述探针、上下游引物基因序列为：

探针序列为：fam-cacactggaactgagacacggt-bhq1；

上游引物序列为：ctggtctgagaggatgac；

下游引物序列为：ccgctgaaagtgctttac。

进一步的，所述pcr八连管为25μl体系。

一种奶牛乳房炎肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤：

s1，检测预制，首先对pcr八连管进行离心作业，使pcr八连管管壁上的干粉状检测试剂落入到pcr八连管底部，然后向pcr八连管的各试剂管中分别添加3—8μl的将待检测核酸，然后分别向各试剂管中添加去离子，时各试剂管混合液体积达到25μl，并对试剂管通过密封盖进行密封处理；

s2，试剂盒运行，完成s1步骤后，驱动试剂盒运行，试剂盒具体运行工作程序为：第一阶段预变性95℃15min。第二阶段变性：95℃5s,退火60℃30s，40个循环，并在60℃时采集荧光；

s3，结果判定，检测结果具体标准为：

检测结果呈现无ct值，无扩增曲线或反应曲线无明显对数期判定为阴性；

检测结果出现ct值＜36，并且扩增曲线有明显的对数增长期，判定为荧光pcr阳性；

检测结果出现ct值36＜ct值＜40，则需要样品重测。如果复测的ct值＜40，且扩增曲线有明显的对数增长期，则判定为阳性。

进一步的，所述s2步骤中，采集荧光时，报告荧光设定为fam，淬灭荧光设置为none。

本发明一方面试剂盒结构简单且制备快捷方便，制备及使用成本低廉，且有效克服了传统检测作业中检测试剂对人体造成的危害；另一方面在进行肺炎克雷伯氏菌检测作业中，有效的缩短了检测步骤、简化了检测操作内容，从而极大的提高了检测效率和检测精度，并有助于降低检测成本。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明结构示意图；

图2为本发明方法流程图；

图3为肺炎克雷伯氏菌凝胶电泳图m为mark；

图4为用本试剂盒检测肺炎克雷伯氏菌扩增曲线图；

图5为检测结果相似度对比表。

具体实施方式

下面将结合本发明的附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

如图1所示，一种奶牛乳房炎肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒，包括pcr八连管1、干粉状检测试剂2，其中所述pcr八连管1中各试剂管内均设干粉状检测试剂2，且所述干粉状检测试剂2与pcr八连管各试剂管1上端面间间距不大于pcr八连管1各试剂管高度的1/4，且不小于2毫米。

重点说明的，所述的干粉状检测试剂包括探针、上下游引物、dntp、taq聚合酶，具体由以下重量份数物质构成：tris-hcl（ph=8.3）3%、kcl3%、mgcl0.5%、dntp1%、上游引物1%、下游引物1%、探针1%、dmso为1%、udg酶0.1%、taq酶0.2%，余量为甘油。

此外，所述探针、上下游引物基因序列为：

探针序列为：fam-cacactggaactgagacacggt-bhq1；

上游引物序列为：ctggtctgagaggatgac；

下游引物序列为：ccgctgaaagtgctttac。

值得注意的，所述pcr八连管为25μl体系。

如图2—5所示，一种奶牛乳房炎肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤：

s1，检测预制，首先对pcr八连管进行离心作业，使pcr八连管管壁上的干粉状检测试剂落入到pcr八连管底部，然后向pcr八连管的各试剂管中分别添加3μl的将待检测核酸，然后分别向各试剂管中添加去离子，时各试剂管混合液体积达到25μl，并对试剂管通过密封盖进行密封处理；

s3，结果判定，检测结果具体标准为：

检测结果呈现无ct值，无扩增曲线或反应曲线无明显对数期判定为阴性；

检测结果出现ct值＜36，并且扩增曲线有明显的对数增长期，判定为荧光pcr阳性；

检测结果出现ct值36＜ct值＜40，则需要样品重测。如果复测的ct值＜40，且扩增曲线有明显的对数增长期，则判定为阳性。

此外，所述s2步骤中，采集荧光时，报告荧光设定为fam，淬灭荧光设置为none。

实施例2

如图1所示，一种奶牛乳房炎肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒，包括pcr八连管1、干粉状检测试剂2，其中所述pcr八连管1中各试剂管内均设干粉状检测试剂2，且所述干粉状检测试剂2与pcr八连管各试剂管1上端面间间距不大于pcr八连管1各试剂管高度的1/4，且不小于2毫。

需要说明的，所述的干粉状检测试剂包括探针、上下游引物、dntp、taq聚合酶，具体由以下重量份数物质构成：tris-hcl（ph=8.3）10%、kcl8%、mgcl3%、dntp4.5%、上游引物10%、下游引物10%、探针8%、dmso10%、udg酶0.5%、taq酶5%，余量为甘油。

值得注意的，所述探针、上下游引物基因序列为：

探针序列为：fam-cacactggaactgagacacggt-bhq1；

上游引物序列为：ctggtctgagaggatgac；

下游引物序列为：ccgctgaaagtgctttac。

进一步的，所述pcr八连管为25μl体系。

如图2—5所示，一种奶牛乳房炎肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤：

s1，检测预制，首先对pcr八连管进行离心作业，使pcr八连管管壁上的干粉状检测试剂落入到pcr八连管底部，然后向pcr八连管的各试剂管中分别添加8μl的将待检测核酸，然后分别向各试剂管中添加去离子，时各试剂管混合液体积达到25μl，并对试剂管通过密封盖进行密封处理；

s3，结果判定，检测结果具体标准为：

检测结果呈现无ct值，无扩增曲线或反应曲线无明显对数期判定为阴性；

检测结果出现ct值＜36，并且扩增曲线有明显的对数增长期，判定为荧光pcr阳性；

检测结果出现ct值36＜ct值＜40，则需要样品重测。如果复测的ct值＜40，且扩增曲线有明显的对数增长期，则判定为阳性。

同时，所述s2步骤中，采集荧光时，报告荧光设定为fam，淬灭荧光设置为none。

实施例3

需要特别说明的，所述的干粉状检测试剂包括探针、上下游引物、dntp、taq聚合酶，具体由以下重量份数物质构成：tris-hcl（ph=8.3）4%、kcl5%、mgcl1.5%、dntp2.5%、上游引物3.5%、下游引物4.1%、探针5.5%、dmso6.2%、udg酶0.3%、taq酶1.3%，余量为甘油。

其中，所述探针、上下游引物基因序列为：

探针序列为：fam-cacactggaactgagacacggt-bhq1；

上游引物序列为：ctggtctgagaggatgac；

下游引物序列为：ccgctgaaagtgctttac。

此外，所述pcr八连管为25μl体系。

如图2—5所示，一种奶牛乳房炎肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤：

s1，检测预制，首先对pcr八连管进行离心作业，使pcr八连管管壁上的干粉状检测试剂落入到pcr八连管底部，然后向pcr八连管的各试剂管中分别添加5μl的将待检测核酸，然后分别向各试剂管中添加去离子，时各试剂管混合液体积达到25μl，并对试剂管通过密封盖进行密封处理；

s3，结果判定，检测结果具体标准为：

检测结果呈现无ct值，无扩增曲线或反应曲线无明显对数期判定为阴性；

检测结果出现ct值＜36，并且扩增曲线有明显的对数增长期，判定为荧光pcr阳性；

检测结果出现ct值36＜ct值＜40，则需要样品重测。如果复测的ct值＜40，且扩增曲线有明显的对数增长期，则判定为阳性。

同时，所述s2步骤中，采集荧光时，报告荧光设定为fam，淬灭荧光设置为none。