检测玉米基因组中SNP的多态性的物质在鉴定玉米镉含量中的应用的制作方法

本发明涉及植物分子生物技术领域，具体涉及检测玉米基因组中snp的多态性的物质在鉴定玉米镉含量中的应用。

背景技术：

随着工农业的发展，工业三废排放、矿产开采、电池乱扔以及农药、化肥的大量使用，导致部分土壤和水体的镉含量剧增。镉通过食物链在动植物和人体内累积，造成不可逆的毒害效应，严重危及人类健康。镉中毒还可导致肾脏、骨骼、肺等器官的损害，引起各种急慢性疾病，如肾结石、‘痛痛病’、肺炎等。玉米是是世界上重要的粮食兼饲料作物，种植面积广泛，截至2017年播种面积已达到4239.9万hm²，其在国民经济发展中的作用不可或缺。土壤镉污染问题对玉米等粮食作物的安全生产构成严重威胁，玉米等粮食作物的安全问题与人类健康息息相关。如何利用现有农田，种植玉米镉低积累品种，保障农作物玉米生产安全，有效阻断重金属镉进入食物链迫在眉睫。目前需要有效鉴别玉米镉积累性状的分子辅助手段。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是如何鉴定或辅助鉴定玉米的镉积累性状或如何鉴定或辅助鉴定玉米籽粒的镉含量或如何进行玉米育种。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了检测玉米基因组中zmcd10-kasp-158410625的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定玉米镉含量产品中的应用。所述zmcd10-kasp-158410625是玉米基因组的一个snp位点，为序列表中seqidno.1的第333位核苷酸，其为t或c。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了检测玉米基因组中zmcd10-kasp-158410625的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定玉米镉含量产品中的应用。所述zmcd10-kasp-158410625是玉米基因组的一个snp位点，为序列表中seqidno.1的第333位核苷酸，其为t或c。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了检测玉米基因组中zmcd10-kasp-158410625的多态性或基因型的物质在玉米育种或制备玉米育种产品中的应用。所述zmcd10-kasp-158410625是玉米基因组的一个snp位点，为序列表中seqidno.1的第333位核苷酸，其为t或c。

所述玉米镉含量可为玉米籽粒镉含量。所述玉米可为玉米自交系。

所述snp位点zmcd10-kasp-158410625的基因型可为tt、cc或tc。基因型tt是zmcd10-kasp-158410625为t的纯合型。基因型cc是zmcd10-kasp-158410625为c的纯合型。基因型tc是zmcd10-kasp-158410625为t和c的杂合型。所述snp分子标记位点的基因型为基因型tt的玉米的籽粒镉含量低于或候选低于所述snp分子标记位点的基因型为基因型cc的玉米。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种产品，所述产品为含有上述检测玉米基因组snp分子标记位点的多态性或基因型的物质的产品。可为下述g1)-g3)中的任一种：

g1)检测玉米镉含量相关的单核苷酸多态性或基因型的产品；

g2)鉴定或辅助鉴定玉米镉含量的产品；

g3)用于玉米育种的产品。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种鉴定或辅助鉴定玉米镉含量的方法，包括检测待测玉米中上述snp分子标记位点的基因型，根据所述待测玉米的snp分子标记位点的基因型鉴定或辅助鉴定玉米镉含量。所述snp分子标记位点的基因型为基因型tt的玉米的籽粒镉含量低于或候选低于所述snp分子标记位点的基因型为基因型cc的玉米。

上述方法在玉米育种中的应用也属于本发明的保护范围。

上文所述待测玉米为玉米自交系。上文所述应用中，选择玉米的自交系作为亲本进行育种。

上述玉米育种为培育低镉含量玉米或选育镉含量低的玉米品种。上文所述玉米镉含量具体可为玉米籽粒中的镉含量。

上述应用、方法中，所述检测snp位点的多态性或基因型的物质，可为通过下述至少一种方法确定上述玉米基因组中snp位点的核苷酸种类：dna测序、限制性酶切片段长度多态性、单链构象多态性、变性高效液相色谱和snp芯片。其中，snp芯片包括基于核酸杂交反应的芯片、基于单碱基延伸反应的芯片、基于等位基因特异性引物延伸反应的芯片、基于“一步法”反应的芯片、基于引物连接反应的芯片、基于限制性内切酶反应的芯片、基于蛋白dna结合反应的芯片，及基于荧光分子dna结合反应的芯片。

上述应用或方法或产品中，所述snp位点的多态性或基因型的物质，可为如下d1)、d2)或d3):

d1)含有扩增包括所述snp分子标记位点在内的玉米基因组dna片段的pcr引物；

d2)含有d1)所述pcr引物的pcr试剂；

d3)含有d1)所述pcr引物或d2)所述pcr试剂的试剂盒。

上述pcr引物可为下述h1或h2：

h1、由序列表中seqidno.2所示的单链dna、序列表中seqidno.3所示的单链dna和序列表中seqidno.4所示的单链dna组成的引物组；

h2、由核苷酸序列是序列表中seqidno.2的第22-41位的单链dna、核苷酸序列是序列表中seqidno.3的第22-39位的单链dna和序列表中seqidno.4所示的单链dna组成的引物组。

上述应用或方法或产品中，所述pcr引物可被标记物标记也可不被标记物标记。所述标记物指可用于提供可检测的效果且可以连接至核酸的任何原子或分子。标记物包括但不限于染料；放射性标记，诸如³²p；结合部分，诸如生物素(biotin)；半抗原，诸如地高辛(dig)；发光、发磷光或发荧光部分；和单独的荧光染料或与可以通过荧光共振能量转移(fret)抑制或移动发射光谱的部分组合的荧光染料。标记可以提供可通过荧光、放射性、比色、重量测定、x射线衍射或吸收、磁性、酶活性等检测的信号。标记可以是带电荷的部分(正电荷或负电荷)或可选地，可以是电荷中性的。标记可以包括核酸或蛋白序列或由其组合，只要包含标记的序列是可检测的。在一些实施方案中，核酸在没有标记的情况下直接检测(例如，直接读取序列)。

上述应用或方法或产品中，所述产品可为试剂或试剂盒或系统，所述系统可包括试剂或试剂盒、仪器和分析软件的组合产品，如由pcr引物、parmsmastermix试剂、酶标仪和在线软件snpdecoder(http://www.snpway.com/snpdecoder01/)组成的产品，由pcr引物、parmsmastermix试剂、在线软件snpdecoder和荧光定量pcr仪组成的组合产品。所述产品可包括上述检测玉米基因组中所述snp位点的多态性或基因型的物质。

上述应用、方法或产品中，所述镉含量低的玉米品种中的镉含量是相对于杂交亲本玉米而言。如果两个杂交亲本玉米的镉含量相同，所述低镉含量玉米品种的镉含量可等于或低于杂交亲本玉米的镉含量；如果两个杂交亲本玉米的镉含量不相同，所述低镉含量玉米品种的镉含量可等于或低于两个杂交亲本玉米中镉含量较高的杂交亲本玉米。

本发明的实施例中，通过对玉米自交系关联群体中zmcd10基因的遗传变异分析，发现1个snp位于玉米基因组中与镉含量相关的基因zmcd10基因中，名称为zmcd10-kasp-158410625，即序列表seqidno.1的第333位。通过实验证明，在188份玉米自交系品种中，96.24％的snp基因型tt的玉米品种籽粒镉含量均低于0.1mg/kg，85.45％的snp基因型cc的玉米品种籽粒镉含量均高于0.1mg/kg，snp分子标记位点的基因型为基因型tt的玉米的籽粒镉含量低于或候选低于所述snp分子标记位点的基因型为基因型cc的玉米。说明该snp可用于玉米育种及低镉玉米品种的选育。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中188份玉米自交系关联群体由华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室玉米组严建兵的实验室提供，该关联群体的详细信息见已发表的文章(yangetal.,2011)，其种质资源可从maizego网站获取(http://www.maizego.org/)，品种详细信息如表1所示。

实施例1、zmcd10-kasp-158410625是与玉米籽粒镉含量相关基因的snp分子标记

一、188份玉米自交系关联群体的籽粒镉含量检测

2018年在中国湖南湘乡市，在镉含量为1.820mg/kg的农田土壤中种植188份玉米自交系关联群体种质资源，采用随机完全区组设计，试验小区长3m、宽2m，种植3行，每行10株，株距0.3m，行距0.65m，正常灌溉。待完全成熟后，全部收获，得到玉米籽粒，测定籽粒中镉积累量(镉含量)。实验包含三个重复，每个重复操作步骤如下：(1)消解前的样品处理：将玉米籽粒80℃烘干至恒重，使用震动球磨仪进行粉碎；(2)准确称取样品0.2g(精确到0.0001g)放入玻璃管中，尽量不要让样品沾到试管的壁上；(3)在通风橱内加入3ml硝酸，封口预消化过夜；(4)第二天在试管口放上小漏斗，放入电热消解炉中加热9h，仪器全程温度为200℃；(5)取出后放置至冷却，然后将消解管中的样品加入蒸馏水定容至50ml；(6)摇匀过滤至10ml塑料离心管，待测。每个样品测量三次重复，三次重复的平均值作为该样品镉含量的最终结果。采用icp-ms测定籽粒中镉积累量(镉含量)，具体结果如(表1)所示。

二、玉米镉含量相关snp分子标记zmcd10-kasp-158410625的发现

使用上述188份有代表性的自交系构成的关联群体，根据玉米自交系籽粒中的镉含量和其全基因组测序结果(由华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室玉米组严建兵实验室提供)，筛选出一个与玉米籽粒镉含量相关的snp位点，该snp标记位于玉米自交系第2号染色体第158410625位(b73参考玉米基因组序列(refgen_v2))，其所在的基因命名为zmcd10，将该snp位点命名为zmcd10-kasp-158410625，其核苷酸为t或c，对应于序列表中seqidno.1的第333位，该位点对应氨基酸的序列可为亮氨酸(l)或丝氨酸(s)，该位点对表型的解释率为48.04％(表3)。序列表中seqidno.1的y表示t或c。

各个玉米品种的基因型检测结果如表1所示。结果显示snp分子标记位点zmcd10-kasp-158410625有2种基因型，即tt、cc或tc，基因型tt是zmcd10-kasp-158410625位点为t的纯合型，基因型cc是zmcd10-kasp-158410625位点为c的纯合型，基因型tc是zmcd10-kasp-158410625位点为t和c的杂合型。

三、玉米籽粒镉含量显著关联snp分子标记zmcd10-kasp-158410625的应用

3.1引物设计

设计snp分子标记zmcd10-kasp-158410625特异的引物序列(序列表中seqidno.2，seqidno.3和seqidno.4)，用于检测snp核苷酸的种类，引物序列由中玉金标记(北京)生物技术股份有限公司合成。引物序列是包括两条特异性正向引物f1和f2和一条通用引物r的引物组，序列如下：

特异引物f1(seqidno:2)：

5’-gaaggtgaccaagttcatgctcgccgtcgttgtcggttgtt-3’

特异引物f2(seqidno:3)：

5’-gaaggtcggagtcaacggattccgtcgttgtcggttgtc-3’

通用引物r(seqidno:4)：

5’-ggagggaaagtcaacaggagaacat-3’

上述引物f1中下划线序列为fam序列；f2中下划线序列为hex序列。

上述序列seqidno.2与seqidno.4所示的单链dna分子扩增snp位点为t的片段，用酶标仪或荧光定量pcr仪可读取到模板中与fam序列结合的荧光基团的荧光信号；

上述序列seqidno.3与seqidno.4所示的单链dna分子扩增snp位点为c的片段，用酶标仪或荧光定量pcr仪可读取到模板中与hex序列结合的荧光基团的荧光信号。

3.2dna提取和pcr扩增

从表1的188份玉米品种的叶片中提取基因组dna，加ddh2o溶解作为模板用于pcr扩增。使用3.1所示的引物组进行pcr扩增，然后将扩增产物交由中玉金标记(北京)生物技术股份有限公司进行检测，确定snp分子标记位点zmcd10-kasp-158410625的核苷酸的种类，确定各个玉米品种该snp分子标记位点的基因型。具体为利用酶标仪或荧光定量pcr仪对3.1中的引物组扩增的pcr产物进行荧光数据读取，用在线软件snpdecoder(http://www.snpway.com/snpdecoder01/)进行荧光信号处理。若pcr产物显示只有与fam序列结合的荧光基团的荧光信号，则所述待测玉米snp位点的基因型为tt(即玉米基因组中snp位点为t的纯合型)；若显示只有与hex序列结合的荧光基团的荧光信号，则所述待测玉米snp位点的基因型为cc(即玉米基因组中snp位点为c的纯合型；若显示既有与fam序列结合的荧光基团的荧光信号又有与hex序列结合的荧光基团的荧光信号，则所述待测玉米snp位点的基因型为tc(即玉米基因组中snp位点为t和c的杂合型)。玉米基因组中snp位点zmcd10-kasp-158410625的基因型是tt、cc或tc。基因型tt是zmcd10-kasp-158410625为t的纯合型；基因型cc是zmcd10-kasp-158410625为c的纯合型；基因型tc是zmcd10-kasp-158410625为t和c的杂合型。各个玉米品种的基因型检测结果如表1所示。

3.3玉米籽粒镉含量测定

测定方法同步骤一，结果如表1所示。

通过对188份玉米品种籽粒镉含量的测定结果和3.2中各个玉米品种snp分子标记位点的基因型的检测结果进行分析表明，188份玉米品种中，snp分子标记位点zmcd10-kasp-158410625核苷酸种类为t的品种玉米籽粒镉含量均值显著低于该位点为c的玉米品种均值。188份玉米品种中，133个玉米品种的snp分子标记位点zmcd10-kasp-158410625的基因型为tt，55个玉米品种的snp分子标记位点zmcd10-kasp-158410625的基因型为cc(表2)。133个基因型tt的玉米品种中，有128个基因型tt的玉米品种籽粒镉含量均低于0.1mg/kg；55个基因型cc的玉米品种中，有47个基因型cc的玉米品种籽粒镉含量均高于0.1mg/kg。96.24％的基因型tt的玉米品种中籽粒镉含量均低于0.1mg/kg，85.45％的基因型cc的玉米品种籽粒镉含量均高于0.1mg/kg(食品安全国家标准gb2762-2017)，这表明该位点zmcd10-kasp-158410625作为snp分子标记用于玉米籽粒镉含量辅助选择是切实有效的。

综上，玉米基因组snp分子标记位点zmcd10-kasp-158410625的核苷酸种类为t或c，该位点对玉米籽粒镉含量表型的解释率为48.04％(表3)。96.24％的基因型为tt的玉米品种中籽粒镉含量均低于0.1mg/kg，85.45％的基因型cc的玉米品种籽粒镉含量均高于0.1mg/kg，snp位点的基因型为tt的玉米的籽粒镉含量低于或候选低于基因型为cc的玉米，说明本发明的zmcd10-kasp-158410625是玉米籽粒镉含量相关的snp分子标记。zmcd10-kasp-158410625位点的发现可用于玉米籽粒镉积累的早期预测和筛选，也可用于玉米分子标记辅助选择育种和低镉玉米品种的选育。在实际生产中，可以选择玉米基因组中该snp位点核苷酸种类为t(对应基因型为tt)的玉米作为亲本进行育种。

表1、188份玉米自交系的籽粒镉含量和zmcd10-kasp-158410625的基因型

表2、按zmcd10-kasp-158410625的基因型统计的188份玉米自交系的籽粒镉含量

表3、snp位点对表型的解释率

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110>中国科学院植物研究所

<120>检测玉米基因组中snp的多态性的物质在鉴定玉米镉含量中的应用

<130>gncsq201488

<160>4

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>3557

<212>dna

<213>玉米（zeamays）

<400>1

gattcgatactaaaagtctgattctaatatctatggtaccatccacatcttttcaaaaac60

catcgtcgaatattttgcattcctaccactcatgagcgaagggttgattattcattttga120

actgagcgtaaaatggtttcaaagaaggaagtgggcaaagtggaggtgaccagcaagtca180

agtctgaatgaaaagtcgaaagtatggaatgggtgcctcgatgatgtcagcgtgtccacc240

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<210>2

<211>41

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>2

gaaggtgaccaagttcatgctcgccgtcgttgtcggttgtt41

<210>3

<211>39

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>3

gaaggtcggagtcaacggattccgtcgttgtcggttgtc39

<210>4

<211>25

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>4

ggagggaaagtcaacaggagaacat25

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