一种前列腺癌circRNA标志物及其应用的制作方法

本发明涉及生物医药
技术领域：
，尤其是涉及一种前列腺癌circrna标志物及其应用。
背景技术：
：前列腺癌(prostaticcancer,pca)是一种常见的恶性肿瘤，其发病率及死亡率高峰在70岁左右,占全球肿瘤发病率第二位、死亡率第六位。2016年，美国约有180890例新发病例，26120例死亡病例。然而，前列腺癌却具有明显的种族差异性。仅在美国，非裔美国人前列腺癌的发病率是白种人的2倍；此外，其在亚洲的发病率也明显低于西方国家。因此，针对前列腺癌，亟待开展不同种族内的基因组学分析。前列腺癌具有强烈的个体差异性，不同病人对相同治疗方案的反应相差甚远。一些病人可在诊断后生存10多年，但也有些病人仅仅生存2-3年。因此，用于探索前列腺癌基因、基因表型异质性以及前列腺癌进展中信号通路变化的研究便起着举足轻重的作用。近年来，随着靶向测序、拷贝数变异以及全基因组测序技术的发展，前列腺癌基因景观研究也取得了重大突破。已有大量研究揭示了一些前列腺癌相关的基因组学改变，如：最常见的tmprss2-erg基因融合、8q拷贝数增多和原癌基因dna重组(chromoplexy)等等。然而，这些基因组学改变所引起的结果却尚不明确。外显子测序技术已经揭示了部分在编码区域的特异性基因改变，发现了一些高频突变基因，如：spop、foxa1、tp53、pten以及其他在pik3ca/b、zbtb16/plzf和ar的基因组学改变。近年来，尽管在北京、上海、香港等医学、经济发达城市，前列腺癌发病率显著升高，亚洲人群前列腺癌基因组研究却仍在起步之中。因此，亟需开展相应的基因组学研究，进而更为全面的掌握前列腺癌的分子病理学，以便更好地指导临床工作。前列腺癌根治术是目前临床局限性前列腺癌的标准治疗手段，但10年内术后生化复发率高达30％。前列腺特异抗原psa、gleason评分、病理分期等指标对于术后生化复发的预测效果在特异度和敏感度上都较低，因此，临床亟需更加准确的预测术后生化复发的生物学标记物，从而对患者复发风险进行细化分层，并精准地为高危患者提供辅助治疗以改善预后。环状rna(circrna)是一种由5’端和3’端反向拼接而成的非编码rna，具有结构稳定、分布广泛的特点，并有着显著的时空特异性。大量研究表明circrna可通过多种机制参与动物生长发育调控，疾病肿瘤等的发生和发展。许多circrna与肿瘤的发生、分化程度、tnm分期、复发转移等具有明显关联，而鉴于其分布广泛性和较高的稳定性，更有潜力成为肿瘤临床诊断的生物学标志物。技术实现要素：本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种前列腺癌circrna标志物及其检测该标志物的试剂和试剂盒，本发明提供的circrna标志物具有很高的特异性和灵敏性，并且所述的circrna标志物在患者的前列腺癌组织和癌旁组织中存在表达差异，因此可作为新型的生物标志物用于前列腺癌的检测。为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种前列腺癌circrna标志物，所述标志物为circ_30029、circ_117300、circ_176436、circ_112897、circ_178252、circ_115617、circ_14736和circ_17720。本发明首次研究出上述8组circrna标志物的表达水平跟前列腺癌根治术后生化复发的关系，为判别前列腺癌患者根治术后生化复发风险提供新的参考指标，使得能较为清楚地区分高低危生化复发的临床前列腺癌患者并且医生可根据患者的情况及早作出干预。经实施例3实时定量pcr扩增实验可知，前列腺癌circrna标志物circ_30029、circ_117300、circ_176436、circ_112897、circ_178252的高表达与更高生化复发相关，前列腺癌circrna标志物circ_115617、circ_14736circ_17720的低表达与更快生化复发相关。作为本发明所述前列腺癌circrna标志物的优选实施方式，所述circrna标志物的主基因分别为stk39抗体、mkln1抗体、slc22a3抗体、acsm1抗体、asph抗体、ptpn13抗体、oma1抗体和rere抗体。本发明还提供了一种检测上述前列腺癌circrna标志物的试剂在制备前列腺癌产品中的应用。作为本发明所述应用的优选实施方式，所述试剂包括特异性扩增的circ_30029、circ_117300、circ_176436、circ_112897、circ_178252、circ_115617、circ_14736和circ_17720的引物。作为本发明所述应用的优选实施方式，所述circ_30029的引物序列为seqno:1和seqno:2所示；所述circ_117300的引物序列为seqno:3和seqno:4所示；所述circ_176436的引物序列为seqno:5和seqno:6所示；所述circ_112897的引物序列为seqno:7和seqno:8所示；所述circ_178252的引物序列为seqno:9和seqno:10所示；所述circ_115617的引物序列为seqno:11和seqno:12所示；所述circ_14736的引物序列为seqno:13和seqno:14所示和所述circ_17720的引物序列为seqno:15和seqno:16所示。作为本发明所述应用的优选实施方式，所述试剂还包括反转录pcr和定时定量pcr检测如上述的前列腺癌circrna标志物的试剂。作为本发明所述应用的优选实施方式，所述反转录pcr检测前列腺癌circrna标志物的试剂包括4×gdnawiper、5×hiscriptiiqrtsupermix和rnasefreeddh2o；所述定时定量pcr检测前列腺癌circrna标志物的试剂包括4×gdnawiper、5×hiscriptiiqrtsupermix、2×sybrgreenmastermix和rnasefreeddh2o。作为本发明所述应用的优选实施方式，所述产品包括芯片、试剂盒或核酸膜条。作为本发明所述应用的优选实施方式，所述产品为试剂盒。本发明还提供分别提供了上述8组circrna标志物的试剂和试剂盒，其中本发明的试剂包括特异性扩增的circ_30029、circ_117300、circ_176436、circ_112897、circ_178252、circ_115617、circ_14736和circ_17720的引物、反转录pcr和定时定量pcr检测试剂，可以准确地检测出所筛选的上述8组circrna标志物的含量；并且本发明的试剂盒操作简单、快速，检测灵敏度和特异性高，可达到对选定临床样本进行定性及半定量检测，无需其他特殊仪器，临床样本保存时间长，一般医院实验室或者病理室都可以完成。与现有技术相比，本发明具有以下的有益效果：本发明首次发现了本发明提供的8组circrna标志物的表达水平与前列腺癌生化复发相关，为判别前列腺癌患者根治术后生化复发风险提供新的参考指标，且本发明提供的前列腺癌circrna标志物具有较高的特异性和敏感性；本发明提供检测上述circrna标志物的试剂及试剂盒，为衡量前列腺癌生化复发风险提供参考指标。附图说明图1为采用lassocox回归分析筛选本发明8组前列腺癌circrna标志物的示意图；图2为采用kaplan-meier法分析本发明8组前列腺癌circrna标志物与前列腺癌生化复发之间的关系示意图；图3为采用kaplan-meier法分析144位患者circrna风险得分与前列腺癌生化复发之间的关系示意图；图4为rt-qpcr检测本发明8组前列腺癌circrna标志物在前列腺癌与癌旁组织中的表达水平示意图。具体实施方式为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。在以下实施例中，前列腺癌及癌旁组织来自于广州医科大学附属肿瘤医院及广州市第一人民医院。实施例1、前列腺癌circrna标志物的筛选1.circrna数据来源及获取本发明采用的circrna测序数据及相应的临床信息来自于geneexpressionomnibus(geo)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)数据库中的gse113124，其中包含144位前列腺癌根治术后的患者。2.前列腺癌circrna标志物的筛选在circrna表达矩阵中，以fpkm>1作为标准挑选出546个目标circrna。前列腺癌生化复发作为指标，用于构建circrna预测模型。利用‘survival’and‘survminer’r包针对546个circrna进行logistic回归分析，获取p<0.05的28组circrna。利用lassocox回归及交叉验证进一步对28组circrna进行降维，最终获得8组circrna。绘制8组目标circrna(circ_30029；circ_117300；circ_176436；circ_176436；circ_112897；circ_178252；circ_115617；circ_14736；circ_17720)与bcr关系的kaplan-meier(km)曲线，其p值分别为：0.0064、0.011、0.015、0.023、0.0032、0.035、0.0038、0.0049。3.构建预测模型使用lassocox回归系数作为模型的系数，构建预后模型公式(参考图1a)：riskscore(rs)＝(-0.0637*expressionlevelofcirc_30029)+(-0.0991*expressionlevelofcirc_117300)+(-0.0015*expressionlevelofcirc_176436)+(-0.0185*expressionlevelofcirc_112897)+(-0.0187*expressionlevelofcirc_17720)+(0.0809*expressionlevelofcirc_115617)+(0.0027*expressionlevelofcirc_14736)+(0.0906*expressionlevelofcirc_178252)。4.circrna预测模型评估circrna模型基于10折交叉验证lasso回归方法(参考图1b)获得，并由kaplan-meier曲线及auc曲线评价。使用kaplan-meier曲线绘制风险得分与生化复发之间的关系，进一步使用roc曲线及多因素方差分析评价circrna模型、psa、gleason评分、病理t分期。根据上述模型公式计算144名病人的风险得分，并根据风险得分的中位数将病人分为高风险得分组与低风险得分组。根据图3a的结果显示，在kaplan-meier曲线中，高风险得分组较低风险得分组更易出现生化复发，其p值小于0.0001。根据图3b的结果显示，roc曲线及多因素方差分析评价circrna模型、psa、gleason评分、病理t分期，其auc值分别为0.799、0.557、0.626、0.569；多因素分析p值分别为<0.001、0.072、0.522、0.042。实施例2、检测前列腺癌circrna标志物引物设计和试剂盒设计本实施例采用实施例1筛选得到的8组前列腺癌circrna标志物(包括circ_30029、circ_117300、circ_176436、circ_112897、circ_178252、circ_115617、circ_14736和circ_17720)。本实施例中采用circprimer引物设计软件设计，分别根据circbase及circpediav2提供的序列：hsa_circ_0005882、hsa_circ_0001747、hsa_circ_0078607、hsa_circpedia_130167、hsa_circ_0084615、hsa_circ_0007324、hsa_circ_0000072、hsa_circ_0009117、内参选用gapdh，引物设计后由天一辉远公司合成。①当前列腺癌circrna标志物为circ_30029时，特异性扩增circ_30029的引物(如seqidno.1和seqidno.2所示)如下所示：正向引物：tctctgtgcacgactctcag；反向引物：tggctctttgggctatgtct；扩增长度为201bp。②当前列腺癌circrna标志物为circ_117300时，特异性扩增circ_117300的引物(如seqidno.3和seqidno.4所示)如下所示：正向引物：attgcactggaacatcccat；反向引物：agcaggcctttcgagcttta；扩增长度为130bp。③当前列腺癌circrna标志物为circ_176436时，特异性扩增circ_176436的引物(如seqidno.5和seqidno.6所示)如下所示：正向引物：ctccccgttggctgattact；反向引物：tgacgatcctgccatacctg；扩增长度为225bp。④当前列腺癌circrna标志物为circ_112897时，特异性扩增circ_112897的引物(如seqidno.7和seqidno.8所示)如下所示：正向引物：ctgcagaggttgaaagcgc；反向引物：agctgtcttctctgggtcac；扩增长度为107bp。⑤当前列腺癌circrna标志物为circ_178252时，特异性扩增circ_178252的引物(如seqidno.9和seqidno.10所示)如下所示：正向引物：tgctgatggtgatggagattt；反向引物：ctacagatgtccagacgccc；扩增长度为158bp。⑥当前列腺癌circrna标志物为circ_115617时，特异性扩增circ_115617的引物(如seqidno.11和seqidno.12所示)如下所示：正向引物：tgacagcctttatcaagtggt；反向引物：ggtggtagaggggaaggatt；扩增长度为210bp。⑦当前列腺癌circrna标志物为circ_14736时，特异性扩增circ_14736的引物(如seqidno.13和seqidno.14所示)如下所示：正向引物：ggcagcaaatggagttcgtt；反向引物：ttcttgttaggaggaagtgcc；扩增长度为158bp。⑧当前列腺癌circrna标志物为circ_17720时，特异性扩增circ_17720的引物(如seqidno.15和seqidno.16所示)如下所示：正向引物：tggatgcctggagttaacga；反向引物：ggtcacacaaagcaggagtt；扩增长度为205bp。本发明还提供一种检测上述8组circrna标志物表达水平的试剂盒。试剂盒包括上述正向、反向引物，反转录pcr试剂和定时定量pcr试剂。所述反转录pcr检测前列腺癌circrna标志物的试剂包括4×gdnawiper、5×hiscriptiiqrtsupermix和rnasefreeddh2o；所述定时定量pcr检测前列腺癌circrna标志物的试剂包括4×gdnawiper、5×hiscriptiiqrtsupermix、2×sybrgreenmastermix和rnasefreeddh2o。实施例3、提取待检组织样本rna、反转录pcr和定时定量pcr1.提取待检组织样本rna1)取新鲜组织，切成小块(50-100mg；)2)将组织块放入盛有液氮的研钵中；3)用研棒磨碎组织，使其成粉末状；4)研磨过程中液氮挥发完后需及时补充，使样品一直处于冷冻状态，防止rna降解；5)将研磨完毕的组织粉末转移至rnasefree离心管中，按50-100mg组织/mltrizol的比例加入适当体积的trizol，控制组织体积不超过trizol体积的10％；6)室温放置10min以充分裂解(或转入-80℃长期保存)；7)按200μl/mltrizol加入氯仿，剧烈震荡30s，室温放置10min；8)4℃12000rpm离心15min；9)吸取上层水相于另一新的rnasefree离心管中(此步骤严禁吸取中间层成分)；10)4℃12000rpm离心10min，弃上清，rna沉于管底；11)加入1ml75％乙醇，温和震荡离心管，悬浮沉淀；12)4℃10000rpm离心5min，尽量弃上清，并放于室温干燥5min；13)加入适量depc水(20-50μl)溶解沉淀，nanodrop测量rna质量及浓度(od＝1.8-2.0)，样品可随即反转录或放于-80℃长期保存。2.反转录pcr合成cdna具体步骤如下：3.实时荧光定量pcr本实施例采用bio-radcfx96pcr仪，采用2-δδct法及进行数据相对定量分析。实时荧光定量pcr反应体系：试剂名称使用量2×qpcrsybrgreenmastermix5μlforwardprimer(10μm)0.5μlreverseprimer(10μm)0.5μlcdna1μlrnasefreeddh2o3μltotal10实时荧光定量pcr反应程序：4.实验结果实时定量pcr(rt-qpcr)扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应的扩增效率相近；基线平行物上扬现象，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；根据实时定量pcr的相对定量公式：2-δδct，比较circ_30029、circ_117300、circ_176436、circ_112897、circ_17720、circ_178252、circ_115617、circ_14736在前列腺癌组织中的表达水平，前5个在前列腺癌组织中表达降低，后3个在前列腺癌组织中表达升高，分别如图2中a至h。参考图4，rt-qpcr检测本发明8组前列腺癌circrna标志物在前列腺癌与癌旁组织中的表达水平，通过本发明筛选得到的8组前列腺癌circrna标志物可作为新型的生物标志物用于前列腺癌的检测。最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。sequencelisting<110>南方医科大学珠江医院<120>一种前列腺癌circrna标志物及其应用<130>2020.10.10<160>16<170>patentinversion3.5<210>1<211>20<212>dna<213>circ_30029的正向引物<400>1tctctgtgcacgactctcag20<210>2<211>20<212>dna<213>circ_30029的反向引物<400>2tggctctttgggctatgtct20<210>3<211>20<212>dna<213>circ_117300的正向引物<400>3attgcactggaacatcccat20<210>4<211>20<212>dna<213>circ_117300的反向引物<400>4agcaggcctttcgagcttta20<210>5<211>20<212>dna<213>circ_176436的正向引物<400>5ctccccgttggctgattact20<210>6<211>20<212>dna<213>circ_176436的反向引物<400>6ctccccgttggctgattact20<210>7<211>19<212>dna<213>circ_112897的正向引物<400>7ctgcagaggttgaaagcgc19<210>8<211>20<212>dna<213>circ_112897的反向引物<400>8agctgtcttctctgggtcac20<210>9<211>21<212>dna<213>circ_178252的正向引物<400>9tgctgatggtgatggagattt21<210>10<211>20<212>dna<213>circ_178252的反向引物<400>10ctacagatgtccagacgccc20<210>11<211>21<212>dna<213>circ_115617的正向引物<400>11tgacagcctttatcaagtggt21<210>12<211>20<212>dna<213>circ_115617的反向引物<400>12ggtggtagaggggaaggatt20<210>13<211>20<212>dna<213>circ_14736的正向引物<400>13ggcagcaaatggagttcgtt20<210>14<211>21<212>dna<213>circ_14736的反向引物<400>14ttcttgttaggaggaagtgcc21<210>15<211>20<212>dna<213>circ_17720的正向引物<400>15tggatgcctggagttaacga20<210>16<211>20<212>dna<213>circ_17720的反向引物<400>16ggtcacacaaagcaggagtt20当前第1页1 2 3 

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