一种检测EZH2基因可变剪切位点突变的引物、试剂盒及应用的制作方法

2021-02-02 17:02:30|

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本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及一种检测ezh2基因可变剪切位点突变的引物、试剂盒及应用。

背景技术：

人类ezh2(enhancerofzestehomolog2)基因是果蝇zeste基因增强子的同源基因，共覆盖76,939bp，包括20个外显子和19个内含子。ezh2基因编码的蛋白属于多梳家族(pcg)成员，可以催化组蛋白h3第27位赖氨酸三甲基化(h3k27me3)，调节染色体结构是其主要作用。ezh2与pcg家族成员相互结合形成多聚蛋白复合物，这种复合物涉及维持世代细胞间基因的转录抑制状态。pcg蛋白作为转录抑制因子直接调控涉及分化、发育、细胞命运和干细胞自我更新的基因表达，参与x染色体失活，在肿瘤发生中起着关键调控作用。pcg基因是一进化高度保守基因，包括prc1和prc2两种多聚复合物，在生物胚胎发育过程中，通过形成多蛋白复合物，作用于染色体不同位点，致使染色体变构，从而调控基因表达，维持基因抑制和起始基因的沉默。其中，ezh2蛋白是prc2重要亚基，具有催化活性，在进化过程显示高度的保守性，对于细胞分化和增殖都非常重要。

一个mrna前体可以通过选择不同的剪切位点产生多种mrna剪切异构体，这一过程称为可变剪切或选择性剪切。可变剪切是调节基因表达和产生蛋白质组多样性的重要机制，是导致真核生物基因和蛋白质数量较大差异的重要原因。可变剪切涉及蛋白功能的改变，例如，改变蛋白质的氨基端或羧基端、或者增删了某个功能区域等。人类ezh2正常转录会产生两种主要的剪切体：转录变异体1，mrna长2,695bp，编码蛋白异构体a含751个氨基酸；转录变异体2，mrna长2,563bp，编码蛋白异构体b含707个氨基酸。可变剪切是基于对剪切位点的识别基础上，由被称为剪切体的核酸蛋白复合物完成的。这预示：当剪切位点发生突变，或者其他因素影响剪切体的形成时，就会影响外显子拼接。利用前期基因测序数据和生物信息计算，发明人发现位于ezh2基因3号外显子上247位g是重要的剪切位点，如果g碱基突变为c碱基则会使3号外显子发生部分缺失，影响dna结合结构域的形成，从而会使ezh2蛋白的生物学功能发生变化。

tetra-primerarmspcr，即四引物扩增受阻突变体系pcr(tetra-primeramplificationrefractorymutationsystempcr)，是检测dna序列变化的经典方法之一。本发明利用tetra-primerarmspcr首次实现了对新发现的ezh2可变剪切位点(247位g>c)的检测，具有快速、简便、以及费用低廉等特点。利用这种简便的方法首次实现了对ezh2基因可变剪切位点快速、准确的鉴定。

技术实现要素：

本发明是在研究ezh2可变剪切分子机制并发现存在一种新的可变剪切位点的基础上，首次研发了tetra-primerarmspcr技术，提供了一种检测ezh2可变剪切位点的引物、试剂盒及其应用。本发明提供了用于检测人类ezh2基因可变剪切的引物，特异性强，准确率高。本发明还提供了包括上述质控样品和pcr反应液预混液，检测方便快速，操作简单，结果易读，适用范围广。

根据本发明的第一方面，提供了一种检测ezh2基因可变剪切位点基因型的引物组，包括从5’端到3’端序列分别为seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3和seqidno:4的引物；其中seqidno:1所示序列的引物为扩增ezh2基因野生型和突变位点的上游引物，seqidno:2所示序列的引物为扩增ezh2基因野生型和突变位点的下游引物，seqidno:3所示序列的引物为对ezh2基因3号外显子247位野生型可变剪切位点进行特异性识别的引物，seqidno:4所示序列的引物为对ezh2基因3号外显子247位突变型可变剪切位点进行特异性识别的引物。

按照本发明的另一方面，提供了包括所述的检测ezh2基因可变剪切位点基因型的引物组。

优选地，还包括质控样品和pcr反应液预混液。

优选地，所述质控样品为ezh2基因可变剪切位点为野生型、单突变型和双突变型的dna质粒。

优选地，所述pcr反应液预混液为pcr缓冲液、mgcl2、dntps和taq酶。

按照本发明的另一方面，提供了任一所述的试剂盒用于检测ezh2基因可变剪切位点基因型的应用，包括以下步骤：

(1)待测样本和质控样品的制备：提取待测样本dna；对已经鉴定为野生型、单突变型和双突变型ezh2的样品，通过pcr扩增得到含有目的剪切位点的dna片段，将其构建到pmd18-t载体上；

(2)pcr扩增反应：将步骤(1)中的待测样本dna，以及含有野生型、单突变型和双突变型ezh2的载体分别进行pcr扩增反应，所述pcr扩增反应采用的引物均为seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3和seqidno:4所示序列的引物组；以双蒸水为阴性对照，以野生型质粒为野生型对照，以单突变质粒为杂合子对照，以双突变质粒为纯合子对照，获得pcr产物；

(3)琼脂糖凝胶电泳鉴别待测样本ezh2可变剪切位点的基因型：步骤(2)所述的野生型对照在379bp和319bp处有电泳片段，杂合子对照在379bp、319bp和123bp处有电泳片段，纯合子对照在379bp和123bp处有电泳片段；将待测样本dna的pcr扩增产物的电泳片段与野生型对照、杂合子对照和纯合子对照进行比较，得到待测样本dna的ezh2基因可变剪切位点基因型。

优选地，步骤(2)中所述pcr扩增反应的条件为95℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s和72℃延伸30s，循环30个周期后于72℃充分延伸5min。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，本发明首次建立了检测ezh2可变剪切位点的arms-pcr方法，主要具备以下的技术优点：

(1)特异性强：设计的通用引物能特异性扩增含有剪切位点dna片段，设计的arms引物能特异性识别ezh2第247位碱基g/c，两组引物之间两两反应的退火温度和扩增长度互不干扰，适用于琼脂糖凝胶电泳分析，检测结果易读可靠，检测成功率为100％。

(2)操作简便：引物合成成本很低，该检测方法不依赖特异性限制性内切酶识别位点而进行限制性消化，不需要同位素或其他标记物进行标记。

(3)易于推广：pcr扩增结合琼脂糖凝胶电泳检测的操作能简单地在装备程度较低的实验室中实施，不需要昂贵的激光诱导性荧光检测设备，极大地加速了分析过程，同时减少了不必要的费用和工作量。

附图说明

图1为tetra-primerarms-pcr检测正常人血液样品ezh2可变剪切位点的电泳图。

图2为tetra-primerarms-pcr检测肺癌病人血液样品ezh2可变剪切位点的电泳图。

图3为测序检测肺癌病人血液ezh2可变剪切位点的峰图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

本发明一种检测ezh2基因可变剪切位点基因型的引物，包括：

扩增包含ezh2基因野生型和突变位点的通用引物对：上游引物5’-actatagtgtaaaatctatatgcacctaagaaaatgttctt-3’(seqidno:1)，下游引物5’-ggacaccctgaggtcaatgatttcc-3’(seqidno:2)；

对ezh2基因3号外显子247位g碱基(野生型可变剪切位点)进行特异性识别的arms引物：

5’-ccaaaagatgatgataattactacaacatgttatgttaaccaac-3’(seqidno:3)；

对ezh2基因3号外显子247位c碱基(突变型可变剪切位点)进行特异性识别的arms引物：5’-attgcgcgggactagggagc-3’(seqidno:4)。

上述这些引物用于制备检测ezh2基因3号外显子247位g碱基突变为c碱基的试剂。

本发明设计了四条引物，包括两条用于ezh2基因扩增野生型和突变型可变剪位点的pcr通用引物，一条用于扩增ezh2基因247位为野生型可变剪切位点g碱基的arms引物，一条用于扩增ezh2基因247位为突变型可变剪切位点c碱基的arms引物(在3’末端倒数第一位增加一个错配的碱基，错配方式为g-c互换)；利用pcr通用引物、arms引物，使用pcr反应液预混液，对野生型、单突变和双突变的质控样品进行pcr反应，根据pcr产物电泳图谱鉴定ezh2基因可变剪切位点的基因型。

所述pcr通用引物对由上游引物和下游引物组成，上游引物为5’-actatagtgtaaaatctatatgcacctaagaaaatgttctt-3’(seqidno:1)，下游引物为5’-ggacaccctgaggtcaatgatttcc-3’(seqidno:2)，扩增片段长度为379bp；所述野生型arms引物为5’ccaaaagatgatgataattactacaacatgttatgttaaccaac-3’(seqidno:3)，与上游引物5’-actatagtgtaaaatctatatgcacctaagaaaatgttctt-3’(seqidno:1)组成扩增ezh2基因野生型可变剪切位点的pcr引物对，扩增片段长度为319bp；所述突变型型arms引物为5’-attgcgcgggactagggagc-3’(seqidno:4)，与下游引物的5’-ggacaccctgaggtcaatgatttcc-3’(seqidno:2)组成扩增ezh2基因突变型可变剪切位点的pcr引物对，扩增片段长度为123bp。

根据pcr产物电泳结果可以准确鉴别ezh2基因可变剪切位点的基因型：野生型在379bp和319bp有两个电泳片段，杂合突变型在379bp、319bp和123bp处有三个电泳片段，纯合突变型在379bp和123bp处有两个电泳片段。上游引物(seqidno:1)和下游引物(seqidno:2)为剪切位点两臂扩增引物。arms引物为剪切位点基因型鉴定引物。当野生型检测引物(seqidno:3)3’末端碱基落在野生型碱基g的位置上则出现319bp电泳片段，说明至少一个等位基因为野生型；当突变型检测引物(seqidno:4)3’末端碱基落在突变型碱基c的位置上则出现123bp电泳片段，说明至少一个等位基因为突变型。

本发明的检测ezh2247位可变剪切位点的具体过程为：

(1)提取待测样本dna

提取样品dna，作为pcr模板。

(2)质控样品的制备

对已经鉴定为野生型、单突变型、双突变型ezh2的样品，通过pcr扩增得到含有目的剪切位点的dna片段，将其与pmd18-t载体进行ta克隆，构建出含pcr产物片段的重组质粒，测序结果显示重组质粒的插入的片段序列与genbank报道的序列一致，说明本发明已经成功构建了重组质粒，可以将其作为检测ezh2可变剪切位点的质控样品。

(3)arms-pcr扩增反应

运用两组引物，进行pcr反应，以ddh2o为阴性对照，以野生型质粒为野生型对照，以单突变质粒为杂合子对照，以双突变质粒为纯合子对照，获得四组pcr产物。以20μl总体积中进行pcr扩增为例，基因组dna约50ng为模板；其他pcr反应成份及其浓度为常规浓度，dntp各5mm，引物各5μm，10×buffer(包含50mmkcl，10mmtris-hcl，0.1mmedta)，50mmmgcl2及0.5urtaqdna聚合酶(takara公司)；pcr反应参数，95℃预变性5min，94℃30s，55℃30s和72℃30s，循环30个周期后于72℃充分延伸5min。

(4)琼脂糖凝胶电泳鉴别样品ezh2可变剪切位点的基因型

按常规操作进行，每份pcr扩增产物5μl与适量上样缓冲液混合后，上样于2％琼脂糖凝胶(含0.5mg/l核酸染料)，使用0.5×tbe电泳缓冲液(45mmtris-硼酸，1mmedta，ph8.0)，于120v电压下恒压电泳30min后，紫外灯下观察结果，根据电泳图结果确定ezh2可变剪切位点的基因型，基因型结果由质控样品(野生型质粒，单突变质粒，双突变质粒)反应确定。

实施例1：用本发明的方法检测ezh2可变剪切位点

提取正常人血液基因组dna，用表1引物特异性扩增ezh2包含247位可变剪切位点dna片段：

表1检测ezh2可变剪切位点的pcr扩增引物

制备pcr反应体系(20μl)，其中包含dna模板1μl，2.5μl10×buffer，2μldntp(2.5mmeach)，2μlmgcl2(25mm)，4条引物均为(10μm)0.5μl，taqdna聚合酶0.5u(takara)。在eppendorf扩增仪上进行pcr反应，温度设置参数：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃5min；4℃保存。取5μlpcr产物于2％琼脂糖tbe胶上电泳，紫外凝胶成像系统显示电泳图谱。部分样本的电泳结果如图1所示。

图1中的1号和2号泳道为正常人血液ezh2可变剪切位点的基因型，分别为杂合子突变和野生型。3号泳道为单突变质控品，4号泳道为双突变质控品，5号泳道为野生型质控品。

检测结果与预期一致，所有样品都得到一条379bp(seqidno:1，seqidno:2扩增得到)的参照片段，野生型剪切位点(seqidno:1，seqidno:3)扩增得到一条319bp特异性片段，双突变和单突变的剪切位点(seqidno:2，seqidno:4)都会扩增得到一条123bp的特异性片段。

实施例2：本发明方法与测序法检测肺癌ezh2基因可变剪切位点的比较

从肿瘤医院搜集100例肺癌血液标本，采用血液dna提取试剂盒完成。

按照实施例1配置20μlpcr反应体系，野生型ezh2质粒作为野生型对照，ddh2o作为阴性对照，突变型质粒作为阳性对照，将反应管放入pcr仪内，记录样本摆放顺序，循环条件设置为95℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃30s，30次循环，75℃5min。

琼脂糖凝胶电泳鉴别样品ezh2可变剪切位点基因型，每份pcr扩增产物5μl，与适量上样缓冲液混合后分别加至2％琼脂糖凝胶，使用0.5×tbe电泳缓冲液，于12v/cm电压下恒压电泳30min后，利用紫外凝胶成像系统下观察电泳图谱，结合质控样品电泳结果，分析待检测样品ezh2可变剪切位点的碱基类型。部分样本的电泳结果如图2所示。

图2中的1、2和6号泳道为杂合子突变血液样本，7和8号泳道为野生型血液样本。3号泳道为单突变质控品，4号泳道为双突变质控品，5号泳道为野生型质控品。

ezh2基因可变剪切位点的测序分析，待检样本的pcr反应体系中只加入上下游通用引物，不加入arms引物，经pcr扩增后将扩增产物直接交由商业化测序公司完成测序。三种基因型的测序结果如图3所示。图3中的左图为野生型血液样本(箭头指示为单峰g碱基)，中图为杂合型血液样本(箭头指示为双峰g/c碱基)，右图为纯合突变型血液样本(箭头指示为单峰c碱基)。

统计分析两种方法检测ezh2基因可变剪切位点的准确率：100例肺癌样品中经arms法得到纯合子突变型样品14例(电泳图谱显示为379，123两条带)，经测序法检测全部为阳性结果；经arms法得到杂合子突变型样品32例(电泳图谱显示为379，319，123三条带)，经测序法检测全部为阳性结果；经arms法得到野生型样品54例(电泳图谱显示为379，319两条带)，经测序法检测全部为阴性结果。arms法和测序法检测ezh2基因可变剪切位点基因型的结果如表2所示。

表2.arms法和测序法检测ezh2基因可变剪切位点的比较

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>华中科技大学

<120>一种检测ezh2基因可变剪切位点突变的引物、试剂盒及应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>41

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1