耐乙酸乳杆菌特异性检测探针、试剂盒和应用的制作方法

2021-02-02 17:02:16|

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本发明涉及啤酒有害菌检测领域，特别是涉及一种耐乙酸乳杆菌特异性检测探针、试剂盒和应用。

背景技术：

啤酒具有特有的理化性质，当处于低温缺氧环境、ph值较低、含有苦味物质、微生物生长所需的营养物质含量少等环境下，具有抵抗一般微生物侵袭的作用。尽管如此，啤酒厂环境中仍生存着一些耐酸、耐酒花苦味物质和专性厌氧的微生物，它们利用酵母的中间代谢产物和酵母自溶物，给啤酒生产带来危害。

目前，啤酒厂中的啤酒腐败菌通常为厌氧或兼性厌氧的微生物，主要包括乳酸杆菌属(lactobacillussp)、果胶杆菌属(pectinatussp)、巨球菌属(megasphaerasp)、片球菌属(pediococcussp)、发酵单胞菌属(zymomonassp)和微球菌属((micrococcussp)等。乳酸菌是引起啤酒腐败最常见的微生物，约90％的啤酒污染是由乳酸菌引起的。大部分乳酸菌属革兰氏阳性兼性厌氧球菌和革兰氏阳性无芽抱杆菌，在有氧和无氧条件下均能生长，且适合在酸性环境下生长。乳酸菌对啤酒花有一定的抗性，会引起啤酒酸度下降、风味变差，更为严重是还会影响啤酒酵母的生长，使啤酒发酵无法正常进行。

耐乙酸乳杆菌(lactobacillusacetotolerans)是2012年，由广州珠江啤酒股份有限从腐败啤酒中新发现的一类腐败菌，该类菌最早在米醋发酵液中被发现过，但是在啤酒被发现尚属首次，国内暂时还未发现有成熟的检测研究方法和检测手段，更没有可以对该菌进行特异性检测的试剂盒。由于该菌对产品质量造成不良影响，研究该菌的菌株特性及开发其特异性检测试剂盒对啤酒酿造行业的食品安全具有十分重要意义。我们研究发现，该菌为革兰氏阳性菌，不产生孢子，大小0.4～0.5×1.1～3.4μm，单个、成对或短链，暗视场强折光，不运动，一般可以承受4％-5％的醋酸含量，属于兼性厌氧菌，同型发酵型，过氧化氢酶阴性，氧化酶阴性。该菌可在苦味值≤5bu啤酒中生长，能使啤酒变浑浊，属于啤酒的二次污染菌。该菌生长缓慢，在nbb培养基上生长14天以上才肉眼可见，其适宜在ph3.3～6.6，23-40℃下生长，低于15℃不生长。由于耐乙酸乳杆菌生长缓慢、难培养的特性，其在啤酒中潜伏期较长，不易被发现，如果发现不及时，可能导致酒体被严重污染，造成严重的后果。因此，行业内亟需建立一种对耐乙酸乳杆菌的快速检测技术。

目前，检测啤酒腐败菌的方法分为传统培养法和分子鉴定法，传统培养法包括培养基检测法、生化微量管发酵法等，分子鉴定法包括16srdna分子测序、普通pcr法、real-timepcr法、pcr-elisa等。针对上述难培养啤酒腐败菌耐乙酸乳杆菌的pcr特异检测探针和试剂盒的检测效率和检测灵敏度也有待提高。

技术实现要素：

基于此，有必要针对上述问题，提供一种耐乙酸乳杆菌特异性检测探针，用于检测啤酒腐败菌耐乙酸乳杆菌，具有特异性强、检测周期短、检测限低、灵敏度极高的优点。

一种耐乙酸乳杆菌特异性检测探针，所述探针针对seqidno.1所示序列设计。

本发明的探针是针对seqidno.1所示序列设计，对应ap014808.1:1564884-1565303，保守假定蛋白，该序列具有高度保守性，针对该序列设计的特异性检测探针yw1，能精确、快速、准确地检测啤酒腐败菌耐乙酸乳杆菌，对于阳性单菌样品和混合菌均表现出极其特异的阳性检测结果。

在其中一个实施例中，所述耐乙酸乳杆菌特异性检测探针的引物序列如下所示：

f：5’-ccagccttcaaggtggttgtct-3’(seqidno.2)，

r：5’-cgattgaaagttggtcaatcaggact-3’(seqidno.3)。

本发明一方面还提供一种耐乙酸乳杆菌的检测方法，包括以下步骤：

1)提取样本dna；

2)向步骤1)中的样本dna中加入权利要求1或2所述的检测特异性检测探针、2×mixpcr预混液和水；

3)进行实时荧光定量pcr反应。

在其中一个实施例中，所述水选用无菌水。

在其中一个实施例中，所述步骤2)构建的反应体系中，dna的终浓度是0.02～0.03ng/μl，上游引物终浓度为150～250nm，下游引物终浓度为150～250nm，pcr预混液的终浓度为1×mix。

在其中一个实施例中，所述步骤3)中实时荧光定量pcr反应的条件为：

变性：94～96℃预变性4～6min；

循环：94～96℃，14～16s；59～61℃，29～31s，28～32个循环；

双重退火：94～96℃，14～16s；59～61℃，14～16s；94～96℃，29～31s；59～61℃，14～16s；

保温：59～61℃，6～8min。

在其中一个实施例中，所述步骤3)中实时荧光定量pcr反应的条件为：

变性：95℃预变性5min；

循环：95℃，15s；60℃，30s，30个循环；

双重退火：95℃，15s；60℃，15s；95℃，30s；60℃，15s；

保温：60℃，7min。

本发明另一方面还提供一种耐乙酸乳杆菌特异性检测试剂盒，包括上述检测特异性检测探针。

该检测试剂盒，采用上述特异性检测探针yw1，该试剂盒能在48小时内检测出致啤酒腐败的耐乙酸乳杆菌，检测限低至3.0×10¹cfu/ml。

本发明另一方面还提供一种上述耐乙酸乳杆菌特异性检测试剂盒在检测啤酒中耐乙酸乳杆菌中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明优化了荧光定量pcr扩增体系和反应条件，并对耐乙酸乳杆菌的特异性探针进行定性和定量检测，本发明测定了耐乙酸乳杆菌的生长曲线，确定耐乙酸乳杆菌的od值、菌落数与生长时间之间的关系，并在此基础上建立了耐乙酸乳杆菌菌体数量与标准提取方法所提取的基因组dna量的对应关系方程，其回归方程为y＝-3.259x+31.11，r²＞0.997，dna浓度在0.00002ng/μl～20ng/μl，对应菌的数量级在101～107个时，所建立的标准曲线具有很高的线性，满足后续对标的需要。

本发明的特异性探针在实时荧光定量pcr中，检测耐乙酸乳杆菌的重复性和再现性rsd均小于5％，在检测的精度内回收率为100％，检出限低至3.0×10¹cfu/ml，检测精度为10¹cfu整体检出时间也缩短到48小时以内，实现了对耐乙酸乳杆菌的快速检出。

本发明的检测方法可以快速、准确地对啤酒有害菌耐乙酸乳杆菌进行定性定量检测，提前预测污染菌对啤酒的腐败能力，大大提高了检测效率，及时为生产提供指导性信息，具有推广价值。此方法适用于啤酒厂成品酒污染菌的快速检验，能够大大加快检测速度。除了对成品啤酒和半成品啤酒进行检测外，还可以利用该方法检测发酵液，对啤酒发酵过程中的微生物污染进行及时的监控。本发明建立的针对耐乙酸乳杆菌的sop检测方法在啤酒中将会有广阔的应用前景。

附图说明

图1为实施例中电泳结果图；

图2为根据pangenome构建的耐乙酸乳杆菌系统进化树；

图3为实施例中啤酒耐乙酸乳杆菌的定性检测结果图；

图4为实施例中耐乙酸乳杆菌在nbb-b培养基中的颜色变化情况图；

图5为实施例中耐乙酸乳杆菌培养时间与菌体密度以及菌落计数的关系图；

图6为实施例中耐乙酸乳杆菌不同浓度梯度dna标准样品的检测情况图；

图7为实施例中耐乙酸乳杆菌不同浓度梯度的dna定量标准曲线图；

图8为实施例中耐乙酸乳杆菌不同dna浓度各三个平行上机测试情况图；

图9为实施例中耐乙酸乳杆菌不同dna浓度各三个平行上机测试1标准曲线图；

图10为实施例中使用耐乙酸乳杆菌dna测试探针回收率的rt-pcr扩增曲线图；

图11为实施例中使实施例试剂盒检测的混合体系耐乙酸乳杆菌的情况图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

实施例1

1、耐乙酸乳杆菌及主要啤酒腐败菌的分子生物学鉴定

采用gb4789或atcc标准菌株及在珠江啤酒分离到的耐乙酸乳杆菌cn247为测试菌株，分别提取10株啤酒腐败菌的dna，测定其dna浓度，dna浓度如表1所示，电泳结果如图1所示。从结果看，提取的dna情况良好。

表1.提取的10株啤酒腐败菌dna的浓度(ng/μl)

所有样品的dna送至华大基因公司测序后，序列经过在ncbi上进行比对，结果如表2所示：

表2.啤酒厂分离鉴定到的主要啤酒腐败菌

从鉴定结果看，10株啤酒腐败菌主体菌是乳杆菌属，是啤酒的主要污染菌。耐乙酸乳杆菌是首次在啤酒中筛选到。

2、耐乙酸乳杆菌特异性引物的筛选与合成

根据在ncbi上查找到的唯一一株耐乙酸乳杆菌全基因组完成图(由本课题组完成)测序结果，根据遗传距离经pangenome比对分析，建立了珠江啤酒分离株cn247的系统进化树(见图2)。从遗传图谱可见，两株啤酒腐败菌bm-la14527和cn247与其他分离源(食醋、酒醅等)的耐乙酸乳杆菌具有不同的进化趋势，而来自啤酒的两株腐败菌耐乙酸乳杆菌具有相同的进化趋势。

根据以上结果，对pangenome中差异显著的基因进行了差异显著性分析。筛选出了一个编码预测蛋白的耐乙酸乳杆菌特异性基因，该基因在来自啤酒的耐乙酸乳杆菌中存在，而不存在与其他来源的耐乙酸乳杆菌中。

在ncbi上下载该基因序列后，根据其编码基因利用primer6.0设计特异性分值最高的引物对，经与ncbi中序列比对后确认了其特异性。并以其作为啤酒腐败菌耐乙酸乳杆菌的定性和定量验证的靶基因。

根据该基因序列信息，合成该特异性引物，表3列出了引物序列的碱基信息、片段长度和对应的预测功能信息。将引物分别与阴性对照、耐乙酸乳杆菌模板dna和混合菌dna进行pcr扩增，显示该探针只对耐乙酸乳杆菌进行特异性扩增。

表3.耐乙酸乳杆菌特异性探针对应的序列信息

3、pcr扩增体系和反应条件优化

优化反应体系和反应条件的目的是在保证准确率的情况下提高检测灵敏度，缩短反应时间，使开发的方法和后续试剂盒可以满足啤酒厂实时检测的需要。优化主要包括两部分，分别是反应体系的优化和反应条件的优化。

1)反应体系优化：

确定引物合格后，进一步对反应体系进行优化。优化内容主要包括：(1)反应体系优化；(2)引物量优化；(3)模板量等因素，通过多次上机测试，不同的反应体系，不同的引物量和模板量，最终确定的反应体系如表4所示。该反应体系使啤酒腐败菌耐乙酸乳杆菌的单菌检出限降低为8.5×10¹cfu/ml，将检测限降低了一个数量级，极大增加了检测的灵敏度。

表4.优化后的反应体系

2)反应条件优化：

通过尝试不同的反应条件，结果显示在较高退火温度下可以避免引物二聚体和非特异性扩增，确定退火温度为60℃；循环数过多也会引起非特异性扩增，确定循环数为30个。同时，根据扩增片段的长度，将退火时间由最初的1分钟缩短至30秒；根据实验结果，将预变性的时间由最初始的10分钟缩减至5分钟，从而再保证检测结果的前提下极大缩短了检测时间。最终确定能够特异性扩增耐乙酸乳杆菌并在熔解曲线产生单一锐利峰图的反应条件如下所示：

表5.优化后的反应条件

4、耐乙酸乳杆菌特异性探针定性检测

验证该特异性引物对三种样品进行了检测。为模拟实际生产样品，分别将是耐乙酸乳杆菌cn247、其它9株菌的混合物以及cn247与其它9株啤酒腐败菌共同混合后接入成品啤酒中形成三个待检样品。通过上述步骤对目标基因进行扩增，扩增结果以获得目标片段熔解曲线是否有单一尖锐峰图；ct值是否正确为标准。

图3为啤酒耐乙酸乳杆菌的定性检测结果，左图为检测的熔解曲线，右图为检测的ct值。图中检测结果表明，以啤酒腐败菌耐乙酸乳杆菌为模板的单菌检测和将该菌与其它9种菌混合样本(10种菌)的检测结果均可特异性的检测出靶基因，而其它不包含啤酒腐败菌耐乙酸乳杆菌cn247的样本没有的到阳性结果。实验结果表明，本发明使用的引物对于珠江啤酒中发现的耐乙酸乳杆菌具有高度专一性，可用于对珠江啤酒中的耐乙酸乳杆菌进行特异性检测。

5、耐乙酸乳杆菌特异性探针定量检测的实验设计及研究

1)耐乙酸乳杆菌生长标曲的绘制

表6.耐乙酸乳杆菌菌悬液计数结果

2)耐乙酸乳杆菌生长情况

用10ml移液枪将nbb-b培养基分别分装于试管中，同时将耐乙酸乳杆菌原菌悬液稀释10倍后，按照1:75的比例接种多支平行试验管，第一天每隔6h各取3支平行管进行检测菌液的od600nm，拍照跟踪耐乙酸乳杆菌的生长情况，如图4所示。确定的耐乙酸乳杆菌的生长曲线如图5所示。

耐乙酸乳杆菌cn247原菌液以1:750接种于15mlnbb-b液体中，接种量为4.7×10⁵个/ml时，跟踪确定其生长曲线，接种两天后为生长较慢为延滞期，第三天开始进入快速对数生长期，培养液中的菌落数在72h左右达到10⁸个/ml，试管中的菌悬液出现轻微的变色，80h左右时颜色明显变黄，培养至90h后菌悬液中的菌体密度持续上升接近于稳定期，培养至98h菌悬液中的菌落数达到最大值为3.2×10⁹个/ml。继续培养，虽然菌悬液的菌体密度仍有少量增幅，但是菌体开始进入衰亡期，菌落数开始出现下降，至第5天开始菌体密度出现下降与平板上菌落数的减少出现一致的趋势。

3)耐乙酸乳杆菌定量检测的标准曲线

配制耐乙酸乳杆菌不同梯度的dna标准样品：根据耐乙酸乳杆菌的生长曲线，培养三天后得到菌悬液为1×10⁸个/ml的样品，提取基因组dna后，测得dna总量为194ng/μl，配制的耐乙酸标准dna的样品如表7所示。

表7.耐乙酸乳杆菌绘制标准曲线所用标准dna样品及其浓度对应关系

4)耐乙酸乳杆菌不同梯度dna标准样品的检测情况

利用啤酒腐败菌耐乙酸乳杆菌建立标准曲线时，不同菌量对应的扩增循环数和对应的熔解温度图如图6所示，左图为扩增曲线图，右图为熔解曲线图。耐乙酸乳杆菌不同浓度梯度的基因组dna定量标准曲线如图7所示。

从rt-pcr检测结果看，7个不同梯度的标准dna样品以及混合样品均能扩增出来，且熔解曲线有单一尖锐的峰图，说明检测结果有效。利用不同梯度的耐乙酸乳杆菌基因组dna绘制标准曲线，其对应的回归方程y＝-3.259x+31.11，r²＞0.997，表明dna浓度为0.0002ng/μl-20ng/μl，对应菌的数量级在10¹个至10⁷个时，所建立的标准曲线具有很高的线性，满足后续对标的需要，由标准曲线的扩增曲线可看出，10倍数量级差的dna样品之间，扩增曲线上的ct值相差3个循环左右，显示出差异性。相同数量级的样品，虽然菌体总数不同，但是在标曲上ct差值非常接近，差异性较小。故耐乙酸乳杆菌探针的标曲的精度为菌体数量级，而非菌体的准确个数。

5)耐乙酸乳杆菌特异性探针准确性验证

随机选取3名实验室人员，每人重复操作3次，使用本发明的耐乙酸乳杆菌特异性探针yw1，验证定量标准曲线的重复性和再现性。测试结果见图8-9，图8中左图为扩增曲线图，右图为熔解曲线图。测试标准曲线斜率的重复性rsd均在5％以内，三人制作标准曲线的再现性rsd为2.94％，在5％的合格范围内，说明标准曲线的重复性和再现性良好，可以用于实际的检测。另外，考虑pcr每趟机的最大检测容量及测试的精度，建议上机制作标准曲线时每个梯度做3-4个平行样，既能降低人为误差，又能得到比较理想的标曲，得到的标准曲线为y＝-3.263x+32.61(如图9所示)。

6)回收率验证

使用提取的耐乙酸乳杆菌的基因组dna，按照标准曲线sop的操作要求，10倍稀释成不同梯度的标准样品，然后以dna浓度0.02ng/μl的样品作为基底，分别添加将不同浓度dna的样品进行等体积混合后，作为回收率检测的样品，每个样品上机时做三个平行，检测的结果如图10和表8所示。

表8.使用标准dna上机测试探针回收率的情况

使用不同浓度的标准dna样品混合后，测试的耐乙酸乳杆菌探针的回收率，从测试结果看，加标后的样品结果在耐乙酸乳杆菌定量标准曲线的范围内，加标回收率为100％，表明探针回收率很好。

7)耐乙酸乳杆菌特异性探针最低检出限及检出时间的研究

耐乙酸乳杆菌cn247原始浓度8×10⁷个/ml的原液使用nbb-b进行10倍梯度逐级稀释后，三个梯度分别进行平板计数(如表9)，26℃厌氧培养2天，再对各梯度的菌种管进行平板计数(如表10)，确定样品培养前后的菌体浓度。

表9.cn247样品培养前的平板计数结果(个/ml)

表10.cn247样品nbb-b厌氧培养1.5天后的平板计数结果(个/ml)

以上结果表明，稀释倍数与平板检测结果一致。说明稀释准确，满足后续定量要求。

取10ml菌液用艾基的试剂盒提取基因组dna，然后分别用特异性探针在pcr进行检测，结果如表11所示。

表11.不同梯度cn247培养1.5天后的菌液使用特异性探针pcr测试结果

备注：“+”表示结果正常，判定为阳性

real-timepcr定量检测结果如图11所示，检测结果表明，分别从预培养1.5天不同梯度的耐乙酸乳杆菌样品中，各10ml菌样提取的dna，使用新开发的探针及反应体系和程序在pcr中可全部检测出来(如表12所示)。根据培养前4号样稀释10⁸的cn247菌落为1个/ml，在提取dna时由于使用10ml菌液，故上机检测出来4号样品对应的菌体量为10¹个菌。因此，本发明的特异性探针对耐乙酸乳杆菌的最低检出限也为3×10¹个菌，这与建立标准曲线时的使用的最低浓度的dna(0.000002ng/μl)对应生长曲线的菌体生长量10¹个的最低检出限一致。富集培养1.5天能满足pcr检测需求，整个检出时间达到2天以内。

8)试剂盒组装

本试剂盒包括：啤酒腐败菌检测的特异性探针一对，反应体系和反应条件一套，检测标准结果判断标准一套。该试剂盒用于对啤酒腐败菌耐乙酸乳杆菌的特异性检测。探针序列yw1：

f：5’-ccagccttcaaggtggttgtct-3’(seqidno.2)，

r：5’-cgattgaaagttggtcaatcaggact-3’(seqidno.3)。

反应体系如表4所示，反应条件如表5所示。

检测判断标准：使用组装的快速检测试剂盒，按照上述反应体系和反应条件进行rt-pcr，可唯一检出耐乙酸乳杆菌，即扩增的ct值在31个循环以内，且有扩增曲线，熔解曲线上在80～81℃有单一尖锐的峰图，例如图11所示。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110>广州南沙珠江啤酒有限公司

中国食品发酵工业研究院有限公司

<120>耐乙酸乳杆菌特异性检测探针、试剂盒和应用