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您当前的位置： 重症肌无力诊断用试剂的制作方法
2021-02-02 17:02:51|
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起点商标网 本发明属于生物
技术领域：
：，涉及重症肌无力诊断用试剂。
背景技术：
：：重症肌无力(mg)是一种自身抗体介导，t细胞依赖性，补体和细胞因子参与，累及神经肌肉接头(neuromuscularjunction,nmj)突触后膜的获得性自身免疫性疾病，年平均发病率为(8.0～20.0)/10万人，各年龄段均可发病(gilhusne.myastheniagravis.nengljmed.2016；375(26):2570-81.)。该病可累及全身骨骼肌，包括眼外肌、咽肌、四肢及躯干肌肉，出现眼睑下垂、视物重影、吞咽困难及肢体乏力，甚至出现呼吸困难，严重者可危及生命。其典型的症状为骨骼肌易疲劳，晨轻暮重或活动后加重，休息可减轻，多数对抗胆碱酯酶抑制剂有效，其发病机制尚不清楚(dalakasmc.novelfuturetherapeuticoptionsinmyastheniagravis.autoimmunrev.2013ju1；12(9):936-41.)。大约10％-20％眼肌型mg患者可自愈，大约20-30％眼肌型mg患者终身局限于眼外肌而不进展，在其余的患者中，多数可能在起病3年内会累及延髓和四肢肌肉，逐渐发展成全身型mg，大约2/3的mg患者会在发病后的1年内达到疾病严重程度的高峰，约20％的mg患者在发病1年内发生mg危象(davidg,normanb,tatsujin,etal.lifetimecourseofmyastheniagravis.musclenerve.2010；37(2):141-9.)。在如手术、创伤、精神应激、感染、发热、女性怀孕、分娩、使用影响重症肌无力的药物或合并其他自身免疫性疾病等情况下，mg患者的肌无力症状有可能加重。mg的免疫发病机制复杂，可能因素包括遗传倾向、环境因素、t细胞和b细胞的协同作用、辅助性t细胞(helpertcell,th)/调节性t细胞的失衡、细胞因子和抗体分泌的异常以及补体系统的激活等。mg的早期诊断对于治疗具有重要的意义。肠道菌群是肠道系统的重要组成部分，人类在长期进化的过程中与肠道菌群形成了互利共生的关系。一旦饮食习惯、环境因素改变，肠道感染或其他因素导致肠道内微生物的种类组成和数量发生改变时，就会打破机体与肠道菌群之间的动态平衡状态，导致肠道微生态失调，机体的各方面功能出现紊乱，从而引起疾病的发生(jandhyalasm,talukdarr,subramanyamc,etal.roleofthenormalgutmicrobiota[j].worldjgastroenterol,2015,21(29):8787-8803.)。因此维持肠道菌群的动态平衡对机体的生理健康尤为重要。研究与重症肌无力相关的肠道菌群，探究其在重症肌无力发生发展过程中的作用，为重症肌无力的诊断和治疗提供新的思路。技术实现要素：本发明的目的在于提供与重症肌无力发生发展相关的肠道菌群及其在诊断和治疗重症肌无力中的应用。为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：本发明提供了用于检测菌群丰度的试剂在制备用于预测重症肌无力的产品中的用途，所述菌群选自肠道菌种pyramidobacter_piscolens、lachnospiraceae_bacterium_2_1_46faa、helicobacter_cinaedi或clostridium_bartlettii的任意一种或几种。进一步，所述菌群选自pyramidobacter_piscolens、lachnospiraceae_bacterium_2_1_46faa、helicobacter_cinaedi或clostridium_bartlettii的任意两种或几种。进一步，所述试剂包括与来自pyramidobacter_piscolens、lachnospiraceae_bacterium_2_1_46faa、helicobacter_cinaedi或clostridium_bartlettii的靶核苷酸序列特异性杂交的寡核苷酸。进一步，pyramidobacter_piscolens、lachnospiraceae_bacterium_2_1_46faa、helicobacter_cinaedi或clostridium_bartlettii的靶核苷酸序列是菌种特异性基因区域的片段的靶核苷酸序列是菌种特异性基因区域的片段。进一步，所述寡核苷酸被可检测地标记。进一步，所述重症肌无力为儿童重症肌无力。本发明提供了一种诊断重症肌无力的产品，所述产品包括检测样本中pyramidobacter_piscolens、lachnospiraceae_bacterium_2_1_46faa、helicobacter_cinaedi或clostridium_bartlettii的丰度的试剂。进一步，所述试剂包括与来自pyramidobacter_piscolens、lachnospiraceae_bacterium_2_1_46faa、helicobacter_cinaedi或clostridium_bartlettii的靶核苷酸序列特异性杂交的寡核苷酸。进一步，pyramidobacter_piscolens、lachnospiraceae_bacterium_2_1_46faa、helicobacter_cinaedi或clostridium_bartlettii的靶核苷酸序列是菌种特异性基因区域的片段。进一步，所述寡核苷酸被可检测地标记。进一步，所述寡核苷酸包括特异性识别pyramidobacter_piscolens、lachnospiraceae_bacterium_2_1_46faa、helicobacter_cinaedi或clostridium_bartlettii的靶核苷酸序列的探针或特异性扩增pyramidobacter_piscolens、lachnospiraceae_bacterium_2_1_46faa、helicobacter_cinaedi或clostridium_bartlettii的靶核苷酸序列的引物。进一步，所述扩增是pcr或rt-pcr，优选的，所述扩增利用可检测的被标记的引物。本发明提供了微生物标志物在制备治疗重症肌无力的药物中的应用，所述微生物标志物选自pyramidobacter_piscolens、lachnospiraceae_bacterium_2_1_46faa、helicobacter_cinaedi或clostridium_bartlettii的任意一种或几种。进一步，所述药物包括增加pyramidobacter_piscolens、lachnospiraceae_bacterium_2_1_46faa、helicobacter_cinaedi或clostridium_bartlettii丰度的试剂。附图说明图1是α多样性和β多样性分布的小提琴图；其中，a-c是基于shannon指数的α多样性在门(a)、属(b)和种(c)水平上的分布图；d-f是基于bray-curtis距离的β多样性在门(d)、属(e)和种(f)水平上的分布图。图2是所有参与者在不同分类水平的相对丰度的pcoa，其中图a-f分别是在门、纲、目、科、属、种分类水平的相对丰度的pcoa，红点和蓝色三角形分别代表mg和hc。图3是pyramidobacter_piscolens的丰度情况图。具体实施方式为了评估肠道共生菌群组成能否作为重症肌无力的预测因子，本发明通过收集重症肌无力患者和健康人的样本，进行全基因组测序以及使用生物信息学进行测序数据的统计，发现与疾病相关的肠道菌群，将肠道菌群与疾病信息整合，最大程度预测重症肌无力患者。本发明通过全基因组测序，首次发现了pyramidobacter_piscolens、helicobacter_cinaedi或clostridium_bartlettii在重症肌无力患者和健康人中呈现显著性差异，并通过差异菌群的联合诊断分析，发现pyramidobacter_piscolens与helicobacter_cinaedi或clostridium_bartlettii联合应用于重症肌无力的诊断具有较高的效能。在本发明的实施方式中，本发明通过以下步骤来诊断重症肌无力：在来自个体的核酸样本中，检测与重症肌无力的诊断相关的菌种所对应的一个或多个核酸片段。在特定的实施方式中，检测对应于pyramidobacter_piscolens、helicobacter_cinaedi或clostridium_bartlettii的核酸片段。在实施本文描述的方法中，使用分子生物学、蛋白质生物化学、细胞生物学、免疫学、微生物学和重组dna方面的很多传统技术，这些技术是公知的。下文提供了本说明书中使用的一些术语的定义。除非另有说明，本文中使用的所有技术和科学用语通常具有和本发明所属领域的普通技术人员通常理解的意思相同的意思。本申请所用的术语“探针”是指长度为10至285个碱基对的合成的或生物学上产生的核酸，其含有允许在预定条件下与目标核酸序列特异性优先杂交的特异性核苷酸序列，并且可选地含有用于检测或提高试验性能的部分。通常需要最少10个核苷酸以在统计学上获得特异性并形成稳定的杂交产物，并且最多285个核苷酸通常代表可以容易调节反应参数以测定错配序列和优先杂交的长度上限。探针可以可选地含有某些成分，这些成分在某些试验条件下有助于该探针适当起作用或起到最佳作用。例如，可以修饰探针以提高其对核酸酶降解的抗性(例如，通过封端)，携带检测配体(例如荧光素)或便于该探针在固体支持物上进行捕获(例如聚脱氧腺苷“尾巴”)。本申请所用的术语“引物”是指可用于扩增方法(例如聚合酶链反应，“pcr”)以扩增核苷酸序列的寡核苷酸。引物基于特定目标序列的多核苷酸序列(例如一个特异性16srdna序列)来设计。引物和探针的设计和验证是本领域公知。本申请所用的术语“特异性”意指核苷酸序列将与预定的目标序列杂交/扩增预定的目标序列杂交，并且在试验条件(通常使用严格条件)下不会实质性地与非目标序列杂交/扩增非目标序列杂交。本申请所用的术语“杂交”是指这样的方法：通过该方法，在预定的反应条件下，使两条部分或完全互补的核酸链以反向平行方式聚合而形成具有特异性和稳定性的双链核酸，其遵循与核酸碱基可以彼此配对的明确规则。术语“严格的杂交条件”意指约35℃至65℃且约0.9mol的nacl盐溶液。严格性还可以由如存在于杂交溶液中的离子种类的浓度和类型、存在的变性剂的类型和浓度、以及杂交温度这些反应参数来控制。一般地，随着杂交条件变得更加严格，如果要形成稳定的杂交物，则优选较长的探针。一般说来，杂交发生的条件的严格性将决定要使用的优选探针的某些特征。本领域公知用于测量目标核酸序列的量的分子生物学方法。这些方法包括但不限于端点pcr、竞争性pcr、逆转录酶-pcr(rt-pcr)、定量pcr(qpcr)、逆转录酶qpcr(rt-qpcr)、pcr-焦磷酸测序、pcr-elisa、dna微阵列、原位杂交试验如斑点印迹或荧光原位杂交试验(fish)、分支dna以及所述方法的多重版本。优选的引物和/或探针以可预测的方式来进行反应，典型地通过对细菌核酸序列的增量提供直接线性响应。通过制备适当标准并与其比较，可以容易地量化样品中给定核酸序列的量。优选地，所述用于基因定量的所述分子方法选自定量聚合酶链反应(qpcr)、pcr-焦磷酸测序、荧光原位杂交(fish)、dna微阵列和pcr-elisa。一种特别优选的定量方法为fish，其将探针杂交与荧光显微镜、共焦激光显微镜或流式细胞术结合以直接定量单个细菌序列。另一种特别优选的定量方法是定量pcr(qpcr)，也称为实时pcr。可以使用不同的仪器，例如appliedbiosystems的abiprism7700sds、geneamp5700sds、abiprism7900htsds；bio-rad的icycleriq；cepheid的smartcycler；corbettresearch的rotor-gene；rochemolecularlightbiochemicals的lightcycler和stratagene的mx4000multiplex。qpcr过程通过在反应的指数阶段的非常早期测量pcr产物积累，实时准确定量pcr产物，从而减少端点pcr中发生的pcr扩增效率相关定量偏差。qpcr可使用不同的检测用化学方法，其均可用于上述qpcr仪器。术语“检测用化学方法”是指报道实时pcr中特定pcr产物的扩增的方法，并且可以包括水解或探针、分子信标、蝎子(scorpions)、杂交探针和dna结合染料如greeni。本发明的方法还可以包括检测和/或定量重症肌无力的一种或多种生物标志物。本申请所用的术语“生物标志物”是指疾病标志物，该疾病标志物典型地为可以容易测量的、存在于身体样品中的物质。所述身体样品可以是例如血液、血浆或粪便样本。典型地，测定的量与潜在的疾病病理生理学(比如存在或不存在特定的重症肌无力疾病)相关，使其对诊断和测量疾病的进展或治疗效果有用。本发明的方法可用于无力的筛查或早期检测、用于重症肌无力的诊断、用于疾病活动的测定、用于监测重症肌无力的进展和/或活动、用于监测重症肌无力的复发、和/或用于确定重症肌无力的治疗的疗效。本文中使用的术语“样本”或“测试样本”指的是含核酸的任何液体材料或固体材料。在合适的实施方式中，测试样本从生物源获取(即，“生物样本”)，比如培养中的细胞，或者是来自动物且最优选地来自人类的组织样本。在示例性实施方式中，所述样本是粪便。下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。实施例1筛选与重症肌无力相关的肠道菌群1、研究对象和样本收集研究在河北省石家庄市第一医院重症肌无力治疗中心收集的55例儿童重症肌无力患者和36例相应年龄、性别的健康对照(hc)。样本信息如表1所示。诊断标准：(1)临床表现：眼睑下垂、复视、斜视；(2)新斯的明试验阳性；(3)乙酰胆碱受体抗体抗体阳性；(4)肌电图：面神经低频衰减，高频无递增。符合(1)+(2)或(3)或(4)其中一项者可以明确诊断。分型：参照2000年美国重症肌无力协会(mgfa)提出新的临床分型与定量重症肌无力评分(qmg)标准型。纳入标准：患者明确诊断为重症肌无力眼肌型，符合以上诊断标准。排除标准：(1)年龄<2岁10个月或无年龄信息；(2)3个月内使用β-内酰胺类除外的抗生素；(3)服用其他治疗疾病的药物/激素；(4)使用抗炎药物或未知的中草药。表1样本临床特征2、dna抽提和测序使用dna提取试剂盒自样本中提取dna，操作步骤按说明书进行。采用荧光计或微量平板读取器(如qubitfluorometer,invitrogen)检测dna的浓度，采用琼脂糖凝胶电泳法(琼脂糖凝胶浓度：1％v，电压：150v，电泳时间：40min)检测样品的完整性和纯度。使用covaris随机打断基因组dna，用磁珠筛选出平均大小为200-400bp的片段化的基因组dna。将得到的dna片段进行末端修复，将3’端进行腺苷酸化，并将接头连接到3’端腺苷酸化的片段的末端，然后进行pcr扩增。使用磁珠对pcr产物进行纯化。双链pcr产物进行热变形，并用夹板寡核苷酸序列进行环化，将单链环状dna(sscirdna)格式化构建最终文库，并对文库质量进行质控。用phi29对文库进行扩增，得到一个分子拷贝数超过300个的dna纳米球(dnb)。将得到的dnbs加到芯片上的网状小孔内(固定在阵列化的硅芯片上)，通过联合探针锚定聚合技术(cpas)和多重置换扩增的双末端测序法(mda-pe)得到读长为100bp/150bp的双末端序列。3、质量控制对测得的数据进行质控处理，最终得到优质的数据进行后续的分析，质控步骤如下：1)过滤低质量的reads；2)去除人类基因组序列的污染，使用fastp(ref21)及其默认参数筛选出低质量的reads和序列适配序列，用bowtie2(ref22)将reads与人类基因组(hg38)比对，并使用samtools筛选出不能与人类基因组比对的成对reads，作为后续分析中使用的cleanreads。4、分类注释和功能注释使用metlan2将高质量的reads映射到mpa_v20标记基因数据库，得到每个样本不同分类水平的分类丰度图谱。使用merge_metlan_tables.py组合所有样本的结果，并使用内部脚本获得不同物种级别的组合丰度谱表。另一方面，使用humann2将高质量的reads映射到uniref90和chocophlan，以获得基因丰度和通路丰度图谱。然后，分别使用humann2_join_tables、humann2_renorm_table和humann2_split_strayfied_table合并所有样品的丰度，并对丰度进行标准化和进行分层分类注释。此外，使用humann2_regroup_table和humann2进行kegg和go富集分析。5、统计分析根据样本的分组情况，使用r中的wilcox.testtwo.side函数对所有丰度结果进行差异分析。每次结果中的p值将根据bh方法进行校正，以获得q值(fdr)，用于筛选明显呈现显著性差异的物种和通路。使用shannon指数计算每个样本的α多样性。在相同的输入下，使用参数为‘method＝dist_method’的r中vegan包来计算β多样性。同时使用r的proc分析绘制roc曲线并计算其auc面积。对分类图谱进行主成分分析(pca)，使用r的ade4软件包计算pca的eig结果，dudi.pca函数得到不同pc的特征向量，li结果得到每个样本在pc轴上的坐标，cl得到每个pc在总方差中的贡献百分比。为了将差异性物种与样本的临床表型联系起来，按照参数‘method＝spearman，use＝pairwise，adjust＝bh’，采用r包中的corr.tes方法来计算特征与临床表型之间的spearman相关性。6、结果基于shannon指数的不同分类水平的α多样性和β多样性在患者和健康人群之间没有显著差异(图1)。pca和pcoa结果显示，患者和健康人没有显著的聚集分布(图2)。物种差异性结果分析显示，呈现显著性差异的物种有20个，其中roc检测auc值>0.7的有11个，具体情况如表2所示。对20个差异菌群的联合诊断分析，结果如表3所示。其中，pyramidobacter_piscolens、lachnospiraceae_bacterium_2_1_46faa、helicobacter_cinaedi或clostridium_bartlettii的丰度以及诊断效能如表4所示，将上述菌群进行联合诊断效果如表2所示，诊断效能都显著增加，说明将pyramidobacter_piscolens、lachnospiraceae_bacterium_2_1_46faa、helicobacter_cinaedi或clostridium_bartlettii单独或联合应用于重症肌无力的诊断具有较高的诊断效能，能有效的区分重症肌无力患者和健康人。表2差异菌群及auc值表3联合诊断auc值表4肠道菌群的含量及诊断效能实施例2验证基因组测序的准确性按照实施例1的方式收集重症肌无力的样本19例以及健康人的样本13例，患者信息如表5所示。表5样本临床特征随机选择差异菌群prevotella_copri、clostridium_bartlettii、fusobacterium_mortiferum、helicobacter_cinaedi进行测序验证，计算其应用于重症肌无力的诊断效能。结果显示，prevotella_copri、clostridium_bartlettii、fusobacterium_mortiferum、helicobacter_cinaedi的auc值分别为0.736842105、0.672064777、0.821862348、0.615384615，与前述检测的结果相当，说明宏基因组的测序数据准确。上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。当前第1页1 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技术领域：
：，涉及重症肌无力诊断用试剂。
背景技术：
：：重症肌无力(mg)是一种自身抗体介导，t细胞依赖性，补体和细胞因子参与，累及神经肌肉接头(neuromuscularjunction,nmj)突触后膜的获得性自身免疫性疾病，年平均发病率为(8.0～20.0)/10万人，各年龄段均可发病(gilhusne.myastheniagravis.nengljmed.2016；375(26):2570-81.)。该病可累及全身骨骼肌，包括眼外肌、咽肌、四肢及躯干肌肉，出现眼睑下垂、视物重影、吞咽困难及肢体乏力，甚至出现呼吸困难，严重者可危及生命。其典型的症状为骨骼肌易疲劳，晨轻暮重或活动后加重，休息可减轻，多数对抗胆碱酯酶抑制剂有效，其发病机制尚不清楚(dalakasmc.novelfuturetherapeuticoptionsinmyastheniagravis.autoimmunrev.2013ju1；12(9):936-41.)。大约10％-20％眼肌型mg患者可自愈，大约20-30％眼肌型mg患者终身局限于眼外肌而不进展，在其余的患者中，多数可能在起病3年内会累及延髓和四肢肌肉，逐渐发展成全身型mg，大约2/3的mg患者会在发病后的1年内达到疾病严重程度的高峰，约20％的mg患者在发病1年内发生mg危象(davidg,normanb,tatsujin,etal.lifetimecourseofmyastheniagravis.musclenerve.2010；37(2):141-9.)。在如手术、创伤、精神应激、感染、发热、女性怀孕、分娩、使用影响重症肌无力的药物或合并其他自身免疫性疾病等情况下，mg患者的肌无力症状有可能加重。mg的免疫发病机制复杂，可能因素包括遗传倾向、环境因素、t细胞和b细胞的协同作用、辅助性t细胞(helpertcell,th)/调节性t细胞的失衡、细胞因子和抗体分泌的异常以及补体系统的激活等。mg的早期诊断对于治疗具有重要的意义。肠道菌群是肠道系统的重要组成部分，人类在长期进化的过程中与肠道菌群形成了互利共生的关系。一旦饮食习惯、环境因素改变，肠道感染或其他因素导致肠道内微生物的种类组成和数量发生改变时，就会打破机体与肠道菌群之间的动态平衡状态，导致肠道微生态失调，机体的各方面功能出现紊乱，从而引起疾病的发生(jandhyalasm,talukdarr,subramanyamc,etal.roleofthenormalgutmicrobiota[j].worldjgastroenterol,2015,21(29):8787-8803.)。因此维持肠道菌群的动态平衡对机体的生理健康尤为重要。研究与重症肌无力相关的肠道菌群，探究其在重症肌无力发生发展过程中的作用，为重症肌无力的诊断和治疗提供新的思路。技术实现要素：本发明的目的在于提供与重症肌无力发生发展相关的肠道菌群及其在诊断和治疗重症肌无力中的应用。为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：本发明提供了用于检测菌群丰度的试剂在制备用于预测重症肌无力的产品中的用途，所述菌群选自肠道菌种pyramidobacter_piscolens、lachnospiraceae_bacterium_2_1_46faa、helicobacter_cinaedi或clostridium_bartlettii的任意一种或几种。进一步，所述菌群选自pyramidobacter_piscolens、lachnospiraceae_bacterium_2_1_46faa、helicobacter_cinaedi或clostridium_bartlettii的任意两种或几种。进一步，所述试剂包括与来自pyramidobacter_piscolens、lachnospiraceae_bacterium_2_1_46faa、helicobacter_cinaedi或clostridium_bartlettii的靶核苷酸序列特异性杂交的寡核苷酸。进一步，pyramidobacter_piscolens、lachnospiraceae_bacterium_2_1_46faa、helicobacter_cinaedi或clostridium_bartlettii的靶核苷酸序列是菌种特异性基因区域的片段的靶核苷酸序列是菌种特异性基因区域的片段。进一步，所述寡核苷酸被可检测地标记。进一步，所述重症肌无力为儿童重症肌无力。本发明提供了一种诊断重症肌无力的产品，所述产品包括检测样本中pyramidobacter_piscolens、lachnospiraceae_bacterium_2_1_46faa、helicobacter_cinaedi或clostridium_bartlettii的丰度的试剂。进一步，所述试剂包括与来自pyramidobacter_piscolens、lachnospiraceae_bacterium_2_1_46faa、helicobacter_cinaedi或clostridium_bartlettii的靶核苷酸序列特异性杂交的寡核苷酸。进一步，pyramidobacter_piscolens、lachnospiraceae_bacterium_2_1_46faa、helicobacter_cinaedi或clostridium_bartlettii的靶核苷酸序列是菌种特异性基因区域的片段。进一步，所述寡核苷酸被可检测地标记。进一步，所述寡核苷酸包括特异性识别pyramidobacter_piscolens、lachnospiraceae_bacterium_2_1_46faa、helicobacter_cinaedi或clostridium_bartlettii的靶核苷酸序列的探针或特异性扩增pyramidobacter_piscolens、lachnospiraceae_bacterium_2_1_46faa、helicobacter_cinaedi或clostridium_bartlettii的靶核苷酸序列的引物。进一步，所述扩增是pcr或rt-pcr，优选的，所述扩增利用可检测的被标记的引物。本发明提供了微生物标志物在制备治疗重症肌无力的药物中的应用，所述微生物标志物选自pyramidobacter_piscolens、lachnospiraceae_bacterium_2_1_46faa、helicobacter_cinaedi或clostridium_bartlettii的任意一种或几种。进一步，所述药物包括增加pyramidobacter_piscolens、lachnospiraceae_bacterium_2_1_46faa、helicobacter_cinaedi或clostridium_bartlettii丰度的试剂。附图说明图1是α多样性和β多样性分布的小提琴图；其中，a-c是基于shannon指数的α多样性在门(a)、属(b)和种(c)水平上的分布图；d-f是基于bray-curtis距离的β多样性在门(d)、属(e)和种(f)水平上的分布图。图2是所有参与者在不同分类水平的相对丰度的pcoa，其中图a-f分别是在门、纲、目、科、属、种分类水平的相对丰度的pcoa，红点和蓝色三角形分别代表mg和hc。图3是pyramidobacter_piscolens的丰度情况图。具体实施方式为了评估肠道共生菌群组成能否作为重症肌无力的预测因子，本发明通过收集重症肌无力患者和健康人的样本，进行全基因组测序以及使用生物信息学进行测序数据的统计，发现与疾病相关的肠道菌群，将肠道菌群与疾病信息整合，最大程度预测重症肌无力患者。本发明通过全基因组测序，首次发现了pyramidobacter_piscolens、helicobacter_cinaedi或clostridium_bartlettii在重症肌无力患者和健康人中呈现显著性差异，并通过差异菌群的联合诊断分析，发现pyramidobacter_piscolens与helicobacter_cinaedi或clostridium_bartlettii联合应用于重症肌无力的诊断具有较高的效能。在本发明的实施方式中，本发明通过以下步骤来诊断重症肌无力：在来自个体的核酸样本中，检测与重症肌无力的诊断相关的菌种所对应的一个或多个核酸片段。在特定的实施方式中，检测对应于pyramidobacter_piscolens、helicobacter_cinaedi或clostridium_bartlettii的核酸片段。在实施本文描述的方法中，使用分子生物学、蛋白质生物化学、细胞生物学、免疫学、微生物学和重组dna方面的很多传统技术，这些技术是公知的。下文提供了本说明书中使用的一些术语的定义。除非另有说明，本文中使用的所有技术和科学用语通常具有和本发明所属领域的普通技术人员通常理解的意思相同的意思。本申请所用的术语“探针”是指长度为10至285个碱基对的合成的或生物学上产生的核酸，其含有允许在预定条件下与目标核酸序列特异性优先杂交的特异性核苷酸序列，并且可选地含有用于检测或提高试验性能的部分。通常需要最少10个核苷酸以在统计学上获得特异性并形成稳定的杂交产物，并且最多285个核苷酸通常代表可以容易调节反应参数以测定错配序列和优先杂交的长度上限。探针可以可选地含有某些成分，这些成分在某些试验条件下有助于该探针适当起作用或起到最佳作用。例如，可以修饰探针以提高其对核酸酶降解的抗性(例如，通过封端)，携带检测配体(例如荧光素)或便于该探针在固体支持物上进行捕获(例如聚脱氧腺苷“尾巴”)。本申请所用的术语“引物”是指可用于扩增方法(例如聚合酶链反应，“pcr”)以扩增核苷酸序列的寡核苷酸。引物基于特定目标序列的多核苷酸序列(例如一个特异性16srdna序列)来设计。引物和探针的设计和验证是本领域公知。本申请所用的术语“特异性”意指核苷酸序列将与预定的目标序列杂交/扩增预定的目标序列杂交，并且在试验条件(通常使用严格条件)下不会实质性地与非目标序列杂交/扩增非目标序列杂交。本申请所用的术语“杂交”是指这样的方法：通过该方法，在预定的反应条件下，使两条部分或完全互补的核酸链以反向平行方式聚合而形成具有特异性和稳定性的双链核酸，其遵循与核酸碱基可以彼此配对的明确规则。术语“严格的杂交条件”意指约35℃至65℃且约0.9mol的nacl盐溶液。严格性还可以由如存在于杂交溶液中的离子种类的浓度和类型、存在的变性剂的类型和浓度、以及杂交温度这些反应参数来控制。一般地，随着杂交条件变得更加严格，如果要形成稳定的杂交物，则优选较长的探针。一般说来，杂交发生的条件的严格性将决定要使用的优选探针的某些特征。本领域公知用于测量目标核酸序列的量的分子生物学方法。这些方法包括但不限于端点pcr、竞争性pcr、逆转录酶-pcr(rt-pcr)、定量pcr(qpcr)、逆转录酶qpcr(rt-qpcr)、pcr-焦磷酸测序、pcr-elisa、dna微阵列、原位杂交试验如斑点印迹或荧光原位杂交试验(fish)、分支dna以及所述方法的多重版本。优选的引物和/或探针以可预测的方式来进行反应，典型地通过对细菌核酸序列的增量提供直接线性响应。通过制备适当标准并与其比较，可以容易地量化样品中给定核酸序列的量。优选地，所述用于基因定量的所述分子方法选自定量聚合酶链反应(qpcr)、pcr-焦磷酸测序、荧光原位杂交(fish)、dna微阵列和pcr-elisa。一种特别优选的定量方法为fish，其将探针杂交与荧光显微镜、共焦激光显微镜或流式细胞术结合以直接定量单个细菌序列。另一种特别优选的定量方法是定量pcr(qpcr)，也称为实时pcr。可以使用不同的仪器，例如appliedbiosystems的abiprism7700sds、geneamp5700sds、abiprism7900htsds；bio-rad的icycleriq；cepheid的smartcycler；corbettresearch的rotor-gene；rochemolecularlightbiochemicals的lightcycler和stratagene的mx4000multiplex。qpcr过程通过在反应的指数阶段的非常早期测量pcr产物积累，实时准确定量pcr产物，从而减少端点pcr中发生的pcr扩增效率相关定量偏差。qpcr可使用不同的检测用化学方法，其均可用于上述qpcr仪器。术语“检测用化学方法”是指报道实时pcr中特定pcr产物的扩增的方法，并且可以包括水解或探针、分子信标、蝎子(scorpions)、杂交探针和dna结合染料如greeni。本发明的方法还可以包括检测和/或定量重症肌无力的一种或多种生物标志物。本申请所用的术语“生物标志物”是指疾病标志物，该疾病标志物典型地为可以容易测量的、存在于身体样品中的物质。所述身体样品可以是例如血液、血浆或粪便样本。典型地，测定的量与潜在的疾病病理生理学(比如存在或不存在特定的重症肌无力疾病)相关，使其对诊断和测量疾病的进展或治疗效果有用。本发明的方法可用于无力的筛查或早期检测、用于重症肌无力的诊断、用于疾病活动的测定、用于监测重症肌无力的进展和/或活动、用于监测重症肌无力的复发、和/或用于确定重症肌无力的治疗的疗效。本文中使用的术语“样本”或“测试样本”指的是含核酸的任何液体材料或固体材料。在合适的实施方式中，测试样本从生物源获取(即，“生物样本”)，比如培养中的细胞，或者是来自动物且最优选地来自人类的组织样本。在示例性实施方式中，所述样本是粪便。下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。实施例1筛选与重症肌无力相关的肠道菌群1、研究对象和样本收集研究在河北省石家庄市第一医院重症肌无力治疗中心收集的55例儿童重症肌无力患者和36例相应年龄、性别的健康对照(hc)。样本信息如表1所示。诊断标准：(1)临床表现：眼睑下垂、复视、斜视；(2)新斯的明试验阳性；(3)乙酰胆碱受体抗体抗体阳性；(4)肌电图：面神经低频衰减，高频无递增。符合(1)+(2)或(3)或(4)其中一项者可以明确诊断。分型：参照2000年美国重症肌无力协会(mgfa)提出新的临床分型与定量重症肌无力评分(qmg)标准型。纳入标准：患者明确诊断为重症肌无力眼肌型，符合以上诊断标准。排除标准：(1)年龄<2岁10个月或无年龄信息；(2)3个月内使用β-内酰胺类除外的抗生素；(3)服用其他治疗疾病的药物/激素；(4)使用抗炎药物或未知的中草药。表1样本临床特征2、dna抽提和测序使用dna提取试剂盒自样本中提取dna，操作步骤按说明书进行。采用荧光计或微量平板读取器(如qubitfluorometer,invitrogen)检测dna的浓度，采用琼脂糖凝胶电泳法(琼脂糖凝胶浓度：1％v，电压：150v，电泳时间：40min)检测样品的完整性和纯度。使用covaris随机打断基因组dna，用磁珠筛选出平均大小为200-400bp的片段化的基因组dna。将得到的dna片段进行末端修复，将3’端进行腺苷酸化，并将接头连接到3’端腺苷酸化的片段的末端，然后进行pcr扩增。使用磁珠对pcr产物进行纯化。双链pcr产物进行热变形，并用夹板寡核苷酸序列进行环化，将单链环状dna(sscirdna)格式化构建最终文库，并对文库质量进行质控。用phi29对文库进行扩增，得到一个分子拷贝数超过300个的dna纳米球(dnb)。将得到的dnbs加到芯片上的网状小孔内(固定在阵列化的硅芯片上)，通过联合探针锚定聚合技术(cpas)和多重置换扩增的双末端测序法(mda-pe)得到读长为100bp/150bp的双末端序列。3、质量控制对测得的数据进行质控处理，最终得到优质的数据进行后续的分析，质控步骤如下：1)过滤低质量的reads；2)去除人类基因组序列的污染，使用fastp(ref21)及其默认参数筛选出低质量的reads和序列适配序列，用bowtie2(ref22)将reads与人类基因组(hg38)比对，并使用samtools筛选出不能与人类基因组比对的成对reads，作为后续分析中使用的cleanreads。4、分类注释和功能注释使用metlan2将高质量的reads映射到mpa_v20标记基因数据库，得到每个样本不同分类水平的分类丰度图谱。使用merge_metlan_tables.py组合所有样本的结果，并使用内部脚本获得不同物种级别的组合丰度谱表。另一方面，使用humann2将高质量的reads映射到uniref90和chocophlan，以获得基因丰度和通路丰度图谱。然后，分别使用humann2_join_tables、humann2_renorm_table和humann2_split_strayfied_table合并所有样品的丰度，并对丰度进行标准化和进行分层分类注释。此外，使用humann2_regroup_table和humann2进行kegg和go富集分析。5、统计分析根据样本的分组情况，使用r中的wilcox.testtwo.side函数对所有丰度结果进行差异分析。每次结果中的p值将根据bh方法进行校正，以获得q值(fdr)，用于筛选明显呈现显著性差异的物种和通路。使用shannon指数计算每个样本的α多样性。在相同的输入下，使用参数为‘method＝dist_method’的r中vegan包来计算β多样性。同时使用r的proc分析绘制roc曲线并计算其auc面积。对分类图谱进行主成分分析(pca)，使用r的ade4软件包计算pca的eig结果，dudi.pca函数得到不同pc的特征向量，li结果得到每个样本在pc轴上的坐标，cl得到每个pc在总方差中的贡献百分比。为了将差异性物种与样本的临床表型联系起来，按照参数‘method＝spearman，use＝pairwise，adjust＝bh’，采用r包中的corr.tes方法来计算特征与临床表型之间的spearman相关性。6、结果基于shannon指数的不同分类水平的α多样性和β多样性在患者和健康人群之间没有显著差异(图1)。pca和pcoa结果显示，患者和健康人没有显著的聚集分布(图2)。物种差异性结果分析显示，呈现显著性差异的物种有20个，其中roc检测auc值>0.7的有11个，具体情况如表2所示。对20个差异菌群的联合诊断分析，结果如表3所示。其中，pyramidobacter_piscolens、lachnospiraceae_bacterium_2_1_46faa、helicobacter_cinaedi或clostridium_bartlettii的丰度以及诊断效能如表4所示，将上述菌群进行联合诊断效果如表2所示，诊断效能都显著增加，说明将pyramidobacter_piscolens、lachnospiraceae_bacterium_2_1_46faa、helicobacter_cinaedi或clostridium_bartlettii单独或联合应用于重症肌无力的诊断具有较高的诊断效能，能有效的区分重症肌无力患者和健康人。表2差异菌群及auc值表3联合诊断auc值表4肠道菌群的含量及诊断效能实施例2验证基因组测序的准确性按照实施例1的方式收集重症肌无力的样本19例以及健康人的样本13例，患者信息如表5所示。表5样本临床特征随机选择差异菌群prevotella_copri、clostridium_bartlettii、fusobacterium_mortiferum、helicobacter_cinaedi进行测序验证，计算其应用于重症肌无力的诊断效能。结果显示，prevotella_copri、clostridium_bartlettii、fusobacterium_mortiferum、helicobacter_cinaedi的auc值分别为0.736842105、0.672064777、0.821862348、0.615384615，与前述检测的结果相当，说明宏基因组的测序数据准确。上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。当前第1页1 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