濒危物种崖柏SSR引物及其应用的制作方法

本发明涉及ssr引物，尤其涉及濒危物种崖柏的特异性ssr引物，本发明进一步涉及所述特异性ssr引物在濒危物种崖柏种群遗传多样性分析、种群遗传结构分析、种群遗传分化分析等方面的应用，属于崖柏研究领域。

背景技术：

崖柏(thujasutchuenensis)是柏科(cupressaceae)崖柏属(thuja)常绿乔木，中国特有的极小种群裸子植物(http://www.iplant.cn/rep/protlist)。基于cpdna，nrdnaits，leafy，4cl等研究，cui等人(cuiymsunb,wanghf,fergusondk,wangyf,lics,yangj,maqw(2015)exploringtheformationofadisjunctivepatternbetweeneasternasiaandnorthamericabasedonfossilevidencefromthuja(cupressaceae).plosone,10,e0138544.)分析崖柏属5个物种(崖柏，朝鲜崖柏thujakoraiensisnakai，日本香柏thujastandishii(gord.)carr，北美乔柏thujaplicatad.don，北美香柏thujaoccidentalisl)的化石，推测崖柏属植物起源于古新世或更早的北美西部高纬度地区。peng等人(pengd.,wangx.q.(2008)reticulateevolutioninthujainferredfrommultiplegenesequences:implicationsforthestudyofbiogeographicaldisjunctionbetweeneasternasiaandnorthamerica.molphylogenetevol,47,1190-1202.)认为崖柏与日本香柏的亲缘关系最近。liu等人(liuj.,shis.,change.,yangw.,jiangz.(2013)geneticdiversityofthecriticallyendangeredthujasutchuenensisrevealedbyissrmarkersandtheimplicationsforconservation.intjmolsci,14,14860-14871.)对7个崖柏种群的遗传多样性进行了简单重复序列间扩增(issr)，发现崖柏在物种水平上有着较高的遗传多样性，而在不同种群间的遗传多样性水平则较低。刘建峰和肖文发(刘建锋,肖文发(2008)濒危植物崖柏遗传多样性的rapd分析.江西农业大学学报,68-72.)利用随机扩增多态性dna(rapd)分子标记技术对5个天然崖柏种群的遗传变异进行研究，发现崖柏具有较丰富的种内遗传多样性，不是所有濒危植物的遗传多样性水平都低。张仁波等人(张仁波，窦全丽，何平，邓洪平(2007)濒危植物崖柏遗传多样性研究.广西植物,687-691.)利用rapd分子标记技术研究6个崖柏种群的遗传多样性，研究结果表明崖柏种内具有较高的遗传多样性水平，但崖柏种群间基因流水平较低。据检索，目前没有应用ssr标记设计引物研究崖柏遗传多样性。

微卫星dna(microsatellite，在植物遗传学中也称简单重复序列simplesequencerepeats/ssr，短片段重复序列)，是一段dnamotif(通常为1～6bp)重复出现于dna序列中(通常重复5～50次)。微卫星dna较dna中的其他区域具有更高的突变率，因而在个体/群落之间具有较强的序列多样性，微卫星dna分子标记由于具有特异性好、多态性高、有用遗传信息量大、共显性遗传及检测方便快速且稳定性高等特点，微卫星dna也因此被广泛用于亲缘关系鉴定、遗传连锁判定、癌症诊断和群体遗传学研究等领域，研究不同种群的遗传多样性及遗传结构。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是：提供崖柏的特异性ssr引物，应用于研究崖柏不同群体的遗传多样性，分析该崖柏不同群体遗传结构特征和群体遗传多样性，明晰不同群体遗传分化和基因流状况以及群体系统发育与进化关系，从而能够揭示崖柏群体遗传变异规律，阐明崖柏种群的系统进化和地理分化，这对于掌握其来源及群体分化情况，对其开发与利用等具有十分重要的理论与实践意义。

本发明提供的技术方案是：一种濒危物种崖柏的特异性ssr引物，包括如下引物物对：

同时，本发明还提供所述的特异性ssr引物在崖柏种群遗传多样性分析、种群遗传结构分析、种群遗传分化分析中的应用。

进一步地，所述的应用包括如下步骤：

(1)提取崖柏基因组dna

(2)利用权利要求1所述的特异性ssr引物进行pcr扩增，包括使用荧光标记的多重pcr扩增；

(3)使用毛细管电泳等方法检测扩增产物，获得检测结果；

(4)利用步骤(3)的结果进行崖柏种群遗传多样性分析、种群遗传结构分析、mantel检验分析或种群基因流分析。

所述的应用，其pcr的反应体系如下：

所述pcr的扩增程序如下：

进一步地，所述的应用，是对崖柏种群进行遗传多样性分析，使用genealex(version6.502)软件计算崖柏种群的遗传多样性指标，所述遗传多样性指标包括崖柏种群的等位基因数、有效等位基因数、观测杂合度、期望杂合度以及近亲繁殖系数的均值。

进一步地，所述应用是对崖柏种群进行遗传结构分析，使用structure(version2.3.4)软件对种群进行贝叶斯聚类分析，使用mega(version6.0)软件建立了非加权组平均法系统发育树，使用genealex(version6.502)软件基于遗传距离数据进行主坐标分析。

进一步地，所述应用是对崖柏种群进行遗传分化分析，使用genealex(version6.502)软件计算种群的遗传分化系数和基因流，得到了种群成对遗传分化矩阵和种群成对基因流矩阵，种群成对地理距离矩阵基于gps工具记录的采样点经纬度坐标计算得出。

本发明具有以下有益效果：

1)将本发明提供崖柏的特异性ssr引物应用于研究崖柏不同群体的遗传多样性，分析该崖柏不同群体遗传结构特征和群体遗传多样性，明晰不同群体遗传分化和基因流状况以及群体系统发育与进化关系，从而能够揭示崖柏群体遗传变异规律，阐明崖柏种群的系统进化和地理分化，这对于掌握其来源及群体分化情况，对其开发与利用等具有十分重要的理论与实践意义。

2)相比于rapd等其它方法，微卫星dna分子标记(ssr)具有特异性好、多态性高、有用遗传信息量大、共显性遗传及检测方便快速且稳定性高等特点；利用ssr引物应用于研究类似于崖柏的濒危植物的种群遗传多样性、遗传结构、基因流和种群分化等，有利于为科学有效地保护濒危物种提供支撑。

附图说明

图1崖柏30对引物的多重pcr电泳图；为便于区分组内引物，依据引物条带大小，分成8组，每组3-4种引物；

图2多重pcr的毛细管电泳示意图；展示1组4种引物标记4种荧光标记(fam、hex、tamra、rox)；

图3崖柏种群遗传结构；

图4基于遗传距离的upgma系统发育树；

图5基于遗传距离建立的主成分分析；

图6崖柏野生种群间遗传分化和地理距离之间的关系。

具体实施方式

下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。

实施例1特异性ssr引物的设计及筛选

1.查找含有微卫星重复单元的序列

(1)崖柏原始序列的获得：提取崖柏叶绿体dna，本次测序采用hiseqpe150模式(双端测序)，进行从头测序，获得崖柏叶绿体基因组的原始序列。

(2)原始数据预处理：对上述步骤(1)获得的高通量测序获得的原始数据，对于每个碱基的质量编码标示，不同的软件采用不同的方案，本实验使用的方案是phredqualityscore值的范围从0到62对应的ascii码从64到126，得分在0到40之间。

(3)原始数据质量评估：使用fastqc对原始数据进行质量评估，对一些基本信息进行统计并可视化，确定其数据质量。

(4)原始数据质控，获得高质量序列

对原始数据进行以下处理：

a)接头剪切：使用cutadapt去除读序中可能存在的接头序列；

forward:agatcggaagagcacacgtctgaac

reverse:agatcggaagagcgtcgtgtaggga

b)质量剪切：使用prinseq滑窗法去除读序两端的连续低质量序列(q值<20)；

c)使用prinseq去除质控后长度小于35bp的读序及其配对读序。

对读序进行污染评估：

使用blast+，随机从通过qc的序列中抽取1000条序列进行blast比对，比对数据库为ncbint数据库，取evalue≤1e-10并且相似度>90％，coverage>80％的比对结果，计算其物种分布。这一步分析是为了确定在文库制备和测序过程中样品是否被污染，可能的污染包括环境微生物污染，实验操作中可能引入的人源遗传物质污染等。

(5)基因组denovo组装

在获取高质量测序数据后，依据高通量测序数据高冗余度的原理，不依据参考基因组的指导，对基因组进行从头组装。spades首先对原始序列进行序列错误校正，之后通过多kmer值进行组装，最终综合各kmer值组装结果获得最佳结果，因此spades组装效果及准确度均较高。

(6)ssr检测

在获取拼接基因组序列后，使用misa对序列中的ssr位点进行查找，得到多个ssr位点，参数设置：ssr最小间距为200bp，ssr选取标准如下表：

表1ssrcutoff

其中：

ssrunitlength：组成ssr的重复单位的长度；

repeats：ssr单位的最小重复次数，对特定长度的ssr单位，其重复次数必须不小于该值。

2.ssr引物设计及筛选

在获得ssr序列信息后，我们使用primer3，对这些ssr序列进行了引物设计，并对这些结果进行了整理和可视化。

一共找出877个ssr位点，并为每个ssr位点设计了3对不同的引物，在每个位点上选取一对引物。在这877对引物中，利用引物筛选原则(退火温度60℃左右；正反引物gc含量在45％-55％之间；碱基重复在5次以上)，筛选出符合条件的114对引物。

对这114对引物做预实验，随机挑选10个崖柏dna(咸宜乡野生种群2个样品，满月乡野生种群1个样品，白泉乡野生种群1个样品，关面乡野生种群1个样品，漆树乡野生种群1个样品，明中乡野生种群1个样品，咸宜乡人工种群1个样品，白泉乡人工种群1个样品，关面乡人工种群1个样品)，按照下表2的pcr反应体系进行扩增反应(扩增体系见表3)，并用6％聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。从114对ssr引物中，通过初步筛选和重复验证，挑选出稳定性较好，多态性较高的35对标记，并利用micro-checker软件对ssr标记的无效等位基因或其他读取错误等进行了检验，最终筛选出30对多态性好、重复性高的有效ssr标记(表4)。

崖柏基因组dna的提取：提取方法如下：

1)称取植物干重组织20-30mg，加入钢珠在研磨机里以2200r/min研磨1min；

2)加入400ul缓冲液lp1和6ulrnasea(10mg/ml)，旋涡震荡1min，室温放置10min；

3)加入130ul缓冲液lp2，充分混匀，旋涡震荡1min；

4)在离心机中以12000rpm离心5min，将上清液移至新的离心管中；

5)加入1.5倍体积的缓冲液lp3(lp3使用前已加入无水乙醇)，充分震荡混匀15sec；

6)将上一步所得溶液都加入一个吸附柱cb3种(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30sec，倒掉废液，吸附柱cb3放入收集管中；

7)向吸附柱cb3中加入600ul漂洗液pw(pw使用前已加入无水乙醇)，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中；

8)重复操作步骤7)；

9)将吸附柱cb3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱cb3置于室温放置15min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

10)将吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100ul洗脱缓冲液te(te在60℃水浴锅中预热)，室温放置5min，12000rpm离心2min，得到的溶液为植物dna。

表2ssr-pcr反应体系

表3ssr-pcr扩增程序

表430对多态性ssr标记

实施例2崖柏种群遗传多样性分析

遗传多样性指标主要包括等位基因数(numberofalleles,na)、有效等位基因数(numberofeffectivealleles,ne)、观测杂合度(observedheterozygosity,ho)、期望杂合度(expectedheterozygosity,he)和近亲繁殖系数(inbreedingcoefficient,fis)。等位基因数指群体中测得的所有基因座位上等位基因种类数量的均值，反映了种群遗传多样性的高低。有效等位基因数是群体中纯合体频率的倒数，更适合用于比较种群遗传多样性的变化程度。观测杂合度是指实际观测到的杂合体数目占群体总数的比值，期望杂合度是理论计算得出的杂合度。近亲交配系数反应了种群的近亲繁殖率。我们选取10个种群(咸宜乡2个野生种群，满月乡1个野生种群，白泉乡1个野生种群，关面乡1个野生种群，漆树乡1个野生种群，明中乡1个野生种群，咸宜乡1个人工种群，白泉乡1个人工种群，关面乡1个人工种群)的微卫星分子标记实验结果，使用genealexversion6.502软件计算10个种群的各项遗传多样性指标。

崖柏种群的等位基因数(na)、有效等位基因数(ne)、观测杂合度(ho)、期望杂合度(he)以及近亲繁殖系数(fis)的均值(±sd)分别为3.263±2.015，1.872±0.611，0.637±0.390，0.401±0.214和﹣0.441±0.454。明中乡野生种群和满月乡野生种群平均等位基因数显著低于其他种群；白泉乡野生种群、漆树乡野生种群、白泉乡人工繁育种群和关面乡人工繁育种群平均有效等位基因数、平均期望杂合度与平均观测杂合度显著高于其他种群。崖柏野生种群和人工繁育种群的平均近亲繁殖系数均低于0(表5)，表明崖柏种群杂合子占比较多。

表5崖柏种群的遗传特征

实施例3崖柏种群遗传结构分析

我们使用structure(version2.3.4)软件对10个种群(咸宜乡2个野生种群，满月乡1个野生种群，白泉乡1个野生种群，关面乡1个野生种群，漆树乡1个野生种群，明中乡1个野生种群，咸宜乡1个人工种群，白泉乡1个人工种群，关面乡1个人工种群)进行了贝叶斯聚类分析。设定k值为从2到12，独立运算次数为10，使用混合祖先模型，burn-in设为10000-step，markovchainmontecarlo(mcmc)设置为100000-step。将运算的结果整理后上传至structureharverst(version0.6.94)网站计算deltak值，推断最适k值。我们使用mega(version6.0)软件建立了非加权组平均法(unweightedpair-grouparithmeticmeans)系统发育树，使用genealex(version6.502)软件基于遗传距离数据进行主坐标分析(principalcoordinatesanalysis,pcoa)。

structure软件使用不连锁的分子标记组成的基因型数据实施基于模型的聚类方法来推断种群结构。structure的分析结果显示，当k＝3时，崖柏种群可分为三个类群：明中乡种群、满月乡种群和咸宜乡明月村种群聚为一类；咸宜乡葛藤村种群和关面乡种群聚为一类；白泉乡种群和漆树乡种群聚为一类(图3)。基于非加权组平均法和遗传距离数据建立的系统发育树和基于遗传距离建立的主坐标分析结果均与structure分析的结果一致，显示崖柏种群可分为3个类群(图4，图5)。

实施例4崖柏种群遗传分化分析

为了探究崖柏种群间遗传分化水平，我们使用genealex(version6.502)软件计算了10个种群(咸宜乡2个野生种群，满月乡1个野生种群，白泉乡1个野生种群，关面乡1个野生种群，漆树乡1个野生种群，明中乡1个野生种群，咸宜乡1个人工种群，白泉乡1个人工种群，关面乡1个人工种群)的遗传分化系数和基因流，得到了种群成对遗传分化矩阵和种群成对基因流矩阵。种群成对遗传分化矩阵的显著性通过bonferroni修正进行了999次运算的检测。

为了明确地理距离对种群遗传分化的影响，我们使用genealex(version6.502)软件进行了种群分子方差分析(analysisofmolecularvariance，amova)。分子方差分析经过了999次重复运算的检验。我们使用genealex(version6.502)软件对所有种群进行了manteltest分析。种群成对地理距离矩阵基于gps工具(garminoregon450)记录的采样点经纬度坐标计算得出。manteltest分析经过了999次重复运算检验显著性，横坐标为对数化的地理距离，纵坐标为fst/(1-fst)。

1.mantel检验分析

mantel检验可以用于两个矩阵之间的相关性分析。我们使用mantel检验分析了崖柏野生种群间遗传分化和地理距离之间的关系。结果显示崖柏种群间遗传分化和地理距离之间不存在相关性(r²＝0.0021,p值为0.110)(请见图6)。

2.种群基因流分析

成对种群遗传分化矩阵的结果显示，崖柏种群的遗传分化水平总体较低(fst值为0.000-0.317，请见表5)。成对种群基因流矩阵的结果显示，崖柏种群间基因交流程度总体较高(请见表6，其中，nm值为0.538-∞，∞表示无穷大)。

表57个野生种群和3个人工繁育种群遗传分化矩阵

表67个野生种群和3个人工繁育种群基因流矩阵

注：∞代表基因流无穷大。

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