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您当前的位置： 与棉花卷叶性状相关的分子标记及其应用的制作方法
2021-02-02 17:02:58|
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起点商标网 本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及棉花卷叶性状相关的分子检测领域，尤其涉及一种与棉花卷叶性状相关的分子标记及其应用。
背景技术：
：棉花作为棉纺织业的原材料，与人们的日常生活密切相关，是一种全球性的重要经济作物，也是我国重要的经济和战略物资。棉花作为我国最大的商品棉生产基地，对新疆的经济发展有至关重要的作用。然而，由于棉花自身生长特性导致棉花冠层荫蔽，直接影响群体的光能利用效率，导致棉花高光效育种慢于其他模式植物。作物株型是作物为适应环境而表现出的形态结构，直接决定棉花的品质与产量。叶片是光合作用的主要场所，是植物生长发育的主要源器官，承担90％植物生长发育所需的有机物。叶片的形态对于棉花生长发育有重要影响，由于棉花自身生长习性，易造成冠层荫蔽，使棉花群体光能利用率低，导致棉花高光效育种慢于其它模式作物，而适度卷曲的叶片可以维持叶片直立，可减少植株的阴影面积，以便在不影响光补偿点的情况下提高光饱和点，从而提高群体光能利用率，达到提高干物质的积累以及作物产量的目的。另外，棉花卷曲叶片其蜡质含量高于普通阔叶，这有利于在干旱条件下减少植物的蒸腾作用，减少光辐射对叶片的伤害，同时对抗虫也有非常重要的意义。叶片是作物重要的株型性状之一，对于构建棉花理想株型具有重要意义，目前尚无关于棉花卷叶紧密连锁分子标记基因的相关报道，本发明通过筛选与棉花卷叶紧密连锁的snp/indel位点，可以减少育种过程中的盲目性，提高棉花理想株型育种的效率。可为棉花高光效育种提供基因资源和种质资源，同时对探究棉花叶形形成的分子机制具有重要意义。技术实现要素：本发明的目的就在于提供一种与棉花卷叶性状相关的分子标记及其应用，以提供一种新的与棉花卷叶性状紧密连锁的snp/indel分子标记，为棉花卷叶性状的检测提供一种新的方法。本发明通过以下技术方案来实现上述目的：本发明提供了一种与棉花卷叶性状相关的分子标记，该分子标记由一个indel分子标记和4个snp分子标记中的一个或多个indel/snp分子标记组成，命名为indelno.1、snpidno.1-4，均位于棉花第11号染色体上，其中，indelno.1具有棉花第11号染色体第89027119位碱基及其上下游碱基组成的核苷酸序列，snpidno.1具有棉花第11号染色体第89074679位碱基及其上下游碱基组成的核苷酸序列，snpidno.2具有棉花第11号染色体第89074986位碱基及其上下游碱基组成的核苷酸序列，snpidno.3具有棉花第11号染色体第89621017位碱基及其上下游碱基组成的核苷酸序列，snpidno.4具有棉花第11号染色体第89736957位碱基及其上下游碱基组成的核苷酸序列，所述分子标记的突变形式如下表所示：作为本发明的进一步优化方案，该分子标记由2-5个indel/snp分子标记组成。本发明还提供上述分子标记在检测棉花卷叶性状或棉花分子标记辅助育种中的应用。本发明还提供了用于检测上述分子标记的特异性引物序列，如下表所示：本发明还提供了一种用于检测棉花卷叶性状的试剂盒，所述试剂盒包含上述5对特异性引物序列中的一对或多对。本发明还提供了一种利用上述分子标记检测棉花卷叶性状的方法，步骤包括：提取待检测棉花组织dna，利用massarray技术，根据所述分子标记位点信息设计pcr反应和单碱基扩展的特异性引物，以棉花组织dna为模板，利用设计的特异性引物进行pcr扩增、sap消化和延伸，检测snp分子标记位点的基因型，按照下表所示基因型进行判断：若使用其中1个分子标记的检测结果为阔叶或卷叶的基因型，则一般可认为该待检测棉花品种/系即为阔叶或卷叶表型。若使用其中2分子标记的检测结果不一致，可再使用其他分子标记或组合鉴定，以确保检测结果的准确性。用于检测的标记数量越多且一致，检测结果越可靠。本发明的有益效果在于：本发明提供了一种棉花卷叶性状相关的snp/indel分子标记及其应用，该标记用于棉花卷叶性状的鉴定和棉花辅助选择育种，可解决由于棉花生长习性易造成冠层荫蔽，群体光能利用率低等问题，适当卷曲的叶片使叶片维持直立，减少棉花群体阴影面积，从而提高群体光能利用率，为棉花高光效育种奠定基础。本发明提供的与棉花卷叶关联的snp/indel分子标记，直接以dna的形式表现，在棉花的各个组织和发育阶段均可检测，不受环境和季节限制，不存在表达与否等问题影响。通过提取棉花叶片dna进行pcr扩增与参考序列进行比对，对不同检测的单株进行分型，从而有效的区分不同snp/indel位点与不同基因型，对不同棉花叶片样品进行筛选，达到分子标记辅助育种的目的。具体实施方式下面对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。实施例11、材料以新陆早45和m091为亲本，杂交获得f1，自交形成f2为作图群体。2、f2群体的叶形性状调查对f2群体的每个单株进行叶形性状调查，调查结果符合孟德尔分离定律，分离比为3：1，说明卷叶性状是由一对隐性基因控制。3、bsa高通量测序基于以上结果，构建两个性状极端dna混池进行bsa高通量测序。将测序结果与参考基因组比对，排除变异结果中的假阳性，随后利用gatk软件校正snp与indel错误标记，保证检测结果正确可靠。基于基因分型的结果，筛选两个亲本间纯合差异的标记，共挑选出11774个多态性标记。然后依据检测出的snp位点，计算混池样本的snp-index，并且计算两个极端性状混池的频率差值。选取95％置信水平作为筛选的阈值，挑选两个子代在snp-index差异显著的snp位点，即挑选子代2(极端性状b)snp-index接近1，且子代1(极端性状a)snp-index接近0的位点，筛选得到22个多态性标记位点，进一步挑选引起stoploss或者stopgain或者非同义突变或可变剪接的9个突变位点作为候选基因的潜在突变位点。4、snp/indel检测利用massarray技术验证上述筛选得到的snp/indel的准确性和可靠性。结合f2群体单株表型，发现其中5个位于棉花第a11号染色体上的snp/indel标记(见下表)与棉花卷叶性状紧密连锁或共分离。所述snp/indel检测的步骤如下：先根据snp/indel位点设计特异延伸引物，如下所示：根据snp/indel位点信息，设计pcr反应和单碱基扩展的特异性引物，对f2群体中200个单株的叶片进行dna提取和pcr扩增，并将pcr产物碱性磷酸酶处理以进行单碱基延伸随后将反应产物(共9μl)稀释3倍，使用树脂进行脱盐，将脱盐处理后的样品点在样品靶上，自然结晶，最后上机进行质谱检测。各snp/indel分子标记的特异性引物如下表所示：pcr反应过程包括：pcr的反应体系(384孔pcr板+38％的试剂损耗)：pcr反应程序sap消化反应过程包括：sap消化反应体系reagentconcentrationvolume(μl)waterna810.9sapbuffer10x90.1sap1.7u/μl159.0totalsap反应程序temperature(℃)time(second)cycle3740185514∞1延伸反应过程包括：延伸反应体系(384孔pcr板+38％的试剂损耗)延伸反应程序上述结果表明，本发明所述的5个snp/indel位点与棉花卷叶性状紧密连锁，可作为与棉花卷叶性状紧密连锁的分子标记，用于棉花卷叶性状的鉴定。叶片作为棉花株型重要性状之一，本发明对于构建棉花理想株型具有重要意义，并且在一定程度上可以改善由棉花自身生长习性造成的冠层荫蔽，群体光能利用率低等问题，为棉花高光效育种奠定基础。5.结论本发明利用新陆早45与m091杂交获得f1，自交形成f2群体，筛选出与棉花卷叶紧密连锁的5个snp/indel位点。所述snp/indel位点是通过bsa高通量技术筛选得到，为保证结果的正确性与可靠性，本发明利用massarray技术检测上述5个snp/indel位点与棉花卷叶的相关性，结果显示上述5个snp/indel位点与棉花卷叶紧密连锁。利用上述5个snp/indel位点，可以快速有效的鉴定棉花卷叶性状。众所周知，叶片是植物进行光合作用的主要场所，承担了棉花整个生育期90％的营养物质。然而由于棉花自身生长习性，易造成冠层荫蔽，使棉花群体光能利用率低，导致棉花高光效育种慢于其它模式作物。而适当卷曲的叶片可以维持叶片直立，减少阴影面积，以便在不影响光补偿点的情况下提高光饱和点，从而提高群体光能利用率。叶片是作物重要的株型性状之一，对于构建棉花理想株型具有重要意义。实施例2本实施例提供了一种利用与棉花卷叶性状相关的分子标记检测棉花卷叶性状的方法，所述分子标记包括indelno.1、snpidno.1-4中的任意两个或多个，该分子标记的位点及其突变形式如下表所示：利用该分子标记检测棉花卷叶性状的方法，包括以下步骤：(1)利用常规植物组织dna提取方法，提取待检测棉花组织dna；(2)利用massarray技术，根据所述snp分子标记设计特异性引物，序列如下：(3)以棉花组织dna为模板，利用设计的特异性引物进行pcr扩增，扩增体系和程序参照实施例1，获得pcr反应液。(4)将pcr反应液进行sap消化，消化体系和程序参照实施例1，获得sap反应液。(5)将sap反应液进行延伸反应，延伸反应体系和程序参照实施例1，完成获得检测液。(6)利用massarray核酸质谱分析系统进行分析，判断目标位点的碱基类型，并根据下表判断待测棉花品种叶片类型：若使用其中1个分子标记的检测结果为阔叶或卷叶的基因型，则一般可认为该待检测棉花品种/系即为阔叶或卷叶表型。若使用其中2分子标记的检测结果不一致，可再使用其他分子标记或组合鉴定，以确保检测结果的准确性。用于检测的标记数量越多且一致，检测结果越可靠。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。当前第1页1 2 3
背景技术：
：棉花作为棉纺织业的原材料，与人们的日常生活密切相关，是一种全球性的重要经济作物，也是我国重要的经济和战略物资。棉花作为我国最大的商品棉生产基地，对新疆的经济发展有至关重要的作用。然而，由于棉花自身生长特性导致棉花冠层荫蔽，直接影响群体的光能利用效率，导致棉花高光效育种慢于其他模式植物。作物株型是作物为适应环境而表现出的形态结构，直接决定棉花的品质与产量。叶片是光合作用的主要场所，是植物生长发育的主要源器官，承担90％植物生长发育所需的有机物。叶片的形态对于棉花生长发育有重要影响，由于棉花自身生长习性，易造成冠层荫蔽，使棉花群体光能利用率低，导致棉花高光效育种慢于其它模式作物，而适度卷曲的叶片可以维持叶片直立，可减少植株的阴影面积，以便在不影响光补偿点的情况下提高光饱和点，从而提高群体光能利用率，达到提高干物质的积累以及作物产量的目的。另外，棉花卷曲叶片其蜡质含量高于普通阔叶，这有利于在干旱条件下减少植物的蒸腾作用，减少光辐射对叶片的伤害，同时对抗虫也有非常重要的意义。叶片是作物重要的株型性状之一，对于构建棉花理想株型具有重要意义，目前尚无关于棉花卷叶紧密连锁分子标记基因的相关报道，本发明通过筛选与棉花卷叶紧密连锁的snp/indel位点，可以减少育种过程中的盲目性，提高棉花理想株型育种的效率。可为棉花高光效育种提供基因资源和种质资源，同时对探究棉花叶形形成的分子机制具有重要意义。技术实现要素：本发明的目的就在于提供一种与棉花卷叶性状相关的分子标记及其应用，以提供一种新的与棉花卷叶性状紧密连锁的snp/indel分子标记，为棉花卷叶性状的检测提供一种新的方法。本发明通过以下技术方案来实现上述目的：本发明提供了一种与棉花卷叶性状相关的分子标记，该分子标记由一个indel分子标记和4个snp分子标记中的一个或多个indel/snp分子标记组成，命名为indelno.1、snpidno.1-4，均位于棉花第11号染色体上，其中，indelno.1具有棉花第11号染色体第89027119位碱基及其上下游碱基组成的核苷酸序列，snpidno.1具有棉花第11号染色体第89074679位碱基及其上下游碱基组成的核苷酸序列，snpidno.2具有棉花第11号染色体第89074986位碱基及其上下游碱基组成的核苷酸序列，snpidno.3具有棉花第11号染色体第89621017位碱基及其上下游碱基组成的核苷酸序列，snpidno.4具有棉花第11号染色体第89736957位碱基及其上下游碱基组成的核苷酸序列，所述分子标记的突变形式如下表所示：作为本发明的进一步优化方案，该分子标记由2-5个indel/snp分子标记组成。本发明还提供上述分子标记在检测棉花卷叶性状或棉花分子标记辅助育种中的应用。本发明还提供了用于检测上述分子标记的特异性引物序列，如下表所示：本发明还提供了一种用于检测棉花卷叶性状的试剂盒，所述试剂盒包含上述5对特异性引物序列中的一对或多对。本发明还提供了一种利用上述分子标记检测棉花卷叶性状的方法，步骤包括：提取待检测棉花组织dna，利用massarray技术，根据所述分子标记位点信息设计pcr反应和单碱基扩展的特异性引物，以棉花组织dna为模板，利用设计的特异性引物进行pcr扩增、sap消化和延伸，检测snp分子标记位点的基因型，按照下表所示基因型进行判断：若使用其中1个分子标记的检测结果为阔叶或卷叶的基因型，则一般可认为该待检测棉花品种/系即为阔叶或卷叶表型。若使用其中2分子标记的检测结果不一致，可再使用其他分子标记或组合鉴定，以确保检测结果的准确性。用于检测的标记数量越多且一致，检测结果越可靠。本发明的有益效果在于：本发明提供了一种棉花卷叶性状相关的snp/indel分子标记及其应用，该标记用于棉花卷叶性状的鉴定和棉花辅助选择育种，可解决由于棉花生长习性易造成冠层荫蔽，群体光能利用率低等问题，适当卷曲的叶片使叶片维持直立，减少棉花群体阴影面积，从而提高群体光能利用率，为棉花高光效育种奠定基础。本发明提供的与棉花卷叶关联的snp/indel分子标记，直接以dna的形式表现，在棉花的各个组织和发育阶段均可检测，不受环境和季节限制，不存在表达与否等问题影响。通过提取棉花叶片dna进行pcr扩增与参考序列进行比对，对不同检测的单株进行分型，从而有效的区分不同snp/indel位点与不同基因型，对不同棉花叶片样品进行筛选，达到分子标记辅助育种的目的。具体实施方式下面对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。实施例11、材料以新陆早45和m091为亲本，杂交获得f1，自交形成f2为作图群体。2、f2群体的叶形性状调查对f2群体的每个单株进行叶形性状调查，调查结果符合孟德尔分离定律，分离比为3：1，说明卷叶性状是由一对隐性基因控制。3、bsa高通量测序基于以上结果，构建两个性状极端dna混池进行bsa高通量测序。将测序结果与参考基因组比对，排除变异结果中的假阳性，随后利用gatk软件校正snp与indel错误标记，保证检测结果正确可靠。基于基因分型的结果，筛选两个亲本间纯合差异的标记，共挑选出11774个多态性标记。然后依据检测出的snp位点，计算混池样本的snp-index，并且计算两个极端性状混池的频率差值。选取95％置信水平作为筛选的阈值，挑选两个子代在snp-index差异显著的snp位点，即挑选子代2(极端性状b)snp-index接近1，且子代1(极端性状a)snp-index接近0的位点，筛选得到22个多态性标记位点，进一步挑选引起stoploss或者stopgain或者非同义突变或可变剪接的9个突变位点作为候选基因的潜在突变位点。4、snp/indel检测利用massarray技术验证上述筛选得到的snp/indel的准确性和可靠性。结合f2群体单株表型，发现其中5个位于棉花第a11号染色体上的snp/indel标记(见下表)与棉花卷叶性状紧密连锁或共分离。所述snp/indel检测的步骤如下：先根据snp/indel位点设计特异延伸引物，如下所示：根据snp/indel位点信息，设计pcr反应和单碱基扩展的特异性引物，对f2群体中200个单株的叶片进行dna提取和pcr扩增，并将pcr产物碱性磷酸酶处理以进行单碱基延伸随后将反应产物(共9μl)稀释3倍，使用树脂进行脱盐，将脱盐处理后的样品点在样品靶上，自然结晶，最后上机进行质谱检测。各snp/indel分子标记的特异性引物如下表所示：pcr反应过程包括：pcr的反应体系(384孔pcr板+38％的试剂损耗)：pcr反应程序sap消化反应过程包括：sap消化反应体系reagentconcentrationvolume(μl)waterna810.9sapbuffer10x90.1sap1.7u/μl159.0totalsap反应程序temperature(℃)time(second)cycle3740185514∞1延伸反应过程包括：延伸反应体系(384孔pcr板+38％的试剂损耗)延伸反应程序上述结果表明，本发明所述的5个snp/indel位点与棉花卷叶性状紧密连锁，可作为与棉花卷叶性状紧密连锁的分子标记，用于棉花卷叶性状的鉴定。叶片作为棉花株型重要性状之一，本发明对于构建棉花理想株型具有重要意义，并且在一定程度上可以改善由棉花自身生长习性造成的冠层荫蔽，群体光能利用率低等问题，为棉花高光效育种奠定基础。5.结论本发明利用新陆早45与m091杂交获得f1，自交形成f2群体，筛选出与棉花卷叶紧密连锁的5个snp/indel位点。所述snp/indel位点是通过bsa高通量技术筛选得到，为保证结果的正确性与可靠性，本发明利用massarray技术检测上述5个snp/indel位点与棉花卷叶的相关性，结果显示上述5个snp/indel位点与棉花卷叶紧密连锁。利用上述5个snp/indel位点，可以快速有效的鉴定棉花卷叶性状。众所周知，叶片是植物进行光合作用的主要场所，承担了棉花整个生育期90％的营养物质。然而由于棉花自身生长习性，易造成冠层荫蔽，使棉花群体光能利用率低，导致棉花高光效育种慢于其它模式作物。而适当卷曲的叶片可以维持叶片直立，减少阴影面积，以便在不影响光补偿点的情况下提高光饱和点，从而提高群体光能利用率。叶片是作物重要的株型性状之一，对于构建棉花理想株型具有重要意义。实施例2本实施例提供了一种利用与棉花卷叶性状相关的分子标记检测棉花卷叶性状的方法，所述分子标记包括indelno.1、snpidno.1-4中的任意两个或多个，该分子标记的位点及其突变形式如下表所示：利用该分子标记检测棉花卷叶性状的方法，包括以下步骤：(1)利用常规植物组织dna提取方法，提取待检测棉花组织dna；(2)利用massarray技术，根据所述snp分子标记设计特异性引物，序列如下：(3)以棉花组织dna为模板，利用设计的特异性引物进行pcr扩增，扩增体系和程序参照实施例1，获得pcr反应液。(4)将pcr反应液进行sap消化，消化体系和程序参照实施例1，获得sap反应液。(5)将sap反应液进行延伸反应，延伸反应体系和程序参照实施例1，完成获得检测液。(6)利用massarray核酸质谱分析系统进行分析，判断目标位点的碱基类型，并根据下表判断待测棉花品种叶片类型：若使用其中1个分子标记的检测结果为阔叶或卷叶的基因型，则一般可认为该待检测棉花品种/系即为阔叶或卷叶表型。若使用其中2分子标记的检测结果不一致，可再使用其他分子标记或组合鉴定，以确保检测结果的准确性。用于检测的标记数量越多且一致，检测结果越可靠。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。当前第1页1 2 3
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