一种用于生物组织样本检测细菌污染的质检方法与流程

本发明属于生物工程质检技术领域，具体涉及一种用于生物组织样本检测细菌污染的质检方法。

背景技术：

随着生物技术的发展，临床治疗选择更广泛，除了传统的放射治疗、化学药物治疗和手术治疗，近年来靶向药物治疗和免疫治疗取得了巨大的进步，而靶向治疗和免疫治疗的针对性很强，每种药物都有特异的作用位点，患者只有携带特定的变异位点才能选择相应的药物进行治疗，这就要求患者在选择药物前需要进行基因检测才能更好地进行用药。

临床用药指导进行基因检测中很多项目只检测dna，但是dna并不完全包含药物治疗靶点，比如基因融合、基因结构变异和基因表达水平等并不能通过dna序列得到，而rna是重要的遗传物质，基因中编码的信息被转录成rna分子，而rna分子又可以翻译成蛋白质或直接用于精细控制基因表达。因此，以一定条件和时间转录的rna反映了细胞的当前状态，并可以揭示疾病的病理机制，而且rna在科研活动中也有着广泛的应用。

临床上进行检测的样本来源主要是福尔马林固定的石蜡包埋（formalin-fixedandparrffin-embedded，ffpe）的组织样本，因此，进行用药指导的基因检测必须首先从ffpe样本中提取rna，然后进行rna测序得到需要的基因信息，所以，ffpe的质量决定了最终能够得到的信息的准确性。

细菌体积小、形状多样、种类繁多、繁殖快、生命力顽强，在基础研究和临床试验中危害极大。ffpe样本在取样和保存过程中如果没有严格按照标准操作规程操作容易滋生细菌，细菌污染会导致从ffpe样本中提取的核酸不完全是人类基因还包括细菌基因，而且细菌滋生还会使ffpe中人类基因严重降解，这都会影响得到的基因质量，进而影响检测结果的准确性。所以从ffpe样本中检测细菌污染对于rna测序是很重要的一个质控。

目前临床应用中对于ffpe样本提取核酸是否有细菌污染并不重视，急需一种简便快捷的方法作为整个流程的质控，来避免有细菌污染的核酸进入下一环节继续实验影响最终结果的准确性。随着pcr、基因测序等技术的不断进步，细菌检测由最初的表型和化学鉴定演变成分子水平的研究。荧光定量pcr（rt-qpcr）方法因其特异性好、速度快、灵敏度高、重复性好、定量准确等优点成为分子生物学研究中的重要工具。

目前的细菌检测只扩增细菌16srrna保守区序列，指标单一，不能很好的反映ffpe样本中提取的rna质量，而人的管家基因（人actb）高度保守而且表达水平受环境因素影响较小，可以反映人基因状态。

因此，本发明提出一种通过检测ffpe样本中提取的rna中细菌16srrna和人actb，能够更好地体现rna质量，有利于rna的后续研究及应用。

技术实现要素：

为了解决现有技术中检测ffpe组织样本中细菌方法存在的检测指标单一、检测结果的准确度不高、特异性差、耗时长等问题，本发明在于提供一种用于生物组织样本检测细菌污染的质检方法，利用rt-qpcr反应，通过扩增细菌16srrna部分保守区序列和人actb检测细菌污染的方法，将细菌污染程度与δct相关联，具有高的灵敏度和特异性、耗时短的优点。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种用于生物组织样本检测细菌污染的质检方法，包括如下步骤：

（1）分别配制两种rt-qpcr反应体系，分别用于扩增细菌16srrna和人actb：

向扩增细菌16srrna反应体系中加入正向引物seqidno.1、反向引物seqidno.2和生物组织样本rna模板，进行rt-qpcr扩增反应；

向扩增人actb反应体系中加入正向引物seqidno.3、反向引物seqidno.4和生物组织样本rna模板，进行rt-qpcr扩增反应；

（2）分析步骤（1）扩增后的细菌16srrna的ct值和人actb的ct值，若细菌16srrna的ct值和人actb的ct值均＞30，则直接判定生物组织样本质控不合格；

若细菌16srrna的ct值或人actb的ct值≤30，则对两者的ct值求差值δct=ct(actb)-ct(16s)；

所述ct(16s)为细菌16srrna扩增的ct值，表示细菌16srrna的表达含量，所述ct(actb)为人actb扩增的ct值，表示人actb的表达含量；

（3）比较δct与阈值的关系：若高于阈值，则待测样本为阳性，判定质控不合格；若低于阈值，则待测样本为阴性，判定质控合格。

进一步地，所述正向引物seqidno.1和所述反向引物seqidno.2用于扩增细菌16srrna保守区序列，所述细菌16srrna保守区序列为seqidno.5。

细菌16srrna序列具有高度的保守性，较强的普遍性。细菌16srrna的特点：（1）多拷贝，检测敏感性高；（2）多信息，由可变区和保守区组成，保守区为大部分细菌所有，可根据保守区设计通用引物，利用可变区设计出细菌特异引物，作为细菌检测最理想的序列。

进一步地，所述正向引物seqidno.3和所述反向引物seqidno.4用于扩增人actb保守区序列，所述人actb保守区序列为seqidno.6。

人actb基因是人基因组的一个管家基因，在大多数细胞中表达水平相对稳定。这也是人们常用其作为内参的原因，可以反映人类基因状态。

优选地，所述正向引物seqidno.1、反向引物seqidno.2、正向引物seqidno.3和反向引物seqidno.4为硫代修饰后的引物。

本发明所使用的上述pcr用引物进行了硫代修饰，能够特异性扩增细菌16srrna保守区序列和人actb保守区序列，有利于更好的扩增，提高后续细菌检测判定的灵敏度和特异性。

进一步地，所述生物组织样本为福尔马林固定的石蜡包埋的生物组织样本；步骤（1）中所述生物组织样本rna模板分别为福尔马林固定的石蜡包埋的生物组织样本提取的rna；

进一步地，步骤（1）中所述rt-qpcr扩增反应的条件为：第一阶段为逆转录阶段，50℃10min；第二阶段为预变性阶段，95℃5min；第三阶段为pcr反应阶段，95℃10s，60℃30s；第四阶段扩增产物熔解阶段，95℃15s，60℃1min，95℃15s，60℃15s。

步骤（3）中所述阈值的确定方法为，将高于某一δct的检测结果判定为阳性，低于该δct的检测结果判定为阴性，将该δct作为阈值。

ngs测序得到的样本提取rna的细菌含量超过10%判定为不合格，细菌含量低于10%判定为合格，高于某一δct值判定为阳性样本，低于该δct值判定为阴性样本，然后，计算灵敏度和特异性，所述灵敏度=（真阳性样本数/ngs测序判定的不合格样本数）*100%，所述特异性=（真阴性样本数/ngs测序判定的合格样本数）*100%，以最佳灵敏度和特异性时的δct值为阈值。其中真阳性样本数为判定为阳性样本中被ngs测序判定的不合格样本数量，真阴性样本数为判定为阴性样本中被ngs测序判定的合格样本数量。

优选地，所述阈值为4，具有较高的灵敏度（86.7%）和特异性（93.8%）。

相对于现有技术，本发明具有如下效果：

（1）本发明分别筛选能够特异性增加检测性能的细菌16srrna保守区序列（如seqidno.5所示）和人actb保守序列（如seqidno.6所示），该细菌16srrna保守区序列和人actb保守区序列能够特异性代表细菌和人的基因。

（2）相对于现有技术中采用仅针对单一指标细菌16srrna检测，可能导致误判的风险，不能很真实的反应生物组织样本中提取的rna的质量，本发明通过同步检测生物组织样本中提取的rna中细菌16srrna和人actb，利用其扩增后的ct值求差值δct（ct(actb)-ct(16s)）与生物组织样本中提取的rna中细菌含量的关系，进而确定生物组织样本的rna质量，具有较高的灵敏度（86.7%）和特异性（93.8%）。

附图说明

图1为ffpe样本提取的rna经rt-qpcr检测过程中，人actb和细菌16srrna扩增ct值与ngs验证的细菌含量的曲线图；

图2为通过rt-qpcr检测质控品的人actb和细菌16srrna扩增曲线；

图3为ffpe提取rna通过rt-qpcr检测过程中，不同阈值对应的灵敏度和特异性曲线。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一、引物对及质控品的准备

（1）用于扩增细菌16srrna的正向引物seqidno.1：5’-cctacgggnggcwgcag-3’；反向引物seqidno.2：5’-gactachvgggtatctaatcc-3’；

（2）用于扩增人actb的正向引物seqidno.3：5’-catccgcaaagacctgtacg-3’；反向引物seqidno.4：5’-cctgcttgctgatccacatc-3’；

（3）细菌16srrna保守区序列seqidno.5：gccccgcggtgcattagctagttggtagggtaacggcctaccaaggcaatgatgcatagccgagttgagagactgatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcaacagtggaactccatgtgtagcggtggaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggctctctggtctgcaactgacgctgaggctcgaaagcatgggtagcgaacaggattagagaccctggtagtccatgcc；

（4）人actb保守区序列seqidno.6：tgtggcatccacgaaactaccttcaactccatcatgaagtgtgacgtggacatccgcaaagacctgtacgccaacacagtgctgtctggcggcaccaccatgtaccctggcattgccgacaggatgcagaaggagatcactgccctggcacccagcacaatgaagatcaagatcattgctcctcctgagcgcaagtactccgtgtggatcggcggctccatcctggcctcgctgtccaccttccagcagatgtggatcagcaagcaggagtatgacgagtccggcccctccatcgtccaccgcaaatgcttctaggcggactatgacttagttgcgttacaccct；

（5）质控品包括阳性质控品和阴性质控品，质控品是从ffpe样本中提取的经过ngs验证的rna，阳性质控品是包含细菌16srrna的细菌rna和包含人actb的人rna混合物，阴性质控品仅包含人actb的人rna。

二、一种用于福尔马林固定的石蜡包埋（ffpe）的生物组织样本检测细菌污染的质检方法

实施例1

确定人actb和细菌16srrna扩增ct值与ngs验证的细菌污染程度的关系：

（1）样本准备：经过ngs检测的不同细菌污染程度的ffpe提取的rna，用rnasefreeddh2o稀释到100ng；

（2）配制两种rt-qpcr反应体系，分别用于扩增细菌16srrna和人actb：向扩增细菌16srrna反应体系中加入200nm正向引物seqidno.1、200nm反向引物seqidno.2和100ngffpe样本rna模板（经过ngs检测的不同细菌污染程度的ffpe提取的rna），进行rt-qpcr扩增反应；

向扩增人actb反应体系中加入200nm正向引物seqidno.3、200nm反向引物seqidno.4和100ngffpe样本rna模板（经过ngs检测的不同细菌污染程度的ffpe提取的rna），进行rt-qpcr扩增反应；

所述rt-qpcr扩增反应的条件：第一阶段为逆转录阶段，50℃10min；第二阶段为预变性阶段，95℃5min；第三阶段为pcr反应阶段，95℃10s，60℃30s；第四阶段扩增产物熔解阶段，95℃15s，60℃1min，95℃15s，60℃15s；

（3）根据步骤（2）扩增后的ngs验证的不同细菌污染程度的样本的ct值，相关数据如表1所示，相应的趋势图如图1所示：

表1

根据结果表明：随着ffpe样本提取的rna中细菌占比升高，人actb的ct值随之增加，而细菌16srrna的ct值随之减小，说明人actb和细菌16srrna的ct值与细菌含量有相关性，可以通过δct=ct(actb)-ct(16s)）反映ffpe提取的rna中细菌占比情况。

实施例2

阴阳性阈值的确定：

（1）样本准备：从60例ffpe样本中提取rna，并用rnasefreeddh2o稀释到100ng；

（2）采用实施例1中步骤（2）相同的方法对60例ffpe样本提取的rna进行扩增，同时采用与样本相同的体系及条件对质控品进行扩增，以确认样本检测体系的准确性，质控品的扩增曲线如图2所示；

（3）根据步骤（2）对60例ffpe样本提取的rna进行扩增的ct值，如果待检测样本扩增后细菌16srrna和人actb的ct值均>30，则直接判定为样本质控不合格；如果待检测样本扩增后细菌16srrna或人actb的ct值=<30，则计算δct=ct(actb)-ct(16s)，高于某一δct值判定为阳性样本，低于该δct值判定为阴性样本；

（4）60例ffpe样本中提取的rna同时进行ngs检测，并根据ngs检测结果进行判断，细菌占比超过10%判定为不合格，细菌占比低于10%判定为合格；

（5）根据步骤（3）判断得到的阴性样本和阳性样本的结果与步骤（4）ngs检测判定是否合格的结果进行计算该δct值作为阈值的灵敏度和特异性，所述灵敏度=（真阳性样本数/ngs测序判定的不合格样本数）*100%，所述特异性=（真阴性样本数/ngs测序判定的合格样本数）*100%。其中真阳性样本数为判定为阳性样本中被ngs测序判定的不合格样本数量，真阴性样本数为判定为阴性样本中被ngs测序判定的合格样本数量。

可以看出，不同的阈值得到不同的灵敏度和特异性，如图3所示：取阈值为4时，灵敏度和特异性最佳，此时的灵敏度为86.7%，特异性为93.8%；

所以，根据δct=ct(actb)-ct(16s)与阈值的关系：若δct值高于阈值，则待测样本为阳性，判定质控不合格；若δct值低于阈值，则待测样本为阴性，判定质控合格。

可见，本发明的一种福尔马林固定的石蜡包埋（ffpe）的生物组织样本中检测细菌的质检方法，采用同步检测ffpe样本中提取的rna中细菌16srrna和人actb，利用其扩增后的ct值求差值δct（ct(actb)-ct(16s)）与ffpe样本中提取的rna中细菌含量的关系，进而确定ffpe样本的rna质量，具有较高的灵敏度（86.7%）和特异性（93.8%），检测结果能够准确的体现ffpe样本提取rna的质量，且检测方便，耗时短。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>臻和（北京）生物科技有限公司

臻和精准医学检验实验室无锡有限公司

<120>一种用于生物组织样本检测细菌污染的质检方法

<130>2020

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>17

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>misc_feature

<222>(9)..(9)

<223>nisa,c,g,ort

<400>1

cctacgggnggcwgcag17

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gactachvgggtatctaatcc21

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

catccgcaaagacctgtacg20

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

cctgcttgctgatccacatc20

<210>5

<211>267

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

gccccgcggtgcattagctagttggtagggtaacggcctaccaaggcaatgatgcatagc60

cgagttgagagactgatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggag120

gcaacagtggaactccatgtgtagcggtggaatgcgtagatatatggaagaacaccagtg180

gcgaaggcggctctctggtctgcaactgacgctgaggctcgaaagcatgggtagcgaaca240

ggattagagaccctggtagtccatgcc267

<210>6

<211>345

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

tgtggcatccacgaaactaccttcaactccatcatgaagtgtgacgtggacatccgcaaa60

gacctgtacgccaacacagtgctgtctggcggcaccaccatgtaccctggcattgccgac120

aggatgcagaaggagatcactgccctggcacccagcacaatgaagatcaagatcattgct180

cctcctgagcgcaagtactccgtgtggatcggcggctccatcctggcctcgctgtccacc240

ttccagcagatgtggatcagcaagcaggagtatgacgagtccggcccctccatcgtccac300

cgcaaatgcttctaggcggactatgacttagttgcgttacaccct345

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