一种核酸适配体文库的高通量测序文库构建方法与流程

本发明涉及核酸适配体筛选技术领域，具体涉及一种核酸适配体文库的高通量测序文库构建方法。

背景技术：

核酸适配体是能够与目标物高亲和特异性结合的单链短dna/rna，其不仅具有高度稳定的三维结构和低免疫原性，而且合成简便、无批次之间差异，因此被广泛应用于环境监察、食品安全检查以及临床诊断和治疗。核酸适配体文库可以根据不同类型指数富集配体系统进化技术(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，selex)从10¹⁴～10¹⁶单链核酸组成的文库中筛选获得，这些单链核酸序列由中间随机序列和两端固定引物结合序列组成。

对于核酸适配体序列优化的方法主要有酶切保护实验、生物信息预测、芯片分析法、二代测序法等，其中，二代测序技术是目前应用较广的核酸适配体序列优化方法。核酸适配体文库在二代测序的pcr过程中容易造成气溶胶污染同时也易产生扩增偏好性和引物残留问题，从而一定程度地影响适配体筛选的准确性。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种核酸适配体文库的高通量测序文库构建方法，利用该方法构建得到的高通量测序文库能够准确、完整地保留核酸适配体文库的真实信息，提高核酸适配体文库筛选的准确性。

为实现上述目的，本发明通过在测序文库构建前先去除核酸适配体文库中因selex扩增等残留的引物，再利用pcr-free技术进行测序文库构建，有效解决了pcr扩增偏好性和引物残留问题，更准确保留了核酸适配体文库的原始信息，提高了适配体文库筛选的准确性。

具体地，本发明的技术方案如下：

本发明提供一种核酸适配体文库的高通量测序文库的构建方法，包括：将靶向筛选得到的核酸适配体文库去除引物残留后再构建pcr-free测序文库。

以上所述方法中，去除引物残留采用能够去除小片段核酸的膜纯化方法。

优选地，采用能够去除≤70bp核酸的硅胶柱膜纯化方法去除引物残留。

以上所述的膜纯化去除引物残留可采用常规的膜纯化操作方法进行，例如：所述方法至少包括：将核酸适配体文库与结合液混合后上柱、结合、漂洗、洗脱等步骤。

作为本发明的一种实施方式，采用qiagenminelutepcr纯化试剂盒去除核酸适配体文库中的引物残留。

利用膜纯化方法虽然能够有效去除核酸适配体文库中的引物残留，但同时会使得核酸适配体文库的总量一定程度的降低，因此，本发明进一步通过优化pcr-free测序文库构建方法更好地保证了测序文库的构建效率和质量。

本发明所述的pcr-free测序文库的构建包括如下步骤：

(1)末端修复和3’末端加a；

(2)接头连接。

以上步骤(2)中，接头连接的反应条件为：18℃～30℃反应30～50min。

采用上述常规反应程序可实现接头连接，但是，本发明发现，将常规的一步接头连接反应分开两步进行，且第二步反应的温度略低于第一步反应的温度，并合理控制两步反应的时间，能够显著提高经膜纯化处理后的模板的与pcr-free接头的连接效率，进而显著提高测序文库的构建效率和质量。

优选地，所述接头连接的反应条件为：23～28℃反应5～15min，18～22℃反应20～40min。

其中，最优选的接头连接的反应条件为：24℃反应10min，22℃反应30min。

以上步骤(2)中，接头连接的反应体系中，接头与末端修复和3’末端加a产物的摩尔比为10：1～100：1。本发明发现，将接头连接反应体系中接头与末端修复和3’末端加a产物的摩尔比控制在上述范围内能够有效提高经膜纯化处理后的模板的接头连接效率，进而提高测序文库的构建效率和质量。

优选地，接头与末端修复和3’末端加a产物的摩尔比为20：1～30：1。

具体地，所述接头连接的65μl反应体系如下：t4dna连接酶10～50u/μl，反应体系总体积1/10的10×反应缓冲液，接头10～60pmol，末端修复和3’末端加a产物0.5～2pmol，以水补足反应体系。

以上步骤(1)中，末端修复和3’末端加a的反应体系如下：datp0.6～0.7mm，dctp0.2～0.3mm，dttp0.2～0.3mm，dgtp0.2～0.3mm，atp0.2～0.3mm，tris-hcl15～25mm，kcl25～35mm，mgcl21～1.5mm，dtt3.5～4.5mm，t4dna聚合酶0.01～0.03u/μl，t4多聚核苷酸激酶0.08～0.12u/μl，taqdna聚合酶0.01～0.02u/μl，纯化后的核酸适配体文库0.02ng～20ng/μl，以水补足反应体系。

更优选的反应体系如下：datp0.7mm，dctp0.2mm，dttp0.2mm，dgtp0.2mm，atp0.2mm，tris-hcl20mm，kcl30mm，mgcl21.2mm，dtt4mm，t4dna聚合酶0.02u/μl，t4多聚核苷酸激酶0.1u/μl，taqdna聚合酶0.01u/μl，纯化后的核酸适配体文库1ng/μl，以水补足反应体系。

以上步骤(1)中，末端修复和3’末端加a的反应条件如下：20℃～30℃反应20～30min；72℃，反应10min～20min。

以上所述的pcr-free测序文库的构建还包括在接头连接后，采用磁珠纯化接头连接产物的步骤。

本发明发现，在磁珠纯化步骤中，一定程度地降低磁珠的用量能够有效降低接头残留，更准确地保留核酸适配体文库的信息。

优选地，所述磁珠的用量为与所述接头连接产物的体积比为(0.8～2)：1。将磁珠用量控制在上述范围内，既能够保证纯化效果，又能够有效降低接头残留。更优选采用磁珠与所述接头连接产物的体积比为1：1进行纯化。

以上所述的磁珠可使用vazymednaclean磁珠。

本发明提供利用以上所述的构建方法构建得到的核酸适配体文库的高通量测序文库。

本发明提供一种核酸适配体文库的高通量测序方法，其为利用所述核酸适配体文库的高通量测序文库的构建方法进行测序文库的构建，再对文库进行高通量测序。

本发明还提供所述高通量测序文库的构建方法在核酸适配体筛选中的应用。

本发明所述的高通量测序具体为二代高通量测序。

本发明的有益效果如下：

(1)利用硅胶柱膜纯化技术降低了核酸适配体文库本身因多轮pcr扩增产生的引物残留，从而增加了后续有效数据的产出和分析，实现核酸适配体文库真实信息的完整保留，能够更加准确地反映核酸适配体文库中与目标物质结合特异性的趋势。

(2)利用pcr-free建库技术避免了pcr扩增过程中气溶胶的污染，也避免了pcr扩增偏好性以及扩增酶性能差异导致的碱基偏好，保证了测序数据分析的有效性。同时，通过对pcr-free建库方法的优化保证了测序文库的构建效率和文库的质量，降低了文库的接头残留。

(3)利用本发明提供的方法对核酸适配体文库进行高通量测序，可以结合前期特异性核酸适配体筛选对核酸适配体中所有单个核酸在每个循环中占比进行趋势分析，从而筛选出适配体文库中与目标物质结合特异性强的核酸序列，实现利用测序数据直接反映核酸适配体文库与目标物质的结合特异性，可在实践中用于核酸适配体文库中与目标物质结合的特异性序列的筛选。

附图说明

图1为本发明实施例1中核酸适配体文库的高通量测序文库构建方法的流程示意图。

图2、图3为本发明实验例1中对实施例1的文库构建方法构建得到的文库样品利用agilent2100生物芯片分析系统进行核酸适配体文库纯化前的质控结果，其中图2为样品s059-01-8纯化前的质控结果，图3为样品s059-01-6纯化前的质控结果。

图4、图5和图6为本发明实验例1中对实施例2的文库构建方法构建得到的文库样品利用agilent2100生物芯片分析系统进行3个核酸适配体文库纯化前的质控结果；其中，图4为样品s059-01-9的检测结果，图5为样品s059-01-10的检测结果，图6为样品s059-01-11的检测结果。

图7、图8为本发明实验例1中对实施例1的文库构建方法构建得到的文库样品利用agilent2100生物芯片分析系统进行2个核酸适配体文库纯化建库完成后的文库质控结果；其中，图7为样品s059-01-6的检测结果，图8为样品s059-01-8的检测结果。

图9、图10和图11为本发明实验例1中对实施例2的文库构建方法构建得到的文库样品利用agilent2100生物芯片分析系统进行3个核酸适配体文库纯化建库完成后的文库质控结果；其中，图9为样品s059-01-9的检测结果，图10为样品s059-01-10的检测结果，图11为样品s059-01-11的检测结果。

图12本发明实验例1中对利用对比例1的文库构建方法构建得到的文库样品利用agilent2100生物芯片分析系统进行核酸适配体文库s059-r01纯化前的质控结果。

图13为本发明实验例1中对利用对比例1的文库构建方法构建得到的文库样品利用agilent2100生物芯片分析系统进行核酸适配体文库s059-r01纯化建库完成后的文库质控结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1核酸适配体文库的高通量测序文库构建方法(1)

本实施例提供一种核酸适配体文库的高通量测序文库构建方法，该方法的流程示意图如图1所示，具体包括如下步骤：

1、使用qiagenminelutepcr纯化试剂盒对核酸适配体pcr产物混库纯化

(1)取待纯化样品5倍体积的pb与待纯化样品混匀，加入硅胶膜式纯化柱中，将硅胶膜式纯化柱放置在2ml收集管上，静置2min，使得核酸与柱膜充分结合。

(2)8000rpm离心1min，弃除废液。

(3)向纯化柱中加入750μlpe(已加入无水乙醇并混匀)，然后8000rpm离心1min，弃除废液，除去小片段核酸以及dmso、染料等其他杂质。

(4)12000rpm离心2min，弃除柱中残留废液。

(5)将纯化柱放在新1.5ml离心管上并加入20μl洗脱液buffereb(10mmtris·hcl,ph8.5)静置2min，然后12000rpm离心2min；离心后的液体即为纯化后的核酸适配体，可保存于-20℃。

2、对纯化后pcr产物混库进行末端修复和3’末端加“a”碱基反应体系如下：

补水至50μl。

反应条件为22℃，反应30min；72℃，反应10min。

3、末端修复产物连接接头反应

反应体系如下：

补水至65μl。

反应条件为24℃反应10min；22℃反应30min。

4、磁珠纯化

在步骤3的接头连接产物溶液中加入78μlvazymednaclean磁珠(接头连接产物与磁珠的体积比为1.2:1)轻弹混匀后室温静置5min；将样品管置于磁力架上，静置5min使磁珠被完全吸附到磁铁一侧，移弃上清液；将样品管置于磁力架上，加入200μl的80％乙醇，将样品管置于磁力架上静置30s，移弃上清液；重复清洗一次，在第二次清洗移弃上清液后瞬时离心，将样品管置于磁力架上，将上清液去除干净；将样品管置于磁力架上，打开管盖，干燥至残留乙醇挥发干净，加入20μl的nuclease-free水，轻弹混匀，室温静置5min；再置于磁力架上静置10min，吸取19μl洗脱液，即得核酸适配体测序文库。

实施例2核酸适配体文库的高通量测序文库构建方法(2)

本实施例提供一种核酸适配体文库的高通量测序文库构建方法，其与实施例1的方法的区别仅在于步骤3中采用24℃反应10min，22℃反应20min。

对比例1

本对比例提供一种核酸适配体文库的高通量测序文库构建方法，其与实施例1的方法的区别仅在于步骤3中采用24℃反应5min，22℃反应15min。

实验例1引物残留去除效果检测

利用agilent2100生物芯片分析系统检测利用实施例1的方法构建的s059-01-6和s059-01-8核酸适配体文库样品、利用实施例2的方法构建的s059-01-9、s059-01-10、s059-01-11核酸适配体库样品以及利用对比例1的方法构建的s059-r01核酸适配体文库样品在步骤1的硅胶柱膜纯化前和纯化后的文库质量。当存在引物残留时会在70bp以下的位置检测到小峰。纯化前的检测结果如图2、图3、图4、图5、图6和图12所示，纯化并建库完成后的检测结果如图7、图8、图9、图10、图11和图13所示，结果显示，纯化前在小于70bp位置有多个小峰出现，证明存在引物残留，而纯化建库完成后在小于70bp位置无峰出现，且仅存90bp左右未连接上接头的片段和220bp左右连接上接头的片段两个峰，证明无引物残留。以上结果表明，硅胶柱膜纯化可有效去除核酸适配体文库中的引物残留。

实验例2测序文库的质量产出和测序数据产出分析

对利用以上实施例1、实施例2和对比例1的建库方法构建的高通量测序文库进行文库的质量产出以及测序数据产出分析，结果如表1和表2所示，结果表明，利用实施例1的方法构建的核酸适配体文库样品的测序文库均具有较高的浓度及有效数据90％左右，利用实施例2的方法构建的核酸适配体文库样品的测序文库比实施例1的文库的浓度及有效数据稍差，测序有效数据能有80％左右，对比例1的方法构建的文库s059-r01的有效浓度、qpcr浓度及数据产出明显低于实施例1和2。

表1核酸适配体最终测序文库的质量产出

表2核酸适配体最终测序文库的数据产出

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

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