包含三硫代磷酸酯核苷间键的寡核苷酸的制作方法

本发明涉及一种寡核苷酸，其包含至少一个式(i)的三硫代磷酸酯核苷间键

其中两个桥接硫原子中的一个与dna核苷或rna核苷(a¹)的3'碳原子相连接，并且另一个与另一核苷(a²)的5'碳原子相连接，并且其中r为氢或磷酸酯保护基。

背景技术：

短的合成核酸表现出作为治疗剂的巨大潜力。自20世纪70年代后期首次概念验证研究(证明未经修饰的脱氧核苷酸能够在体外抑制病毒的产生(p.c.zamecnik,m.l.stephenson,proc.nat.acad.sci.usa1978,75,280-284))以外，通过化学修饰已经取得了显著进展。由于对于核酸降解的敏感性，核酸的磷酸二酯主链的稳定化是化学优化治疗性寡核苷酸的一个明显的起点。因此，人们已经研究了各种磷酸酯修饰，包括硫代磷酸酯(ps)(f.eckstein,antisenseandnucleicaciddrugdevelopment2009,10,117-121)、二硫代磷酸酯(例如，w.t.weisler，m.h.caruthers，j.org.chem1996，61，4272-4281)、硼代磷酸酯(例如，j.s.summers，b.r.shaw，curr.med.chem.2001，8，1147-1155)、(硫代)氨基磷酸酯(例如s.gryaznov，t.skorski，c.cucco，m.nieborowska-skorska，c.y.chiu，d.lloyd，j.chen，m.koziolkiewicz，b.calabretta，nucleicacidsres.1996，24，1508-1514)和甲基磷酸酯(例如p.s.sarin，s.agrawal，m.p.civeira，j.goodchild，t.ikeuchi，p.c.zamecnik，proc.nat.acad.sci.usa1988，20，7448-7451)。在这些磷酸酯类似物中，无疑最成功的修饰是硫代磷酸酯，其中一个非桥接磷酸酯氧原子被硫取代。由于其对于核酸酶的高度稳定性及其药代动力学优势，硫代磷酸酯寡核苷酸成为第一代寡核苷酸治疗药物，并且为新一代修饰方法诸如锁定核酸(lna)或2'-o-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸(2'-moe)铺平了道路。

本发明涉及(硫代)磷酸酯修饰，其中将三硫代磷酸酯键并入寡核苷酸序列中。在此类三硫代磷酸酯中，不仅一个非桥接磷酸氧原子被硫取代，而且相邻核糖糖环的3'和5'位置上的两个桥接氧原子被硫取代。

我们惊讶地发现，与未修饰的硫代磷酸酯类似物相比，根据本发明所述的单一修饰可获得在体外和体内均具有改善的活性的寡核苷酸。

附图说明

图1显示了以1μm的处理浓度温育24h和72h后，原代大鼠肝细胞中的apobmrna水平以及细胞内寡核苷酸浓度(分布)。

图2显示了c57bl/6jbomtac雌性小鼠接受1mg/kg单剂量的携带根据本发明所述的修饰的寡核苷酸处理后第7天被处死时肝和肾中的apobmrna水平，以及与接受盐水和未经修饰的对照处理后的结果的对比。

图3显示了c57bl/6jbomtac雌性小鼠接受1mg/kg单剂量的携带根据本发明所述的修饰的寡核苷酸处理后第0、3和7天测得的血清胆固醇水平，以及与接受盐水和未经修饰的对照处理后的结果的对比。

图4显示了c57bl/6jbomtac雌性小鼠接受1mg/kg单剂量的携带根据本发明所述的修饰的寡核苷酸处理后第7天被处死时肝、肾和心脏中的寡核苷酸组织含量，以及与接受未经修饰的对照处理后的结果的对比。

具体实施方式

在本说明书中，术语“烷基”在单独或组合下指具有1至8个碳原子的直链或支链烷基、特别地具有1至6个碳原子的直链或支链烷基和更特别地具有1至4个碳原子的直链或支链烷基。直链和支链c1-c8烷基的实例是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、异构戊基、异己基、异庚基和异辛基，特别地是甲基、乙基、丙基、丁基和戊基。烷基的具体实例是甲基、乙基和丙基。

术语“环烷基”在单独或组合下指具有3至8个碳原子的环烷基环、特别地具有3至6个碳原子的环烷基环。环烷基的实例是环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基，更特别地是环丙基和环丁基。“环烷基”的一个具体实例是环丙基。

术语“烷氧基”在单独或组合下指式烷基-o-的基团，其中术语“烷基”具有先前给出的含义，如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基和叔丁氧基。具体的“烷氧基”是甲氧基和乙氧基。甲氧基乙氧基是“烷氧基烷氧基”的一个具体实例。

术语“氧基”在单独或组合下指-o-基团。

术语“链烯基”在单独或组合下指包含烯键和多达8个、优选地多达6个、特别优选多达4个碳原子的直链或支链烃残基。链烯基的实例是乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、异丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基和异丁烯基。

术语“炔基”在单独或组合下指包含叁键和多达8个、特别是2个碳原子的直链或支链烃残基。

术语“卤族”或“卤素”在单独或组合下指氟、氯、溴或碘并且特别地指氟、氯或溴，更特别地指氟。与另一种基团组合下，术语“卤素”指经至少一个卤素取代、尤其经一个至五个卤素、特别地一个至四个卤素(即一个、两个、三个或四个卤素)取代的所述基团。

术语“卤代烷基”在单独或组合下指经至少一个卤素取代、尤其经一个至五个卤素、特别地一个至三个卤素取代的烷基。卤代烷基的实例包括单氟代、二氟或三氟甲基、乙基或丙基，例如3,3,3-三氟丙基、2-二氟乙基、2,2,2-三氟乙基、氟代甲基或三氟甲基。氟代甲基、二氟甲基和三氟甲基是具体的“卤代烷基”。

术语“卤代环烷基”在单独或组合下指经至少一个卤素取代、尤其经一个至五个卤素、特别地一个至三个卤素取代的如上定义的环烷基。“卤代环烷基”的具体实例是卤代环丙基，尤其是氟代环丙基、二氟环丙基和三氟环丙基。

术语“羟基”和“羟基”在单独或组合下指-oh基团。

术语“硫氢基”和“巯基”在单独或组合下指-sh基团。

术语“羰基”在单独或组合下指-c(o)-基团。

术语“羧基”或“羧”在单独或组合下指-cooh基团。

术语“氨基”在单独或组合下指伯氨基(-nh2)、仲氨基(-nh-)或叔氨基(-n-)。

术语“烷基氨基”在单独或组合下指经一个或两个如上文定义的烷基取代的如上文定义的氨基。

术语“磺酰基”在单独或组合下意指-so2基团。

术语“亚磺酰基”在单独或组合下指-so-基团。

术语“硫烷基”在单独或组合下指-s-基团。

术语“氰基”在单独或组合下指-cn基团。

术语“叠氮基”在单独或组合下指-n3基团。

术语“硝基”在单独或组合下指no2基团。

术语“甲酰基”在单独或组合下指-c(o)h基团。

术语“氨甲酰基”在单独或组合下指-c(o)nh2基团。

术语“脲基”在单独或组合下指-nh-c(o)-nh2基团。

术语“芳基”在单独或组合下指包含6至10个碳环原子的单价芳族碳环单环系统或双环系统，所述系统任选地经1至3个独立地选自以下的取代基取代：卤素、羟基、烷基、链烯基、炔基、烷氧基、烷氧烷基、链烯氧基、羧基、烷氧羰基、烷基羰基和甲酰基。芳基的实例包括苯基和萘基，尤其是苯基。

术语“杂芳基”在单独或组合下指5至12个环原子的单价芳族杂环单环系统或双环系统，所述系统包含1、2、3或4个选自n、o和s的杂原子，剩余环原子是碳，任选地经1至3个独立地选自以下的取代基取代：卤素、羟基、烷基、链烯基、炔基、烷氧基、烷氧烷基、链烯氧基、羧基、烷氧羰基、烷基羰基和甲酰基。杂芳基的实例包括吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、噁唑基、噻唑基、三唑基、噁二唑基、噻二唑基、四唑基、吡啶基、吡嗪基、吡唑基、哒嗪基、嘧啶基、三嗪基、吖庚因基、二吖庚因基、异噁唑基、苯并呋喃基、异噻唑基、苯并噻吩基、吲哚基、异吲哚基、异苯并呋喃基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并噻唑基、苯并异噻唑基、苯并噁二唑基、苯并噻二唑基、苯并三唑基、嘌呤基、喹啉基、异喹啉基、喹唑啉基、喹噁啉基、咔唑基或吖啶基。

术语“杂环基”在单独或组合下指4至12个、尤其4至9个环原子的单价饱和或部分不饱和单环系统或双环系统，所述系统包含1、2、3或4个选自n、o和s的环杂原子，剩余环原子是碳，任选地经1至3个独立地选自以下的取代基取代：卤素、羟基、烷基、链烯基、炔基、烷氧基、烷氧烷基、链烯氧基、羧基、烷氧羰基、烷基羰基和甲酰基。单环饱和杂环基的实例是吖丁啶基、吡咯烷基、四氢呋喃基、四氢-噻吩基、吡唑烷基、咪唑烷基、噁唑啉基、异噁唑烷基、噻唑烷基、哌啶基、四氢吡喃基、四氢噻喃基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、1,1-二氧代-硫代吗啉-4-基、吖庚环基、二吖庚环基、高哌嗪基或氧吖庚环基。双环饱和杂环烷基的实例是8-氮杂-双环并[3.2.1]辛基、奎宁环基、8-氧杂-3-氮杂-双环并[3.2.1]辛基、9-氮杂-双环并[3.3.1]壬基、3-氧杂-9-氮杂-双环并[3.3.1]壬基或3-噻-9-氮杂-双环并[3.3.1]壬基。部分不饱和杂环烷基的实例是二氢呋喃基、咪唑啉基、二氢噁唑基、四氢吡啶基或二氢吡喃基。

术语“药学上可接受的盐”是指那些保留游离碱或游离酸的生物学有效性和特性并且在生物学上或其他方面可取的盐。这些盐用无机酸诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、碳酸、磷酸(特别是盐酸)和有机酸诸如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲基磺酸、乙基磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸、n-乙酰基半胱氨酸形成。此外，这些盐可通过将无机碱或有机碱加入游离酸中来制备。衍生自无机碱的盐包括但不限于钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐。衍生自有机碱的盐包括但不限于伯胺、仲胺和叔胺、取代胺(包括天然存在的取代胺)、环胺和碱性离子交换树脂(诸如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、赖氨酸、精氨酸、n-乙基哌啶、哌啶、聚胺树脂)的盐。本发明的寡核苷酸也可以呈两性离子的形式存在。特别优选的本发明的药学上可接受的盐是钠盐、锂盐、钾盐和三烷基铵盐。

术语“保护基”在单独或组合下表示选择性封闭多官能化合物中的反应性位点的基团，从而可以在另一个未保护的反应性位点选择性地实施化学反应。可以去除保护基。示例性保护基是氨基保护基、羧基保护基或羟基保护基。

“磷酸酯保护基”是磷酸酯基团的保护基。磷酸酯保护基的实例是2-氰基乙基和甲基。磷酸酯保护基的一个具体实例是2-氰基乙基。

“羟基保护基”是羟基的保护基并且还用来保护硫醇基。羟基保护基的实例是乙酰基(ac)、苯甲酰基(bz)、苄基(bn)、β-甲氧基乙氧甲基醚(mem)、二甲氧基三苯甲基(或双-(4-甲氧苯基)苯基甲基)(dmt)、三甲氧基三苯甲基(或三-(4-甲氧苯基)苯基甲基)(tmt)、甲氧甲基醚(mom)、甲氧三苯甲基[(4-甲氧苯基)二苯基甲基(mmt)、对甲氧苄基醚(pmb)、甲基硫代甲基醚、新戊酰(piv)、四氢吡喃基(thp)、四氢呋喃(thf)、三苯甲基或三苯甲基(tr)、甲硅烷基醚(例如三甲基甲硅烷基咪唑(tms)、叔丁基二甲基甲硅烷基(tbdms)、三异丁基甲硅烷氧基甲基(tom)和三异丙基甲硅烷基(tips)醚)、甲醚和乙氧乙基醚(ee)。羟基保护基的具体实例是dmt和tmt，尤其是dmt。

“硫氢保护基”是硫氢基团的保护基。硫氢保护基的实例是“羟基保护基”的那些基团。

如果本发明的起始材料或化合物之一含有一个或多个在一个或多个反应步骤的反应条件下不稳定或有反应性的官能团，则应用本领域熟知的方法，可以在关键步骤之前引入适宜的保护基(如在例如t.w.greene和p.g.m.wuts，第3版，1999，wiley，newyork的“有机化学中的保护基(protectivegroupsinorganicchemistry)”中所述)。可以使用文献中描述的标准方法，在合成的晚期移除这类保护基。保护基的实例是叔丁氧羰基(boc)、9-芴基甲基氨基甲酸酯(fmoc)、2-三甲基甲硅烷基乙基氨基甲酸酯(teoc)、苄酯基(cbz)和对甲氧基苄氧羰基(moz)。

本文所述的化合物可以含有几个非对称中心并且可以按光学纯的对映异构体、对映异构体混合物诸如外消旋体、非对映异构体混合物、非对映异构外消旋体或非对映异构外消旋体混合物等形式存在。

寡核苷酸

如本文所用，术语“寡核苷酸”定义为如技术人员通常理解的包含两个或以上共价连接的核苷的分子。这样的共价结合的核苷也可以称为核酸分子或寡聚物。寡核苷酸通常在实验室中通过固相化学合成然后纯化的方式制备。当提及寡核苷酸的序列时，提及的是共价连接的核苷酸或核苷的核碱基部分或其修饰的序列或顺序。本发明的寡核苷酸是人造的，并且是化学合成的，并且一般是纯化的或分离的。本发明的寡核苷酸可以包含一个或多个修饰的核苷或核苷酸。

反义寡核苷酸

如本文所用，术语“反义寡核苷酸”定义为能够通过与靶标核酸特别是与靶标核酸上的连续序列杂交来调节靶标基因的表达的寡核苷酸。反义寡核苷酸基本上不是双链的，因此不是sirna或shrna。优选地，本发明的反义寡核苷酸是单链的。应当理解，本发明的单链寡核苷酸可以形成发夹或分子间双链体结构(二分子的相同寡核苷酸之间的双链体)，只要内部或之间自我互补性的程度跨寡核苷酸全长小于50％即可。

连续核苷酸序列

术语“连续核苷酸序列”指与靶核酸互补的寡核苷酸区域。本文中该术语与术语“连续核碱基序列”和术语“寡核苷酸基序序列”互换使用。在一些实施例中，寡核苷酸的全部核苷酸构成连续核苷酸序列。在一些实施例中，寡核苷酸包含连续核苷酸序列诸如f-g-f'缺口聚物区域，并且可以任选地包含其他核苷酸，例如可以用来将官能团接合至连续核苷酸序列的核苷酸接头区。核苷酸接头区可以互补于或可以不互补于靶核酸。

核苷酸

核苷酸是寡核苷酸和多核苷酸的组成部分，并且出于本发明的目的，包括天然存在的和非天然存在的核苷酸。实际上，核苷酸诸如dna核苷酸和rna核苷酸包括核糖部分、核碱基部分和一个或多个磷酸基团(在核苷中不存在)。核苷和核苷酸也可以可互换地称为“单元”或“单体”。

修饰的核苷

如本文所用，术语“修饰的核苷”或“核苷修饰”是指与同等的dna或rna核苷相比，通过引入糖部分或(核)碱基部分的一种或多种修饰而被修饰的核苷。在一个优选实施例中，修饰的核苷包含修饰的糖部分。术语修饰的核苷在本文中还可与术语“核苷类似物”或修饰的“单元”或修饰的“单体”互换使用。具有未修饰的dna糖部分的核苷或rna糖部分的核苷在本文中称为dna或rna核苷。如果允许watsoncrick碱基配对，则dna核苷碱基区域或rna核苷碱基区域中修饰的核苷通常仍称为dna或rna。

修饰的核苷间键

术语“修饰的核苷间键”如技术人员通常理解定义为除了将二个核苷共价连接在一起的磷酸二酯(po)键之外的键。因此，本发明的寡核苷酸可包含修饰的核苷间键。在一些实施例中，与磷酸二酯键合相比，修饰的核苷间键增加了寡核苷酸的核酸酶抗性。对于天然存在的寡核苷酸，核苷间键包括在毗邻核苷之间产生磷酸二酯键的磷酸酯基团。修饰的核苷间键特别可用于稳定寡核苷酸供体内使用，并且可以在本发明寡核苷酸中的dna核苷或rna核苷区域(例如在缺口聚物寡核苷酸的缺口区内部)以及在修饰的核苷区域(例如，区域f和区域f')起到保护免受核酸酶剪切的作用。

在一个实施例中，寡核苷酸包含一个或多个由天然磷酸二酯修饰的核苷间键，例如一个或多个修饰的核苷间键，其例如对核酸酶的攻击更具抗性。核酸酶抗性可以通过在血清中温育寡核苷酸或通过使用核酸酶抗性测定(例如蛇毒磷酸二酯酶(svpd))来确定，都是本领域中众所周知的。能够增强寡核苷酸的核酸酶抗性的核苷间键称为抗核酸酶核苷间键。在一些实施例中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列中至少50％的核苷间键被修饰，诸如至少60％、诸如至少70％、诸如至少80％、诸如至少90％的寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的核苷间键是抗核酸酶核苷间键。在一些实施例中，寡核苷酸的所有核苷间键或其连续核苷酸序列是抗核酸酶核苷间键。应当认识到，在一些实施例中，将本发明的寡核苷酸与非核苷酸官能团诸如缀合物连接的核苷可以是磷酸二酯。

用于本发明寡核苷酸中的优选的修饰的核苷间键是硫代磷酸酯。

硫代磷酸酯核苷间键由于核酸酶抗性、有益的药代动力学和易于制造而特别有益。在一些实施例中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列中至少50％的核苷间键是硫代磷酸酯，诸如至少60％、诸如至少70％、诸如至少80％、诸如至少90％的寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的核苷间键是硫代磷酸酯。在一些实施例中，除三硫代磷酸酯核苷间键之外，寡核苷酸的所有核苷间键或其连续核苷酸序列是硫代磷酸酯。在一些实施例中，除三硫代磷酸酯键之外，本发明的寡核苷酸还包含硫代磷酸酯核苷间键和至少一个磷酸二酯键诸如2、3或4个磷酸二酯键。在缺口聚物寡核苷酸中，当存在时，磷酸二酯键合适地不位于缺口区g中的连续dna核苷之间。

抗核酸酶键，诸如硫代磷酸酯键，在与靶标核酸形成双链体时能够募集核酸酶的寡核苷酸区域中特别有用，诸如缺口聚物的区域g。然而，硫代磷酸酯键也可用于非核酸酶募集区域和/或亲和力增强区域，如缺口聚物的区域f和f'。在一些实施例中，缺口聚物寡核苷酸可在区域f或f'或同时在区域f和f'中包含一个或多个磷酸二酯键合，其中区域g中的核苷间键可以完全是硫代磷酸酯。

有利地，在寡核苷酸的连续核苷酸序列中的全部核苷间键或寡核苷酸的全部核苷间键均是硫代磷酸酯键。

应当认识到，如ep2742135中所公开的，反义寡核苷酸可包含其他核苷间键(除磷酸二酯和硫代磷酸酯以外)，例如烷基膦酸酯/甲基膦酸酯核苷间，其根据ep2742135可以例如以其他方式被dna硫代磷酸酯的间隔区域中所耐受。

立构无规硫代磷酸酯键

硫代磷酸酯键是其中非桥接氧之一已经被硫取代的核苷间磷酸酯键。硫对非桥接氧之一的取代引入了手性中心并且从而在单一硫代磷酸酯寡核苷酸内部，每个硫代磷酸酯核苷间键将处于s(sp)或r(rp)立体异构形式。此类核苷间键称作“手性核苷间键”。相比之下，磷酸二酯核苷间键是非手性的，因为它们具有两个非末端氧原子。

依据首次发表于以下文献中的标准cahn-ingold-prelog规则(cip优先规则)确定立构中心手性的命名：cahn,r.s.；ingold,c.k.；prelog,v.(1966)“分子手性规范(specificationofmolecularchirality)”，angewandtechemieinternationaledition5(4):385–415，doi:10.1002/anie.196603851。

在标准寡核苷酸合成过程中，偶联和后续硫化的立体选择性不受控。出于这个原因，每个硫代磷酸酯核苷间键的立体化学随机地是sp或rp，因而通过传统寡核苷酸合成法产生的硫代磷酸酯寡核苷酸实际上可以按多达2^x种不同的硫代磷酸酯非对映异构体存在，其中x是硫代磷酸酯核苷间键的数目。此类寡核苷酸在本文中称作立构无规硫代磷酸酯寡核苷酸，并且不含有任何定义了立构的核苷间键。因此，立构无规硫代磷酸酯寡核苷酸是源自非立体化学确定合成的各非对映异构体的混合物。在这一语境下，混合物定义为多达2^x种不同的硫代磷酸酯非对映异构体。

立体定向核苷间键

立体定向核苷间键是在其两种非对映异构体形式rp或sp中的一者中具有非对映异构体过量的手性核苷间键。

应当认识到，本领域中使用的立体选择性寡核苷酸合成方法通常在每个手性核苷间键处提供至少约90％或至少约95％的非对映选择性，因此最高约10％诸如约5％的寡核苷酸分子可能具有非对映异构体的替代形式。

在一些实施例中，每个立体定向手性核苷间键的非对映异构体比率为至少约90:10。在一些实施例中，每个手性核苷间键的非对映异构体比率为至少约95:5。

立体定向硫代磷酸酯键是立体定向核苷间键的一个具体实例。

立体定向硫代磷酸酯键

立体定向硫代磷酸酯键是在其两种非对映异构体形式rp或sp中的一者中具有非对映异构体过量的硫代磷酸酯键。

硫代磷酸酯核苷间键的rp和sp构型如下所示

其中3'r基团代表相邻的核苷(5'核苷)的3'位置，而5'r基团代表相邻的核苷(3'核苷)的5'位置。

在本文中，rp核苷间键也可以表示为srp，并且sp核苷间键可以表示为ssp。

在一个具体实施例中，每个立体定向硫代磷酸酯键的非对映体比率为至少约90:10或至少95:5。

在一些实施例中，每个立体定向硫代磷酸酯键的非对映体比率为至少约97:3。在一些实施例中，每个立体定向硫代磷酸酯键的非对映体比率为至少约98:2。在一些实施例中，每个立体定向硫代磷酸酯键的非对映体比率为至少约99:1。

在一些实施例中，立体定向核苷间键在至少97％诸如至少98％诸如至少99％或(基本上)全部的存在于寡核苷酸分子群内的寡核苷酸分子中具有相同的非对映异构形式(rp或sp)。

可以在仅具有非手性骨架(即磷酸二酯)的模型系统中测量非对映体纯度。可通过例如将具有立体定向核苷间键的单体偶联至以下模型系统“5't-po-t-po-t-po3'”来测量每个单体的非对映体纯度。该测量的结果随后将给出：可使用hplc分离的5'dmtr-t-srp-t-po-t-po-t-po3'或5'dmtr-t-ssp-t-po-t-po-t-po3'。通过整合来自两种可能非对映异构体的uv信号并且得到这些非对映异构体的比率(例如98:2、99:1或>99:1)，确定非对映异构体纯度。

应当理解，特定的单一非对映异构体(单一立体定向寡核苷酸分子)的非对映异构体纯度将随每个核苷间位置处限定的立体中心的偶联选择性和待引入的立体定向核苷间键的数目而变化。以举例方式而言，如果每个位置处的偶联选择性是97％，则具有15个立体定向核苷间键的立体定向寡核苷酸的所得纯度将是0.97¹⁵，即如与37％的其他非对映异构体相比，所需的非对映异构体为63％。可以在合成后，通过纯化(例如通过hplc，诸如离子交换色谱法或反相色谱法)改进限定的非对映异构体的纯度。

在一些实施例中，立体定向寡核苷酸是指寡核苷酸群的至少约40％诸如至少约50％属于所需非对映异构体的寡核苷酸群。

换言之，在一些实施例中，立体定向寡核苷酸是指寡核苷酸群的至少约40％诸如至少约50％由所需(特定)的立体定向核苷间键基序(也称作立体定向基序)组成的寡核苷酸群。

对于包含立构无规核苷间立体中心和立体定向核苷间立体中心的立体定向寡核苷酸，参考保留所需的立体定向核苷间键基序的寡核苷酸群的％，确定立体定向寡核苷酸的纯度，计算时不考虑立构无规键。

核碱基

术语核碱基包括存在于核苷和核苷酸中的嘌呤(例如腺嘌呤和鸟嘌呤)和嘧啶(例如尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶)部分，其在核酸杂交中形成氢键。在本发明的背景中，术语核碱基也涵盖修饰的核碱基，其可以不同于天然存在的核碱基，但是在核酸杂交期间起作用。在此背景中，“核碱基”是指天然存在的核碱基，例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸苷、尿嘧啶、黄嘌呤和次黄嘌呤，以及非天然存在的变体。此类变体例如描述于hirao等人(2012)accountsofchemicalresearch第45卷第2055页和bergstrom(2009)currentprotocolsinnucleicacidchemistrysuppl.371.4.1中。

在一些实施例中，核碱基部分被修饰，其方式是将嘌呤或嘧啶改变为修饰的嘌呤或嘧啶，诸如取代的嘌呤或取代的嘧啶，诸如选自异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-巯基-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-噻唑-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、2'-硫代-胸腺嘧啶、肌苷、二氨基嘌呤、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤的核碱基。

核碱基部分可以由每个相应核碱基的字母代码来表示，例如a、t、g、c或u，其中每个字母可以任选地包括具有同等功能的修饰的核碱基。例如，在示例性的寡核苷酸中，核碱基部分选自a、t、g、c和5-甲基胞嘧啶。任选地，对于lna缺口聚物，可以使用5-甲基胞嘧啶lna核苷。

修饰的寡核苷酸

术语修饰的寡核苷酸描述了一种寡核苷酸，其包含一个或多个糖修饰的核苷和/或修饰的核苷间键和/或缀合物部分的存在。术语嵌合“寡核苷酸”是已经在文献中用来描述具有修饰的核苷的寡核苷酸的术语。

立体定向寡核苷酸

立体定向寡核苷酸是一种寡核苷酸，其中至少一个核苷间键是立体定向核苷间键。

立体定向硫代磷酸酯寡核苷酸是一种寡核苷酸，其中至少一个核苷间键是立体定向硫代磷酸酯核苷间键。

互补性

术语“互补性”描述了核苷/核苷酸的watson-crick碱基配对的能力。watson-crick碱基对是鸟嘌呤(g)-胞嘧啶(c)和腺嘌呤(a)-胸腺嘧啶(t)/尿嘧啶(u)。应当理解，寡核苷酸可包含具有修饰的核碱基的核苷，例如，经常使用5-甲基胞嘧啶代替胞嘧啶，因此，术语互补性涵盖未修饰的和修饰的核碱基之间的watsoncrick碱基配对(参见例如hirao等人(2012)accountsofchemicalresearch第45卷第2055页和bergstrom(2009)currentprotocolsinnucleicacidchemistrysuppl.371.4.1)。

如本文所用，术语“％互补的”是指核酸分子(例如寡核苷酸)中连续核苷酸序列内核苷酸的比例，其中在给定位置，所述核苷酸与单独的核酸分子(例如靶核酸)在给定位置处的连续核苷酸序列互补(即与之形成watsoncrick碱基对)。通过以下方式计算百分比：(与靶序列5'-3'和寡核苷酸序列从3'-5'对齐时)计数两个序列之间形成配对的对齐碱基的数目，除以寡核苷酸中核苷酸的总数并且乘以100。在此类比较中，未对齐(形成碱基对)的核碱基/核苷酸称作错配。优选地，计算连续核苷酸序列的互补性％时不允许插入和缺失。

术语“完全互补的”指100％互补性。

一致性

如本文所用，术语“一致性”是指核酸分子(例如寡核苷酸)中连续核苷酸序列以百分比计的核苷酸数目，其中在给定位置，所述核苷酸与单独的核酸分子(例如靶核酸)在给定位置处的连续核苷酸序列(即在其与互补性核苷形成watsoncrick碱基对的能力方面)相同。通过以下方式计算该百分比：计数两个序列之间相同的对齐碱基的数目，除以寡核苷酸中核苷酸的总数并且乘以100。一致性百分比＝(匹配×100)/对齐区域的长度。优选地，计算连续核苷酸序列的互补性％时不允许插入和缺失。

杂交

如本文所用，术语“杂交”应当理解为在相对链上的碱基对之间形成氢键从而形成双链体的两条核酸链(例如寡核苷酸和靶标核酸)。两条核酸链之间结合的亲和力是杂交的强度。通常用解链温度(tm)来描述，解链温度(tm)定义为一半寡核苷酸与靶标核酸形成双链体的温度。在生理条件下，tm不与亲和力严格成正比(mergny和lacroix，2003，oligonucleotides13:515–537)。标准状态gibbs自由能δg°是结合亲和力的更精确的表述并且与反应的解离常数(kd)乘以δg°＝-rtln(kd)相关，其中r是气体常数并且t是绝对温度。因此，寡核苷酸与靶核酸之间反应的非常低的δg°反映了寡核苷酸和靶核酸之间强力杂交。δg°是与其中水浓度为1m、ph为7并且温度为37℃的反应相关的能量。寡核苷酸与靶核酸杂交是自发反应，并且对于自发反应，δg°小于零。例如，可利用如hansen等人(1965,chem.comm.36–38)和holdgate等人(2005,drugdiscovtoday)中所述的等温滴定量热法(itc)法通过实验测量δg°。本领域的技术人员将知道商业设备可用于测量δg°。也可以通过使用如santalucia(1998,procnatlacadsciusa.95:1460–1465)所述的最近相邻模型，适当使用sugimoto等人(1995,biochemistry34:11211–11216)和mctigue等人(2004,biochemistry43:5388–5405)描述的热动力参数，以数值方式估计δg。为获得通过杂交调节其预期核酸靶的可能性，本发明的寡核苷酸与靶核酸以针对长度10-30个核苷酸的寡核苷酸的低于-10kcal的δg°估计值杂交。在一些实施例中，依据标准状态gibbs自由能δg°测量杂交的程度或强度。寡核苷酸可以与靶核酸以针对长度8-30个核苷酸的寡核苷酸的低于10kcal诸如低于-15kcal诸如低于-20kcal和诸如低于-25kcal的δg°估计值杂交。在一些实施例中，寡核苷酸与靶核酸以-10kcal至-60kcal诸如-12kcal至-40kcal诸如-15kcal至-30kcal或-16kcal至-27kcal诸如-18kcal至-25kcal的δg°估计值杂交。

糖修饰

与dna和rna中存在的核糖糖部分相比时，本发明的寡聚物可包含一个或多个具有修饰的糖部分(即糖部分修饰)的核苷。

已经产生众多具有核糖糖部分修饰的核苷，其主要目的在于改善寡核苷酸的某些特性，诸如亲和力和/或核酸酶抗性。

此类修饰包括以下修饰，其中例如通过用以下取代而修饰核糖环结构：己糖环(hna)或一般在核糖环上c2和c4碳之间具有双基桥的双环状环(lna)或一般在c2碳和c3碳之间缺少键的非连接核糖环(例如una)。其他糖修饰的核苷包括例如双环己糖核酸(wo2011/017521)或三环核酸(wo2013/154798)。经修饰的核苷还包括其中糖部分由非糖部分替换的核苷，例如在肽核酸(pna)或吗啉代核酸的情况下。

糖修饰还包括通过将核糖环上的取代基变成氢之外的基团或dna核苷和rna核苷中天然存在的2'-oh基团所做出的修饰。糖修饰可以例如在2'、3'、4'或5'位置引入取代基。

2'糖修饰的核苷。

a2'糖修饰的核苷是一种核苷，其在2'位置具有除h或-oh以外的取代基(2'取代的核苷)或包含能够在2'碳与核糖环中的第二个碳原子之间形成桥的2'连接双基，诸如lna(2'-4'双基桥连)核苷。

事实上，人们已花费很多精力开发2'取代的核苷，并且发现许多2'取代的核苷并入寡核苷酸后具有有益的特性。例如，2'修饰的糖可以提供增强的结合亲和力和/或增加的对寡核苷酸的核酸酶抗性。2'取代的修饰的核苷实例是2'-o-烷基-rna、2'-o-甲基-rna、2'-烷氧基-rna、2'-o-甲氧乙基-rna(moe)、2'-氨基-dna、2'-氟-rna和2'-f-ana核苷。其他实例可参见例如：freier和altmann，nucl.acidres.，1997，25，4429-4443；uhlmann，curr.opinionindrugdevelopment，2000，3(2)，293-213；以及deleavey和damha，chemistryandbiology2012，19，937。下面是一些2'取代的修饰的核苷的示意图。

关于本发明，2'取代不包括2'桥接的分子如lna。

锁定核酸核苷(lna核苷)

“lna核苷”是一种2'-修饰的核苷，其包含链接所述核苷的核糖环的c2'和c4'的双基(也称为“2'-4'桥”)，其限制或锁定核糖环的构象。这些核苷在文献中也称为桥连核酸或双环核酸(bna)。将lna并入互补rna或dna分子的寡核苷酸中时，核糖构象的锁定与杂交的增强亲和力(双链体稳定化)有关。这可以常规地通过测量寡核苷酸/互补双链体的解链温度确定。

非限制性的示例性lna核苷公开于wo99/014226、wo00/66604、wo98/039352、wo2004/046160、wo00/047599、wo2007/134181、wo2010/077578、wo2010/036698、wo2007/090071、wo2009/006478、wo2011/156202、wo2008/154401、wo2009/067647、wo2008/150729、morita等人(bioorganic&med.chem.lett.12,73-76)、seth等人(j.org.chem.2010,vol75(5)pp.1569-81)和mitsuoka等人(nucleicacidsresearch2009,37(4),1225-1238)。

2'-4'桥键包含2至4个桥接原子，并且特别地具有式-x-y-，其中x与c4'连接并且y与c2'连接，

其中

x为氧、硫、-cr^ar^b-、-c(r^a)＝c(r^b)-、-c(＝cr^ar^b)-、-c(r^a)＝n-、-si(r^a)2-、-so2-、-nr^a-；-o-nr^a-、-nr^a-o-、-c(＝j)-、se、-o-nr^a-、-nr^a-cr^ar^b-、-n(r^a)-o-或-o-cr^ar^b-；

y为氧、硫、-(cr^ar^b)n-、-cr^ar^b-o-cr^ar^b-、-c(r^a)＝c(r^b)-、-c(r^a)＝n-、-si(r^a)2-、-so2-、-nr^a-、-c(＝j)-、se、-o-nr^a-、-nr^a-cr^ar^b-、-n(r^a)-o-或-o-cr^ar^b-；

条件是-x-y-不为-o-o-、si(r^a)2-si(r^a)2-、-so2-so2-、-c(r^a)＝c(r^b)-c(r^a)＝c(r^b)、-c(r^a)＝n-c(r^a)＝n-、-c(r^a)＝n-c(r^a)＝c(r^b)、-c(r^a)＝c(r^b)-c(r^a)＝n-或-se-se-；

j为氧、硫、＝ch2或＝n(r^a)；

r^a和r^b独立地选自氢、卤素、羟基、氰基、硫氢、烷基、取代的烷基、链烯基、取代的链烯基、炔基、取代的炔基、烷氧基、取代的烷氧基、烷氧烷基、链烯氧基、羧基、烷氧羰基、烷基羰基、甲酰基、芳基、杂环基、氨基、烷基氨基、氨甲酰基、烷基氨羰基、氨烷基氨羰基、烷基氨烷基氨羰基、烷基羰氨基、脲基、烷酰氧基、磺酰基、烷基磺酰氧基、硝基、叠氮基、硫氢硫化烷基硫基、芳氧羰基、芳氧基、芳基羰基、杂芳基、杂芳氧羰基、杂芳氧基、杂芳基羰基、-oc(＝x^a)r^c、-oc(＝x^a)nr^cr^d和-nr^ec(＝x^a)nr^cr^d；

或两个偕r^a和r^b一起形成任选取代的亚甲基；

或两个偕r^a和r^b与它们连接至的碳原子一起形成环烷基或卤代环烷基，仅含-x-y-的一个碳原子；

其中取代的烷基、取代的链烯基、取代的炔基、取代的烷氧基和取代的亚甲基是经1至3个取代基取代的烷基、链烯基、炔基和亚甲基，所述取代基独立地选自卤素、羟基、烷基、链烯基、炔基、烷氧基、烷氧烷基、链烯氧基、羧基、烷氧羰基、烷基羰基、甲酰基、杂环基、芳基和杂芳基；

x^a为氧、硫或-nr^c；

r^c、r^d和r^e独立地选自氢和烷基；并且

n为1、2或3。

在本发明的又一个具体实施例中，x为氧、硫、-nr^a-、-cr^ar^b-或-c(＝cr^ar^b)-，特别地为氧、硫、-nh-、-ch2-或-c(＝ch2)-，更特别地为氧。

在本发明的另一个具体实施例中，y为-cr^ar^b-、-cr^ar^b-cr^ar^b-或-cr^ar^b-cr^ar^b-cr^ar^b-，特别地为-ch2-chch3-、-chch3-ch2-、-ch2-ch2-或-ch2-ch2-ch2-。

在本发明的一个具体实施例中，-x-y-为-o-(cr^ar^b)n-、-s-cr^ar^b-、-n(r^a)cr^ar^b-、-cr^ar^b-cr^ar^b-、-o-cr^ar^b-o-cr^ar^b-、-cr^ar^b-o-cr^ar^b-、-c(＝cr^ar^b)-cr^ar^b-、-n(r^a)cr^ar^b-、-o-n(r^a)-cr^ar^b-或-n(r^a)-o-cr^ar^b-。

在本发明的一个具体实施例中，r^a和r^b独立地选自由以下项组成的组：氢、卤素、羟基、烷基和烷氧烷基，特别是氢、卤素、烷基和烷氧烷基。

在本发明的另一个具体实施例中，r^a和r^b独立地选自由以下项组成的组：氢、氟、羟基、甲基和-ch2-o-ch3，特别是氢、氟、甲基和-ch2-o-ch3.

有利地，-x-y-的r^a和r^b中的一者如上文所定义并且另一者同时均为氢。

在本发明的又一个具体实施例中，r^a为氢或烷基，特别是氢或甲基。

在本发明的另一个具体实施例中，r^b为氢或烷基，特别是氢或甲基。

在本发明的一个具体实施例中，r^a和r^b中的一者或两者为氢。

在本发明的一个具体实施例中，r^a和r^b中仅有一者为氢。

在本发明的一个具体实施例中，r^a和r^b中的一者为甲基并且另一者为氢。

在本发明的一个具体实施例中，r^a和r^b同时均为甲基。

在本发明的一个具体实施例中，-x-y-为-o-ch2-、-s-ch2-、-s-ch(ch3)-、-nh-ch2-、-o-ch2ch2-、-o-ch(ch2-o-ch3)-、-o-ch(ch2ch3)-、-o-ch(ch3)-、-o-ch2-o-ch2-、-o-ch2-o-ch2-、-ch2-o-ch2-、-c(＝ch2)ch2-、-c(＝ch2)ch(ch3)-、-n(och3)ch2-或-n(ch3)ch2-；

在本发明的一个具体实施例中，-x-y-为-o-cr^ar^b-，其中r^a和r^b独立地选自由以下项组成的组：氢、烷基和烷氧烷基，特别是氢、甲基和-ch2-o-ch3。

在一个具体实施例中，-x-y-为-o-ch2-或-o-ch(ch3)-，特别地为-o-ch2-。

2'-4'桥键可以位于核糖环平面的下方(β-d-构型)，或位于该环平面的上方(α-l-构型)，分别如式(a)和式(b)中所示。

根据本发明所述的lna核苷特别地具有式(b1)或(b2)

其中

w为氧、硫、-n(r^a)-或-cr^ar^b-，特别地为氧；

b为核碱基或修饰的核碱基；

z为至相邻核苷的核苷间键或5'末端基团；

z*为至相邻核苷的核苷间键或3'末端基团；

r¹、r²、r³、r⁵和r^5*独立地选自氢、卤素、烷基、卤代烷基、链烯基、炔基、羟基、烷氧基、烷氧烷基、叠氮基、链烯氧基、羧基、烷氧羰基、烷基羰基、甲酰基和芳基；并且

x、y、r^a和r^b如上文所定义。

在一个具体实施例中，在-x-y-的定义中，r^a为氢或烷基，特别是氢或甲基。在另一个具体实施例中，在-x-y-的定义中，r^b为氢或烷基，特别是氢或甲基。在又一个具体实施例中，在-x-y-的定义中，r^a和r^b中的一者或两者为氢。在一个具体实施例中，在-x-y-的定义中，r^a和r^b中仅有一者为氢。在一个具体实施例中，在-x-y-的定义中，r^a和r^b中的一者为甲基并且另一者为氢。在一个具体实施例中，在-x-y-的定义中，r^a和r^b同时均为甲基。

在又一个具体实施例中，在x的定义中，r^a为氢或烷基，特别是氢或甲基。在另一个具体实施例中，在x的定义中，r^b为氢或烷基，特别是氢或甲基。在一个具体实施例中，在x的定义中，r^a和r^b中的一者或两者为氢。在一个具体实施例中，在x的定义中，r^a和r^b中仅有一者为氢。在一个具体实施例中，在x的定义中，r^a和r^b中的一者为甲基并且另一者为氢。在一个具体实施例中，在x的定义中，r^a和r^b同时均为甲基。

在又一个具体实施例中，在y的定义中，r^a为氢或烷基，特别是氢或甲基。在另一个具体实施例中，在y的定义中，r^b为氢或烷基，特别是氢或甲基。在一个具体实施例中，在y的定义中，r^a和r^b中的一者或两者为氢。在一个具体实施例中，在y的定义中，r^a和r^b中仅有一者为氢。在一个具体实施例中，在y的定义中，r^a和r^b中的一者为甲基并且另一者为氢。在一个具体实施例中，在y的定义中，r^a和r^b同时均为甲基。

在本发明的一个具体实施例中，r¹、r²、r³、r⁵和r^5*独立地选自氢和烷基，特别是氢和甲基。

在本发明的又一个特别有利的实施例中，r¹、r²、r³、r⁵和r^5*同时均为氢。

在本发明的另一个具体实施例中，r¹、r²、r³同时均为氢，r⁵和r^5*中的一者为氢并且另一者如上文定义，特别地为烷基，更特别地为甲基。

在本发明的一个具体实施例中，r⁵和r^5*独立地选自氢、卤素、烷基、烷氧烷基和叠氮基，特别地选自氢、氟、甲基、甲氧基乙基和叠氮基。特别地，在本发明的有利的实施例中，r⁵和r^5*中的一者为氢并且另一者为烷基，特别地为甲基、卤素，特别地为氟、烷氧烷基，特别地为甲氧基乙基或叠氮基；或者r⁵和r^5*同时均为氢或卤素，特别地同时均为氢或氟。在此类具体实施例中，w可有利地为氧，并且-x-y-有利地为-o-ch2-。

在本发明的一个具体实施例中，-x-y-为-o-ch2-，w为氧，并且r¹、r²、r³、r⁵和r^5*同时均为氢。此类lna核苷公开于wo99/014226、wo00/66604、wo98/039352和wo2004/046160中，这些专利均据此以引用方式并入本文，并且包括本领域中通常已知的β-d-氧基lna核苷和α-l-氧基lna核苷。

在本发明的另一个具体实施例中，-x-y-为-s-ch2-，w为氧，并且r¹、r²、r³、r⁵和r^5*同时均为氢。此类硫代lna核苷公开于wo99/014226和wo2004/046160中，这些专利据此以引用方式并入本文。

在本发明的另一个具体实施例中，-x-y-为-nh-ch2-，w为氧，并且r¹、r²、r³、r⁵和r^5*同时均为氢。此类氨基lna核苷公开于wo99/014226和wo2004/046160中，这些专利据此以引用方式并入本文。

在本发明的另一个具体实施例中，-x-y-为-o-ch2ch2-或-och2ch2ch2-，w为氧，并且r¹、r²、r³、r⁵和r^5*同时均为氢。此类lna核苷公开于wo00/047599和morita等人(bioorganic&med.chem.lett.12,73-76)，所述文献据此以引用方式并入本文，并且包括本领域通常已知的2'-o-4'c-亚乙基桥接的核酸(ena)。

在本发明的另一个具体实施例中，-x-y-为-o-ch2-，w为氧，r¹、r²、r³同时均为氢，r⁵和r^5*中的一者为氢并且另一者不为氢，诸如为烷基(例如甲基)。此类5'取代的lna核苷公开于wo2007/134181中，该专利据此以引用方式并入本文。

在本发明的另一个具体实施例中，-x-y-为-o-cr^ar^b-，其中r^a和r^b中的一者或两者并非氢，特别地为烷基诸如甲基，w为氧，r¹、r²、r³同时均为氢，r⁵和r^5*中的一者为氢并且另一者不为氢，特别地为烷基(例如甲基)。此类双重修饰的lna核苷公开于wo2010/077578中，该专利据此以引用方式并入本文。

在本发明的另一个具体实施例中，-x-y-为-o-chr^a-，w为氧，并且r¹、r²、r³、r⁵和r^5*同时均为氢。此类6'取代的lna核苷公开于wo2010/036698和wo2007/090071中，这些专利据此以引用方式并入本文。在此类6'取代的lna核苷中，r^a特别地为c1-c6烷基诸如甲基。

在本发明的另一个具体实施例中，-x-y-为-o-ch(ch2-o-ch3)-(“2'o-甲氧基乙基双环核酸”，seth等人，j.org.chem.2010，第75卷第5期，第1569-81页)。

在本发明的另一个具体实施例中，-x-y-为-o-ch(ch2ch3)-；

在本发明的另一个具体实施例中，-x-y-为-o-ch(ch2-o-ch3)-，w为氧，并且r¹、r²、r³、r⁵和r^5*同时均为氢。在本领域中，此类lna核苷也称作环状moe(cmoe)并且公开于wo2007/090071中。

在本发明的另一个具体实施例中，-x-y-为-o-ch(ch3)-(“2'o-乙基双环核酸”，seth等人，j.org.chem.2010，第75卷第5期，第1569-81页)。

在本发明的另一个具体实施例中，-x-y-为-o-ch2-o-ch2-(seth等人，j.org.chem2010，同上)。

在本发明的另一个具体实施例中，-x-y-为-o-ch(ch3)-，w为氧，并且r¹、r²、r³、r⁵和r^5*同时均为氢。此类6'-甲基lna核苷在本领域也称作cet核苷并且可以为(s)-cet或(r)-cet非对映异构体，如wo2007/090071(β-d)和wo2010/036698(α-l)中所公开，这两件专利均据此以引用方式并入本文。

在本发明的另一个具体实施例中，-x-y-为-o-cr^ar^b-，其中r^a和r^b均非氢，w为氧，并且r¹、r²、r³、r⁵和r^5*同时均为氢。在一个具体实施例中，r^a和r^b同时均为烷基，特别地同时均为甲基。此类6'-双取代的lna核苷公开于wo2009/006478中，其据此以引用方式并入本文。

在本发明的另一个具体实施例中，-x-y-为-s-chr^a-，w为氧，并且r¹、r²、r³、r⁵和r^5*同时均为氢。此类6'-取代的硫代lna核苷公开于wo2011/156202中，其据此以引用方式并入本文。在此类6'-取代的硫代lna的一个具体实施例中，r^a为烷基，特别是甲基。

在本发明的一个具体实施例中，-x-y-为-c(＝ch2)c(r^ar^b)-、-c(＝chf)c(r^ar^b)-或-c(＝cf2)c(r^ar^b)-，w为氧，并且r¹、r²、r³、r⁵和r^5*同时均为氢。r^a和r^b有利地独立选自氢、卤素、烷基和烷氧烷基，特别是氢、甲基、氟和甲氧基甲基。r^a和r^b特别地同时均为氢或甲基，或者r^a和r^b中的一者为氢，并且另一者为甲基。此类乙烯基碳lna核苷公开于wo2008/154401和wo2009/067647中，这些专利据此以引用方式并入本文。

在本发明的一个具体实施例中，-x-y-为-n(or^a)-ch2-，w为氧，并且r¹、r²、r³、r⁵和r^5*同时均为氢。在一个具体实施例中，r^a为烷基诸如甲基。此类lna核苷也称作n取代的lna并且公开于wo2008/150729中，该专利据此以引用方式并入本文。

在本发明的一个具体实施例中，-x-y-为-o-n(r^a)-、-n(r^a)-o-、-nr^a-cr^ar^b-cr^ar^b-或-nr^a-cr^ar^b-，w为氧，并且r¹、r²、r³、r⁵和r^5*同时均为氢。r^a和r^b有利地独立选自氢、卤素、烷基和烷氧烷基，特别是氢、甲基、氟和甲氧基甲基。在一个具体实施例中，r^a为烷基诸如甲基，r^b为氢或甲基，特别地为氢(seth等人，j.org.chem2010，同上)。

在本发明的一个具体实施例中，-x-y-为-o-n(ch3)-(seth等人，j.org.chem2010，同上)。

在本发明的一个具体实施例中，r⁵和r^5*同时均为氢。在本发明的另一个具体实施例中，r⁵和r^5*中的一者为氢，并且另一者为烷基诸如甲基。在此类实施例中，r¹、r²和r³可特别地为氢，并且-x-y-可特别地为-o-ch2-或-o-chc(r^a)3-诸如-o-ch(ch3)-。

在本发明的一个具体实施例中，-x-y-为-cr^ar^b-o-cr^ar^b-诸如-ch2-o-ch2-，w为氧，并且r¹、r²、r³、r⁵和r^5*同时均为氢。在此类具体实施例中，r^a可特别地为烷基诸如甲基，r^b为氢或甲基，特别地为氢。此类lna核苷也称作构象限制的核苷酸(crn)并且公开于wo2013/036868中，该专利据此以引用方式并入本文。

在本发明的一个具体实施例中，-x-y-为-o-cr^ar^b-o-cr^ar^b-诸如-o-ch2-o-ch2-，w为氧，并且r¹、r²、r³、r⁵和r^5*同时均为氢。r^a和r^b有利地独立选自氢、卤素、烷基和烷氧烷基，特别是氢、甲基、氟和甲氧基甲基。在此类具体实施例中，r^a可特别地为烷基诸如甲基，r^b为氢或甲基，特别地为氢。此类lna核苷也称作coc核苷酸并且公开于mitsuok等人，nucleicacidsresearch2009，37(4)，1225-1238中，该文献据此以引用方式并入本文。

应当认识到，除非另外说明，否则lna核苷可处于β-d或α-l立体异构形式。

本发明的lna核苷的具体实例展示于方案1中(其中b如上文所定义)。

方案1

特定的lna核苷为β-d-氧-lna、6'-甲基-β-d-氧lna诸如(s)-6'-甲基-β-d-氧-lna((s)-cet)和ena。

核糖核酸酶h活性和募集

反义寡核苷酸的核糖核酸酶h活性是指其与互补的rna分子形成双链体时募集核糖核酸酶h的能力。wo01/23613提供了用于确定核糖核酸酶h活性的体外方法，该方法可用于确定募集核糖核酸酶h的能力。如果发生以下情况，一般认定寡核苷酸能够募集核糖核酸酶h：当提供互补的靶核酸序列时，其具有如以pmol/l/min计量的初始速率，该初始速率是使用下述寡核苷酸并且使用wo01/23613的实施例91-95(据此以引用方式并入本文)提供的方法所确定的初始速率的至少5％诸如至少10％或超过20％，其中寡核苷酸与受试修饰的寡核苷酸具有相同的碱基序列，但是仅含有dna单体，同时寡核苷酸的全部单体之间均为硫代磷酸酯键。为确定核糖核酸酶h活性，重组人核糖核酸酶h1可得自lubiosciencegmbh(lucerne,switzerland)。

缺口聚物

本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列可以是缺口聚物。反义缺口聚物常用于借助核糖核酸酶h介导的降解来抑制靶核酸。缺口聚物寡核苷酸包含至少三个独特的结构区5'-侧翼、缺口和3’-侧翼，在‘5->3’方向上为f-g-f'。“缺口”区(g)包含一段使寡核苷酸能够募集核糖核酸酶h的连续dna核苷酸。缺口区旁侧分布有包含一个或多个糖修饰的核苷、有利地糖修饰的高亲和力核苷的5'侧翼区(f)和包含一个或多个糖修饰的核苷、有利地糖修饰的高亲和力核苷的3'侧翼区(f')。区域f和区域f'中的一个或多个糖修饰的核苷增强寡核苷酸对靶核酸的亲和力(即为增强亲和力的糖修饰的核苷)。在一些实施例中，区域f和区域f'中的一个或多个糖修饰的核苷为2'糖修饰的核苷诸如高亲和力2'糖修饰，诸如独立地选自lna和2'-moe。

在缺口聚物设计中，缺口区的5'和3'最末端核苷为dna核苷，并且分别毗邻5'(f)区域或3'(f')区域的糖修饰的核苷存在。这些侧翼区可通过最远离缺口区的末端(即在5'侧翼区的5'末端和在3'侧翼区的3'末端)处具有至少一个糖修饰的核苷来进一步定义。

区域f-g-f'形成连续核苷酸序列。本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列可包含式f-g-f'的缺口聚物区域。

缺口聚物设计f-g-f'的总体长度可为例如12至32个核苷，诸如13至24个核苷、诸如14至22个核苷、诸如14至17个核苷、诸如16至18个核苷。

以举例方式而言，本发明的缺口聚物寡核苷酸可以用下式表示：

f1-8-g5-16-f'1-8，诸如

f1-8-g7-16-f'2-8

条件是缺口聚物区域f-g-f'的总体长度为至少12个诸如至少14个核苷酸。

区域f、g和f'在下文进一步定义并且可以并入f-g-f'式中。

缺口聚物-区域g

缺口聚物的区域g(缺口区)是使寡核苷酸能够募集核糖核酸酶h诸如人核糖核酸酶h1的核苷区域，其通常为dna核苷。核糖核酸酶h是识别dna和rna之间双链体并且酶促裂解rna分子的细胞酶。合适的缺口聚物可具有长度至少5个或6个连续dna核苷、诸如5-16个连续dna核苷、诸如6-15个连续dna核苷、诸如7-14个连续dna核苷、诸如8-12个连续dna核苷酸、诸如8-12个连续dna核苷的缺口区(g)。在一些实施例中，缺口区g可由6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个连续dna核苷组成。在一些实例下，缺口区中的胞嘧啶(c)dna可以甲基化，此类残基标记为5-甲基-胞嘧啶(^mec或以e代替c)。如果cg二核苷酸存在于缺口中，缺口中胞嘧啶dna的甲基化有利于降低潜在毒性，该修饰对寡核苷酸的功效无明显影响。

在一些实施例中，缺口区g可由6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个连续的硫代磷酸酯连接的dna核苷组成。在一些实施例中，缺口中的全部核苷间键均为硫代磷酸酯键。

尽管常规的缺口聚物具有dna缺口区，但存在修饰的核苷用于缺口区内部时允许募集核糖核酸酶h的修饰核苷的众多实例。已经报道了当修饰的核苷纳入缺口区内部时能够募集核糖核酸酶h的修饰的核苷，例如包括α-l-lna、c4'烷基化dna(如pct/ep2009/050349和vester等人(bioorg.med.chem.lett.18(2008)2296-2300)所述，两者均以引用方式并入本文)、由阿拉伯糖衍生的核苷诸如ana和2'f-ana(mangosr等人2003j.am.chem.soc.125,654-661)、una(非锁定核酸)(如fluiter等人(mol.biosyst.,2009,10,1039)所述，该文献以引用方式并入本文)。una是非锁定核酸，一般其中核糖的c2和c3之间的键已经移除，形成非锁定的“糖”残基。用于此类缺口聚物中的修饰的核苷可以是引入缺口区时采取2'内式(dna样)结构的核苷，即允许募集核糖核酸酶h的修饰。在一些实施例中，本文所述的dna缺口区(g)可任选地含有1至3个引入缺口区时采取2'内式(dna样)结构的糖修饰的核苷。

区域g-“缺口破坏者”

另选地，存在向缺口聚物的缺口区插入赋予3'内式构象的修饰的核苷，同时保留某种核糖核酸酶h活性的众多报告。此类具有以下缺口区的缺口聚物称作“缺口破坏者(gap-breaker)”或“妨碍缺口的(gap-disrupted)”缺口聚物，该缺口区包含一个或多个3'内式修饰的核苷，参见例如wo2013/022984。缺口破坏者寡核苷酸在缺口区内部保留足够的dna核苷区域以允许募集核糖核酸酶h。缺口破坏者寡核苷酸设计募集核糖核酸酶h的能力一般具有序列特异性或甚至化合物特异性–参见rukov等人2015nucl.acidsres.vol.43pp.8476-8487，该文献公开了在一些情况下提供更特异的靶rna切割作用的募集核糖核酸酶h的“缺口破坏者”寡核苷酸。用于缺口破坏者寡核苷酸的缺口区内部的修饰的核苷可例如为赋予3'内式构象的修饰的核苷诸如2'-o-甲基(ome)或2'-o-moe(moe)核苷或β-dlna核苷(核苷的核糖糖环的c2'和c4'之间的桥处于β构象)诸如β-d-氧基lna或scet核苷。

与包含上述区域g的缺口聚物一样，缺口破坏者缺口聚物或妨碍缺口的缺口聚物的缺口区在缺口的5'末端具有dna核苷(与区域f的3'核苷相邻)并且在缺口的3'末端具有dna核苷(与区域f'的5'核苷相邻)。包含妨碍缺口的缺口聚物一般在缺口区的5'末端或3'末端保留至少3或4个连续dna核苷的区域。

缺口破坏者寡核苷酸的示例性设计包括

f1-8-[d3-4-e1-d3-4]-f'1-8

f1-8-[d1-4-e1-d3-4]-f'1-8

f1-8-[d3-4-e1-d1-4]-f'1-8

其中区域g处于括号[dn-er-dm]内，d为连续dna核苷序列，e为经修饰的核苷(缺口破坏者或妨碍缺口的核苷)，并且f和f'为本文所定义的侧翼区，并且条件是缺口聚物区域f-g-f'的总体长度为至少12个诸如至少14个核苷酸。

在一些实施例中，妨碍缺口的缺口聚物的区域g包含至少6个dna核苷，诸如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个dna核苷。如前文所述，dna核苷可以是连续的或者可任选地散布有一个或多个经修饰的核苷，条件是缺口区g能够介导核糖核酸酶h募集。

缺口聚物-侧翼区f和f'

区域f紧邻区域g的5'dna核苷。区域f的3'最末端核苷为糖修饰的核苷，诸如高亲和力糖修饰的核苷，例如2'取代的核苷诸如moe核苷或lna核苷。

区域f'紧邻区域g的3'dna核苷。区域f'的5'最末端核苷为糖修饰的核苷，诸如高亲和力糖修饰的核苷，例如2'取代的核苷诸如moe核苷或lna核苷。

区域f的长度为1-8个连续核苷酸，诸如长度为2-6个诸如3-4个连续核苷酸。有利地，区域f的5'最末端核苷为糖修饰的核苷。在一些实施例中，区域f的两个5'最末端核苷为糖修饰的核苷。在一些实施例中，区域f的5'最末端核苷为lna核苷。在一些实施例中，区域f的两个5'最末端核苷为lna核苷。在一些实施例中，区域f的两个5'最末端核苷为2'取代的核苷诸如两个3'moe核苷。在一些实施例中，区域f的5'最末端核苷为2'取代的核苷诸如moe核苷。

区域f'的长度为2-8个连续核苷酸，诸如长度为3-6个诸如4-5个连续核苷酸。有利地，在实施例中，区域f'的3'最末端核苷为糖修饰的核苷。在一些实施例中，区域f'的两个3'最末端核苷为糖修饰的核苷。在一些实施例中，区域f'的两个3'最末端核苷为lna核苷。在一些实施例中，区域f'的3'最末端核苷为lna核苷。在一些实施例中，区域f'的两个3'最末端核苷为2'取代的核苷诸如两个3'moe核苷。在一些实施例中，区域f'的3'最末端核苷为2'取代的核苷诸如moe核苷。

应当指出，当区域f和/或区域f'的长度为1时，其有利地为lna核苷。

在一些实施例中，区域f和f'独立地由糖修饰的核苷的连续序列组成或包含该连续序列。在一些实施例中，区域f的糖修饰的核苷可独立地选自2'-o-烷基-rna单元、2'-o-甲基-rna、2'-氨基-dna单元、2'-氟-dna单元、2'-烷氧基-rna、moe单元、lna单元、阿糖核酸(ana)单元和2'-氟-ana单元。

在一些实施例中，区域f和区域f'独立地包含lna和2'取代的修饰的核苷(混合型侧翼设计)。

在一些实施例中，区域f和区域f'仅由一种类型的糖修饰的核苷诸如仅moe或仅β-d-氧基lna或仅scet组成。此类设计也称作统一侧翼设计或统一缺口聚物设计。

在一些实施例中，区域f或区域f'的全部核苷或者f和f'为lna核苷，诸如独立地选自β-d-氧基lna、ena或scet核苷。在一些实施例中，区域f由1-5个诸如2-4个诸如3-4个诸如1、2、3、4或5个连续lna核苷组成。在一些实施例中，区域f和区域f'的全部核苷均为β-d-氧基lna核苷。

在一些实施例中，区域f或区域f'的全部核苷或者f和f'为2'取代的核苷诸如ome或moe核苷。在一些实施例中，区域f由1、2、3、4、5、6、7或8个连续ome或moe核苷组成。在一些实施例中，仅侧翼区之一可由2'取代的核苷诸如ome或moe核苷组成。在一些实施例中，5'(f)侧翼区由2'取代的核苷诸如ome或moe核苷组成，而3'(f')侧翼区包含至少一个lna核苷诸如β-d-氧基lna核苷或cet核苷。在一些实施例中，3'(f')侧翼区由2'取代的核苷诸如ome或moe核苷组成，而5'(f)侧翼区包含至少一个lna核苷诸如β-d-氧基lna核苷或cet核苷。

在一些实施例中，区域f和区域f'的全部修饰的核苷均为lna核苷，诸如独立地选自β-d-氧基lna、ena或scet核苷，其中区域f或区域f'或者f和f'可任选地包含dna核苷(交替性侧翼，参见这些区域的定义以获取更多信息)。在一些实施例中，区域f和区域f'的全部修饰的核苷均为β-d-氧基lna核苷，其中区域f或区域f'或者f和f'可任选地包含dna核苷(交替性侧翼，参见这些区域的定义以获取更多信息)。

在一些实施例中，区域f和区域f'的5'最末端核苷和3'最末端核苷为lna核苷诸如β-d-氧基lna核苷或scet核苷。

在一些实施例中，介于区域f和区域g之间的核苷间键为硫代磷酸酯核苷间键。在一些实施例中，介于区域f'和区域g之间的核苷间键为硫代磷酸酯核苷间键。在一些实施例中，介于区域f或f'的核苷以及f和f'之间的核苷间键为硫代磷酸酯核苷间键。

其他缺口聚物设计公开于wo2004/046160、wo2007/146511和wo2008/113832中，这些专利据此以引用方式并入本文。

lna缺口聚物

lna缺口聚物是其中区域f和区域f'中任一者或两者均包含lna核苷或由其组成的缺口聚物。β-d-氧基缺口聚物是其中区域f和区域f'中任一者或两者均包含β-d-氧基lna核苷或由其组成的缺口聚物。

在一些实施例中，lna缺口聚物具有下式：[lna]1-5-[区域g]-[lna]1-5，其中区域g如缺口聚物区域g的定义中所定义。

moe缺口聚物

moe缺口聚物是其中区域f和区域f'由moe核苷组成的缺口聚物。在一些实施例中，moe缺口聚物具有以下设计：[moe]1-8-[区域g]-[moe]1-8，诸如[moe]2-7-[区域g]5-16-[moe]2-7，诸如[moe]3-6-[区域g]-[moe]3-6，其中区域g如缺口聚物定义中所定义。本领域中已经广泛使用具有5-10-5设计(moe-dna-moe)的moe缺口聚物。

混合型侧翼缺口聚物

混合型侧翼缺口聚物为以下lna缺口聚物，其中区域f和区域f'中的一者或两者包含2'取代的核苷，诸如独立地选自由以下项组成的组中的2'取代的核苷：2'-o-烷基-rna单元、2'-o-甲基-rna、2'-氨基-dna单元、2'-氟-dna单元、2'-烷氧基-rna、moe单元、阿糖核酸(ana)单元和2'-氟-ana单元诸如moe核苷。在一些实施例中，其中区域f和f'中的至少一者或区域f和区域f'两者包含至少一个lna核苷，区域f和区域f'中的其余核苷独立地选自由以下项组成的组：moe和lna。在一些实施例中，其中区域f和f'中的至少一者或区域f和区域f'两者包含至少两个lna核苷，区域f和区域f'中的其余核苷独立地选自由以下项组成的组：moe和lna。在一些混合型侧翼实施例中，区域f和区域f'中的一者或两者可进一步包含一个或多个dna核苷。

混合型侧翼缺口聚物设计公开于wo2008/049085和wo2012/109395中，这两件专利均据此以引用方式并入本文。

交替性侧翼缺口聚物

侧翼区可包含lna核苷和dna核苷二者并且称作“交替性侧翼(alternatingflanks)”，因为它们包含lna-dna-lna核苷的交替性基序。包含此类交替性侧翼的缺口聚物称作“交替性侧翼缺口聚物”。因此，“交替性侧翼缺口聚物”是lna缺口聚物寡核苷酸，其中至少一个侧翼(f或f')除lna核苷以外还包含dna。在一些实施例中，区域f或区域f'中的至少一者或区域f和区域f'两者均包含lna核苷和dna核苷二者。在此类实施例中，侧翼区f或f'或者f和f'两者包含至少三个核苷，其中f和/或f'区域的5'和3'最末端核苷为lna核苷。

交替性侧翼lna缺口聚物公开于wo2016/127002中。

交替性侧翼区域可包含最多3个连续dna核苷，诸如1至2个或者1个或2个或3个连续dna核苷。

可以将交替性侧翼标记为一系列整数，其代表lna核苷(l)的数目，随后是dna核苷(d)的数目，例如

[l]1-3-[d]1-4-[l]1-3

[l]1-2-[d]1-2-[l]1-2-[d]1-2-[l]1-2

在寡核苷酸设计中，这些将经常表示为数字，使得2-2-1代表5'[l]2-[d]2-[l]3'，并且1-1-1-1-1代表5'[l]-[d]-[l]-[d]-[l]3'。具有交替性侧翼的寡核苷酸中侧翼(区域f和区域f')的长度可独立地为3至10个核苷、诸如4至8个核苷、诸如5至6个核苷、诸如4、5、6或7个修饰的核苷。在一些实施例中，缺口聚物寡核苷酸中的仅侧翼之一具有交替性，而另一者由lna核苷酸构成。可以有利的是在3'侧翼(f')的3'末端具有至少两个lna核苷，以赋予额外的核酸外切酶抗性。一些具有交替性侧翼的寡核苷酸的实例是：

[l]1-5-[d]1-4-[l]1-3-[g]5-16-[l]2-6

[l]1-2-[d]1-2-[l]1-2-[d]1-2-[l]1-2-[g]5-16-[l]1-2-[d]1-3-[l]2-4

[l]1-5-[g]5-16-[l]-[d]-[l]-[d]-[l]2

条件是缺口聚物的总体长度为至少12个诸如至少14个核苷酸。

寡核苷酸中的区域d'或d”

在一些实施例中，本发明的寡核苷酸可包含寡核苷酸的与靶核酸互补的连续核苷酸序列(诸如缺口聚物f-g-f')以及其他5'和/或3'核苷或由其组成。其他5'和/或3'核苷可以完全互补于或可以不完全互补于靶核酸。本文中的此类其他5'和/或3'核苷可以称作区域d'和d”。

为了将连续核苷酸序列诸如缺口聚物与缀合物部分或另一个官能团连接，可以使用添加区域d'或d”。当用于连接时，具有缀合物部分的连续核苷酸序列可充当生物可切割接头。另选地，它可以用来提供核酸外切酶保护作用或促进合成或制造。

区域d'和d”可分别连接至区域f的5'末端或区域f'的3'末端，以产生具有下式的设计：d'-f-g-f'、f-g-f'-d”或

d'-f-g-f'-d”。在该实例中，f-g-f'是寡核苷酸的缺口聚物部分并且区域d'或d”构成寡核苷酸的独立部分。

区域d'或d”可独立地包含1、2、3、4或5个额外核苷酸或由其组成，所述额外核苷酸可以互补或不互补于靶核酸。与f或f'区域毗邻的核苷酸并非糖修饰的核苷酸，诸如dna或rna或这些的碱基修饰形式。d'或d”区域可充当核酸酶不稳定性生物可切割接头(参见接头的定义)。在一些实施例中，额外的5'和/或3'末端核苷酸以磷酸二酯键连接并且是dna或rna。wo2014/076195中公开了适合用作区域d'或d”的基于核苷酸的生物可切割接头，其以举例方式包括磷酸二酯连接的dna二核苷酸。wo2015/113922中公开了生物可切割接头在多-寡核苷酸构建体中的用途，其中它们用来连接单个寡核苷酸内部的多个反义构建体(例如缺口聚物区域)。

在一个实施例中，除构成缺口聚物的连续核苷酸序列之外，本发明的寡核苷酸还包含区域d'和/或d”。

在一些实施例中，本发明的寡核苷酸可以用下式表示：

f-g-f'，特别是f1-8-g5-16-f'2-8

d'-f-g-f'，特别是d'1-3-f1-8-g5-16-f'2-8

f-g-f'-d”，特别是f1-8-g5-16-f'2-8-d”1-3

d'-f-g-f'-d”，特别是d'1-3-f1-8-g5-16-f'2-8-d”1-3

在一些实施例中，位于区域d'和区域f之间的核苷间键为磷酸二酯键。在一些实施例中，位于区域f'和区域d”之间的核苷间键为磷酸二酯键。

全聚物

在一些实施例中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列的全部核苷均为糖修饰的核苷。此类寡核苷酸在本文中称为全聚物。

在一些实施例中，全聚物的全部糖修饰的核苷包含相同的糖修饰，例如，它们可以全部是lna核苷，或可以全部是2'o-moe核苷。在一些实施例中，全聚物的糖修饰的核苷可独立地选自lna核苷和2'取代的核苷，诸如选自由以下项组成的组中的2'取代的核苷：2'-o-烷基-rna、2'-o-甲基-rna、2'-烷氧基-rna、2'-o-甲氧乙基-rna(moe)、2'-氨基-dna、2'-氟-rna和2'-f-ana核苷。在一些实施例中，寡核苷酸包含lna核苷和2'取代的核苷，诸如选自由以下项组成的组中的2'取代的核苷：2'-o-烷基-rna、2'-o-甲基-rna、2'-烷氧基-rna、2'-o-甲氧乙基-rna(moe)、2'-氨基-dna、2'-氟-rna和2'-f-ana核苷。在一些实施例中，寡核苷酸包含lna核苷和2'-o-moe核苷。在一些实施例中，寡核苷酸包含(s)cetlna核苷和2'-o-moe核苷。在一些实施例中，寡核苷酸的每个核苷单元为2'取代的核苷。在一些实施例中，寡核苷酸的每个核苷单元为2'-o-moe核苷。

在一些实施例中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列的全部核苷是lna核苷，诸如β-d-氧基-lna核苷和/或(s)cet核苷。在一些实施例中，此类lna全聚物寡核苷酸的长度介于7和12个核苷(参见例如wo2009/043353)。此类短的完整lna寡核苷酸在抑制微rna方面特别有效。

多种全聚物化合物作为治疗用寡聚物时非常有效，特别是在靶向微rna(抗mir)或作为剪接转换寡聚物(sso)时。

在一些实施例中，全聚物包含至少一个xyx或yxy序列基序诸如重复序列xyx或yxy或由其组成，其中x是lna并且y是替代(即非lna)核苷酸类似物，诸如2'-omerna单元和2'-氟dna单元。在一些实施例中，以上序列基序可为例如xxy、xyx、yxy或yyx。

在一些实施例中，全聚物可包含介于7个和24个核苷酸之间诸如7、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23个核苷酸的连续核苷酸序列或由其组成。

在一些实施例中，全聚物的连续核苷酸序列包含至少30％、诸如至少40％、诸如至少50％、诸如至少60％、诸如至少70％、诸如至少80％、诸如至少90％、诸如95％、诸如100％的lna单元。对于完全lna化合物，有利的是它们的长度小于12个诸如7-10个核苷酸。

剩余单元可选自本文中提及的非lna核苷酸类似物，诸如选自由以下项组成的组中的那些：2'-o-烷基-rna单元、2'-ome-rna单元、2'-氨基-dna单元、2'-氟-dna单元、lna单元、pna单元、hna单元、ina单元和2'moerna单元或2'-omerna单元和2'-氟dna单元。

混聚物

术语“混聚物”是指包含dna核苷和糖修饰的核苷二者的寡聚物，其中存在募集核糖核酸酶h的不足长度的连续dna核苷。合适的混聚物可包含多达3个或多达4个连续dna核苷。在一些实施例中，混聚物或其连续核苷酸序列包含交替的糖修饰的核苷区域和dna核苷区域。通过并入寡核苷酸时与短dna核苷区域形成rna样(3'内式)构象的糖修饰的核苷的交替区域，可以制备不募集核糖核酸酶h的寡核苷酸。有利地，糖修饰的核苷是增强亲和力的糖修饰的核苷。

寡核苷酸混聚物通常用于提供基于占据对靶基因(诸如剪接调节物或微rna抑制物)的调节作用。

在一些实施例中，混聚物或其连续核苷酸序列中的糖修饰的核苷包含或全部是lna核苷，诸如(s)cet或β-d-氧基lna核苷。

在一些实施例中，混聚物的全部糖修饰的核苷包含相同的糖修饰，例如，它们可以全部是lna核苷，或可以全部是2'o-moe核苷。在一些实施例中，混聚物的糖修饰的核苷可独立地选自lna核苷和2'取代的核苷，诸如选自由以下项组成的组中的2'取代的核苷：2'-o-烷基-rna、2'-o-甲基-rna、2'-烷氧基-rna、2'-o-甲氧乙基-rna(moe)、2'-氨基-dna、2'-氟-rna和2'-f-ana核苷。在一些实施例中，寡核苷酸包含lna核苷和2'取代的核苷，诸如选自由以下项组成的组中的2'取代的核苷：2'-o-烷基-rna、2'-o-甲基-rna、2'-烷氧基-rna、2'-o-甲氧乙基-rna(moe)、2'-氨基-dna、2'-氟-rna和2'-f-ana核苷。在一些实施例中，寡核苷酸包含lna核苷和2'-o-moe核苷。在一些实施例中，寡核苷酸包含(s)cetlna核苷和2'-o-moe核苷。

在一些实施例中，混聚物或其连续核苷酸序列仅包含lna和dna核苷，此类lna混聚物寡核苷酸的长度可介于例如8个和24个核苷之间(参见例如wo2007112754，其公开了微rna的lna抗mir抑制剂)。

多种混聚物化合物作为治疗用寡聚物时非常有效，特别是在靶向微rna(抗mir)或作为剪接转换寡聚物(sso)时。

在一些实施例中，混聚物包含以下基序

…[l]m[d]n[l]m[d]n[l]m…或

…[l]m[d]n[l]m[d]n[l]m[d]n[l]m…或

…[l]m[d]n[l]m[d]n[l]m[d]n[l]m[d]n[l]m…或

…[l]m[d]n[l]m[d]n[l]m[d]n[l]m[d]n[l]m[d]n[l]m…

其中l代表糖修饰的核苷诸如lna或2'取代的核苷(例如2'-o-moe)，d代表dna核苷，并且其中每个m独立地选自1-6，并且每个n独立地选自1、2、3和4诸如1-3。在一些实施例中，每个l为lna核苷。在一些实施例中，至少一个l为lna核苷，并且至少一个l为2'-o-moe核苷。在一些实施例中，每个l独立地选自：lna和2'-o-moe核苷。

在一些实施例中，混聚物可包含介于10个和24个核苷酸之间诸如11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23个核苷酸的连续核苷酸序列或由其组成。

在一些实施例中，混聚物的连续核苷酸序列包含至少30％诸如至少40％诸如至少50％的lna单元。

在一些实施例中，混聚物包含核苷酸类似物和天然存在的核苷酸重复模式的连续核苷酸序列或一种类型的核苷酸类似物和第二类型的核苷酸类似物或由其组成。该重复模式可例如为：每个第二或每个第三核苷酸为核苷酸类似物诸如lna，并且剩余核苷酸为天然存在的核苷酸诸如dna，或可以为2'取代的核苷酸类似物，如本文所提及的2'氟类似物的2'moe，或在一些实施例中，选自本文中提及的核苷酸类似物群组。应当认识到，核苷酸类似物诸如lna单元的重复模式可与固定位置处(例如5'或3'末端)的核苷酸类似物组合。

在一些实施例中，从3'末端计数，寡聚物的第一核苷酸为核苷酸类似物，诸如lna核苷酸或2'-o-moe核苷。

在可以相同或不同的一些实施例中，从3'末端计数，寡聚物的第二核苷酸为核苷酸类似物，诸如lna核苷酸或2'-o-moe核苷。

在可以相同或不同的一些实施例中，寡聚物的5'末端为核苷酸类似物，诸如lna核苷酸或2'-o-moe核苷。

在一些实施例中，混聚物包含至少一个区域，该区域包含至少两个连续核苷酸类似物单元诸如至少两个连续lna单元。

在一些实施例中，混聚物包含至少一个区域，该区域包含至少三个连续核苷酸类似物单元诸如至少三个连续lna单元。

缀合物

如本文所用的术语“缀合物”是指与非核苷酸部分(缀合物部分或区域c或第三区域)共价连接的寡核苷酸。

本发明的寡核苷酸与一个或多个非核苷酸部分的缀合可例如通过影响寡核苷酸的活性、细胞分布、细胞摄取或稳定性来改善寡核苷酸的药理学特征。在一些实施例中，缀合物部分通过改善寡核苷酸的细胞分布、生物利用度、代谢、排泄、通透性和/或细胞摄取来调节或增强寡核苷酸的药代动力学特性。特别地，缀合物可使寡核苷酸靶向特定的器官、组织或细胞类型，并且由此增强寡核苷酸在这种器官、组织或细胞类型中的有效性。同时，缀合物可以起到减少寡核苷酸在非靶细胞类型、组织或器官中活性(例如非靶细胞类型、组织或器官中的脱靶活性或活性)的作用。

wo93/07883和wo2013/033230提供了合适的缀合物部分，这两件专利据此以引用方式并入本文。其他合适的缀合物部分是能够与脱唾液酸糖蛋白受体(asgpr)结合的那些。特别地，三价n-乙酰半乳糖胺缀合物部分适于asgpr结合，参见例如wo2014/076196、wo2014/207232和wo2014/179620(据此以引用方式并入本文)。此类缀合物用于增强肝脏对寡核苷酸的摄取，同时减少其在肾中的含量，由此与相同的寡核苷酸的未缀合形式相比，增加缀合的寡核苷酸的肝/肾比率。

寡核苷酸缀合物及其合成也已见诸以下文献报道：manoharan的综述，引自“antisensedrugtechnology,principles,strategies,andapplications”，s.t.crooke编著，第16章，marceldekker,inc.，2001；以及manoharan，antisenseandnucleicaciddrugdevelopment，2002，12，103，这两篇文献全文以引用方式并入本文。

在一个实施例中，非核苷酸部分(缀合物部分)选自由以下项组成的组：糖、细胞表面受体配体、药物、激素、亲脂物质、聚合物、蛋白质、肽、毒素(例如细菌毒素)、维生素、病毒蛋白(例如衣壳)或它们的组合。

接头

键合或接头是两个原子之间的连接，其经由一个或多个共价键将一个目标化学基团或区段与另一个目标化学基团或区段链接。缀合物部分可直接或通过链接部分(例如接头或系链)附接至寡核苷酸。接头起到的作用是将第三区域例如缀合物部分(区域c)共价连接至第一区域，例如与靶核酸互补的寡核苷酸或连续核苷酸序列(区域a)。

在本发明的一些实施例中，本发明的缀合物或寡核苷酸缀合物可任选地包含位于互补于靶核酸的寡核苷酸或连续核苷酸序列(区域a或第一区域)和缀合物部分(区域c或第三区域)之间的接头区(第二区域或区域b和/或区域y)。

区域b是指包含生理上不稳定的键或由其组成的可生物裂解的接头，该接头在哺乳动物体内通常遇到的条件下或与之相似的条件下可裂解。生理上不稳定的接头经历化学转化(例如裂解)的条件包括化学条件，诸如ph、温度、氧化或还原条件或试剂，以及在哺乳动物细胞中遇到的盐浓度或与之相似的盐浓度。哺乳动物细胞内条件还包括通常存在于哺乳动物细胞中的酶活性，诸如来自蛋白水解酶或水解酶或核酸酶的酶活性。在一个实施例中，可生物裂解的接头对s1核酸酶裂解敏感。在一个优选实施例中，对核酸酶敏感的接头包含1至10个核苷，诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷，更优选地包含2至6个核苷，最优选地包含包含2至4个链接的核苷，该核苷包含至少两个连续的磷酸二酯键合，诸如至少3或4或5个连续的磷酸二酯键合。优选地，核苷是dna或rna。包含磷酸二酯的可生物裂解的接头详细描述于wo2014/076195(此处通过引用并入)中。

区域y是指不必为可生物裂解的但主要用于将缀合物部分(区域c或第三区域)共价连接至寡核苷酸(区域a或第一区域)的接头。区域y接头可包含重复单元诸如乙二醇单元、氨基酸单元或氨基烷基的链结构或寡聚物。本发明的寡核苷酸缀合物可以由以下区域性元件a-c、a-b-c、a-b-y-c、a-y-b-c或a-y-c构成。在一些实施例中，接头(区域y)为氨基烷基诸如c2-c36氨基烷基，包括例如c6至c12氨基烷基。在一个优选实施例中，接头(区域y)为c6氨基烷基。

因此，根据本发明所述的寡核苷酸具有式(ii)

其中(a¹)和(a²)如上文所定义。

因此，本发明特别地涉及：

根据本发明所述的寡核苷酸，其中核苷(a¹)为dna核苷；

根据本发明所述的寡核苷酸，其中核苷(a²)为dna核苷、rna核苷或糖修饰的核苷；

根据本发明所述的寡核苷酸，其中核苷(a²)为dna核苷或糖修饰的核苷；

根据本发明所述的寡核苷酸，其中糖修饰的核苷为2'糖修饰的核苷；

根据本发明所述的寡核苷酸，其中核苷(a²)为：2'-烷氧基-rna，特别是2'-甲氧基-rna；2'-烷氧基烷氧基-rna，特别是2'-甲氧基乙氧基-rna；2'-氨基-dna；2'-氟-rna；或2'-氟-ana；

根据本发明所述的寡核苷酸，其中核苷(a²)为lna核苷；

根据本发明所述的寡核苷酸，其中lna核苷独立地选自β-d-氧基lna、6'-甲基-β-d-氧基lna和ena，特别是β-d-氧基lna；

根据本发明所述的寡核苷酸，其中核苷(a¹)和(a²)中的至少一个为2'-烷氧基烷氧基-rna；

根据本发明所述的寡核苷酸，其中2'-烷氧基烷氧基-rna为2'-甲氧基乙氧基-rna；

根据本发明所述的寡核苷酸，其中核苷(a¹)和(a²)均为dna核苷；

根据本发明所述的寡核苷酸，包含选自磷酸二酯核苷间键、硫代磷酸酯核苷间键以及如上文所定义的式(i)的三硫代磷酸酯核苷间键中的其他核苷间键；

根据本发明所述的寡核苷酸，包含选自硫代磷酸酯核苷间键以及如上文所定义的式(i)的三硫代磷酸酯核苷间键中的其他核苷间键；

根据本发明所述的寡核苷酸，包含介于1个和15个之间、特别地介于1个和5个之间、更特别地1个、2个、3个、4个或5个的如上文所定义的式(i)的三硫代磷酸酯核苷间键；

根据本发明所述的寡核苷酸，其中核苷间键均为式-p(＝s)(or)o2-的硫代磷酸酯核苷间键，其中r如上文所定义；

根据本发明所述的寡核苷酸，包含选自dna核苷、rna核苷和糖修饰的核苷的其他核苷；

根据本发明所述的寡核苷酸，其中一个或多个核苷为核碱基修饰的核苷；

根据本发明所述的寡核苷酸，其中寡核苷酸为反义寡核苷酸、sirna、微rna模拟物或核酶；

根据本发明所述的寡核苷酸，其中寡核苷酸为反义缺口聚物寡核苷酸；

根据本发明所述的寡核苷酸，其中式(i)的三硫代磷酸酯核苷间键在所述缺口聚物寡核苷酸的缺口区中；

根据本发明所述的寡核苷酸，其中缺口聚物寡核苷酸为lna缺口聚物、混合型侧翼缺口聚物或2'-取代的缺口聚物，特别是2'-o-甲氧基乙基缺口聚物；

根据本发明所述的缺口聚物寡核苷酸，其中缺口聚物寡核苷酸包含式5'-f-g-f'-3'的连续核苷酸序列，其中g为能够募集核糖核酸酶h的具有5至18个核苷的区域，并且所述区域g在5'和3'旁侧分别具有侧翼区f和f'，其中区域f和f'独立地包含1至7个2'-糖修饰的核苷酸或由其组成，其中与区域g毗邻的区域f的核苷为2'-糖修饰的核苷并且其中与区域g毗邻的区域f'的核苷为2'-糖修饰的核苷；

根据本发明所述的缺口聚物寡核苷酸，其中所述至少一个如上文所定义的式(i)的三硫代磷酸酯核苷间键定位在区域g的毗邻核苷之间或介于区域g和区域f'之间；

根据本发明所述的寡核苷酸，其中寡核苷酸为反义寡核苷酸混聚物或全聚物，特别是剪接-转换寡核苷酸或微rna抑制剂寡核苷酸；

根据本发明所述的寡核苷酸的药学上可接受的盐，特别是钠盐或钾盐；

一种缀合物，其包含根据本发明所述的寡核苷酸或药学上可接受的盐以及与所述寡核苷酸或所述药学上可接受的盐共价连接、任选地经接头部分共价连接的至少一个缀合物部分；

一种药物组合物，其包含根据本发明所述的寡核苷酸、药学上可接受的盐或缀合物以及治疗惰性载体；

根据本发明所述的寡核苷酸、药学上可接受的盐或缀合物，用作治疗活性物质；

根据本发明所述的寡核苷酸、药学上可接受的盐或缀合物，用于治疗或预防心脏病或血液病；

根据本发明所述的寡核苷酸、药学上可接受的盐或缀合物用于制备治疗或预防心脏病或血液病的药物的用途；

根据本发明所述的寡核苷酸、药学上可接受的盐或缀合物在治疗或预防心脏病或血液病中的用途；

一种治疗或预防心脏病或血液病的方法，其包括将有效量的根据本发明所述的寡核苷酸、药学上可接受的盐或缀合物施用于有需要的患者；

一种抑制细胞中靶rna(特别是人mrna或病毒rna)的方法，包括向表达所述靶rna的细胞施用根据本发明所述的寡核苷酸；

一种体外调节或抑制细胞中的靶rna(特别是人mrna或病毒rna)的方法，包括向表达所述靶rna的细胞施用根据本发明所述的寡核苷酸或缺口聚物寡核苷酸；

一种制造根据本发明所述的寡核苷酸的方法，其包括以下步骤：

(a)将3's-修饰的核苷亚磷酰胺偶联至5's-修饰的核苷或寡核苷酸的末端5'硫原子，以产生二硫代亚磷酸三酯中间体；

(b)使步骤a)中获得的二硫代亚磷酸三酯中间体硫氧化；以及

(c)任选地进一步延伸该寡核苷酸；

根据本发明所述的方法，其中将步骤(a)的5's-修饰的核苷或寡核苷酸连接至固相支持物；

根据本发明所述的方法，进一步包括从固相支持物上裂解寡核苷酸；并且

一种根据本发明所述的方法制造的寡核苷酸。

在一些实施例中，与相应的完全硫代磷酸酯连接的寡核苷酸相比，本发明的寡核苷酸在调节其靶核酸方面具有更高的活性。在一些实施例中，本发明提供了具有增强的活性、增强的功效、增强的比活性或增强的细胞摄取的寡核苷酸。在一些实施例中，本发明提供了具有改变的体外或体内作用持续时间诸如延长的体外或体内作用持续时间的寡核苷酸。在一些实施例中，在表达靶核酸的细胞中，在体外或体内测得更高的调节靶核酸的活性。

在一些实施例中，本发明的寡核苷酸具有改变的药理特性，诸如毒性下降，例如肾毒性下降、肝毒性下降或免疫刺激下降。肝毒性可例如在体内测定或通过使用wo2017/067970(据此以引用方式并入本文)中公开的体外测定法来测定。肾毒性可例如在体内测定或通过使用pct/ep2017/064770(据此以引用方式并入本文)中公开的体外测定法来测定。在一些实施例中，本发明的寡核苷酸包含5'cg3'二核苷酸，诸如dna5'cg3'二核苷酸，其中介于c和g之间的核苷间键为具有上文所定义的式(i)的三硫代磷酸酯核苷间键。

在一些实施例中，本发明的寡核苷酸具有改善的核酸酶抗性，诸如在血清中具有改善的生物稳定性。在一些实施例中，本发明的寡核苷酸的3'末端核苷具有a或g碱基，诸如3'末端lna-a或lna-g核苷。合适地，根据上文所定义的式(i)，介于寡核苷酸的两个3'最末端核苷之间的核苷间键可为三硫代磷酸酯核苷间键。

在一些实施例中，本发明的寡核苷酸具有增强的生物利用度。在一些实施例中，本发明的寡核苷酸具有更高的血液暴露量，诸如更长的血液保留时间。

根据本发明所述的寡核苷酸可例如根据以下方案进行制备。

可利用亚磷酰胺法通过固相合成将在非桥接位置以及相邻呋喃糖环的3'和5'位含有硫原子的三硫代磷酸酯键引入寡核苷酸中。使用配有通用接头的受控孔玻璃柱(cpg)进行合成。在此类固相支持物上，寡核苷酸通常通过顺序循环在3'至5'方向上构建，该顺序循环包括偶联5'o-dmt保护的核苷亚磷酰胺结构单元，然后进行dmt基团的(硫代)氧化、封端和脱保护。对于如本专利申请所述的三硫代磷酸酯的引入，将dmt保护的5'-脱氧-5'-巯基亚磷酰胺结构单元偶联至固相支持物结合的寡核苷酸链的游离5'-羟基基团。在(硫代)氧化和封端后，将所得的中间体脱保护以释放5'-硫醇基。

方案1

该脱保护具有挑战性，并且最好通过重复(超过15次)应用标准脱保护条件(通常为3-5％二氯乙酸或三氯乙酸的二氯甲烷溶液)或使用较高的酸浓度(例如，最高为10％三氯乙酸的二氯甲烷溶液)或强酸(例如，5％三氟乙酸的二氯甲烷溶液)来进行，优选地使用适当的阳离子清除剂(通常为20％三乙基硅烷、5％4-甲氧基苯硫酚或两者的混合物)。

方案2

然后将由此获得的游离的5'硫醇基与适当的5'o-dmt保护的3'-脱氧-3'-巯基亚磷酰胺构件偶联。由于此类构件的反应性较低，因此典型步骤包括使用4当量的12次偶联和更长的反应时间(7.5min)。然后可使用适当的试剂(例如，3-氨基-1,2,4-二噻唑-5-硫酮)对所得的二硫代亚磷酸酯中间体进行硫氧化，以提供所需的三硫代磷酸酯键。

方案3

在上述方案中：

r^2a和r^4a一起形成如上文所定义的-x-y-；或者

r^4a为氢，并且r^2a选自烷氧基(特别是甲氧基)、卤素(特别是氟)、烷氧基烷氧基(特别是甲氧基乙氧基)、链烯氧基(特别是烯丙氧基)和氨基烷氧基(特别是氨基乙氧基)；

r^2b和r^4b一起形成如上文所定义的-x-y-；或者

r^2b和r^4b同时均为氢；或者

r^4b为氢，并且r^2b选自烷氧基(特别是甲氧基)、卤素(特别是氟)、烷氧基烷氧基(特别是甲氧基乙氧基)、链烯氧基(特别是烯丙氧基)和氨基烷氧基(特别是氨基乙氧基)；

r³为二烷氨基或吡咯烷基；

r⁵为羟基或硫氢基保护基；并且

r如上文所定义。

现在将通过以下实例说明本发明，这些实例不具有限制性。

实例

实例1

寡核苷酸合成

使用bioautomation的mermade12自动化dna合成仪合成寡核苷酸。使用带有通用接头的受控孔玻璃支持物以1μmol的规模进行合成。

在偶联dna和lna亚磷酰胺的标准循环程序中，用3％(w/v)三氯乙酸的ch2cl2溶液按200μl三次施加30秒进行dmt去保护。用100μl0.1m的乙腈溶液(或对于lna-^mec结构单元，为乙腈/ch2cl21:1)和110μl0.1m的5-(3,5-双(三氟甲基苯基))-1h-四唑溶液的乙腈溶液作为活化剂并且偶联180秒，偶联相应的亚磷酰胺三次。为了硫氧化，使用0.1m3-氨基-1,2,4-二噻唑-5-硫酮在乙腈/吡啶1:1中的溶液(3×190μl，55秒)。使用thf/二甲基吡啶/ac2o8:1:1(capa,75μmol)和thf/n-甲基咪唑8:2(capb,75μmol)处理55秒，进行封端。

并入2',3'-二脱氧-3'-巯基亚磷酰胺的合成循环包括用3％(w/v)三氯乙酸的ch2cl2溶液按200μl三次施加30秒进行dmt去保护。用40μl0.1m的乙腈溶液和44μl0.1m的5-(3,5-双(三氟甲基苯基))-1h-四唑溶液的乙腈溶液处理900秒，偶联亚磷酰胺十次。偶联后立即施加三次190μl0.1m的3-氨基-1,2,4-二噻唑-5-硫酮在乙腈/吡啶1:1中的溶液处理55秒，进行硫氧化。使用thf/二甲基吡啶/ac2o8:1:1(capa,75μmol)和thf/n-甲基咪唑8:2(capb,75μmol)处理55秒，进行封端。

并入2',5'-脱氧-5'-巯基亚磷酰胺的合成循环包括使用100μl0.1m乙腈溶液和110μl0.1m的5-(3,5-双(三氟甲基苯基))-1h-四唑溶液的乙腈溶液处理180秒以偶联亚磷酰胺结构单元。进行三次偶联。使用0.1m的3-氨基-1,2,4-二噻唑-5-硫酮在乙腈/吡啶1:1中的溶液(3×190μl，55秒)进行硫氧化。为了封端，将thf/二甲基吡啶/ac2o8:1:1(capa,75μmol)和thf/n-甲基咪唑8:2(capb,75μmol)溶液施加55秒。用3％(w/v)三氯乙酸的ch2cl2溶液按200μl施加15次，持续30秒，以进行dmt去保护和释放硫醇。也可有利地通过在存在5-30％(v/v)三乙基硅烷的ch2cl2溶液和/或2-10％对甲氧基苯硫酚的ch2cl2的溶液的情况下施加3-6次200μl(持续45秒)1-10％(v/v)三氟乙酸或5-10％(w/v)三氯乙酸来进行dmt去保护和硫醇的释放。

在标准条件下(在55℃下使用32％氨水处理至少8h)，去除核碱基保护基并且从固相支持物上裂解。使用固相萃取小柱纯化粗制的dmt-on寡核苷酸，然后通过离子交换色谱法或使用c18柱的rp-hplc纯化方法进行再次纯化，然后用80％乙酸水溶液和乙醇沉淀去除dmt。

根据上述一般步骤制得以下分子。

粗体和带下划线的核苷酸之间的三硫代酯修饰

a、g、^mc、t代表lna核苷酸

a、g、c、t代表dna核苷酸

所有其他键均制备为硫代磷酸酯

化合物#1-8基于seqidno:1。如上表所示，它们在式(i)的三硫代磷酸酯核苷间键的位置有所不同。

实例2

体外mrna减少和胞内浓度(摄取)

将原代大鼠肝细胞铺种在96孔板中，并且在无抗生素的含有10％fcs的williams培养基e中进行处理。将细胞用lna溶液按所示的浓度在完整细胞培养基中进行处理。分别在24小时和72小时温育时间后，将细胞用含有ca²⁺和mg²⁺的pbs洗涤3次并且用165ulpurelinkpro裂解缓冲液裂解。使用thermofisher的purelinkpro96rna试剂盒根据生产商的说明，分离总rna，并且使用lightcycler多重rna病毒主混合物(roche)配合rnapob的引物探针组(invitrogen)进行rt-qpcr。将获得的数据对ribogreen归一化。

使用基于杂交的elisa测定法，确定lna寡核苷酸的胞内浓度。一式三份地处理全部数据点并且将数据以其平均值给出。

结果如图1所示。

从数据中可以看出，根据本发明所述的修饰具有很好的耐受性，并且寡核苷酸表现出良好的功效以及合适的胞内浓度。

实例3

肝和肾中的体内mrna减少

体重约20g的c57bl/6jbomtac雌性小鼠在第0天接受剂量为1mg/kg的单次给药(浓度为0.1mg/kg，体积为10ml/kg)，并且在第7天将动物处死。结束时采集血清、肝、肾和心脏组织。

使用qantigenemrna定量试剂盒(“bdna-assay”,panomics/affimetrix)，按照生产商的方案对组织中的mrna进行分析。对于组织裂解物，在1ml含有蛋白酶k的裂解缓冲液中通过超声处理将50-80mg组织裂解。将裂解物直接用于bdna测定，无需进行rna提取。靶标和gapdh的探针由panomics定制设计。在分析时，将获得的靶基因的发光单位归一化至管家gapdh。

结果如图2所示。

图2表明与未修饰的硫代磷酸酯对照相比，携带根据本发明所述的修饰的寡核苷酸改善了在肝脏中的靶浓度下降。考虑到该特定分子在该系列中显示出最低的体外靶浓度下降的事实，这些发现更令人惊讶。

实例4

血清胆固醇水平

体重约20g的c57bl/6jbomtac雌性小鼠在第0天接受剂量为1mg/kg的单次给药(浓度为0.1mg/kg，体积为10ml/kg)，并且在第7天将动物处死。结束时采集血清、肝、肾和心脏组织。

在“cobasintegra400plus”临床化学平台(rochediagnostics)上使用10μl血清分析血清中的胆固醇。

结果如图3所示。

数据表明，观察到携带根据本发明所述的修饰的寡核苷酸所具有的更高的靶浓度下降(图2，实例3)改善了血清胆固醇水平的降低，这是该特定序列活性的功能指标。考虑到该特定分子在该系列中显示出最低的体外靶浓度下降的事实，这些发现更令人惊讶。

实例5

肝、肾和心脏的体内组织摄取

体重约20g的c57bl/6jbomtac雌性小鼠在第0天接受剂量为1mg/kg的单次给药(浓度为0.1mg/kg，体积为10ml/kg)，并且在第7天将动物处死。结束时采集血清、肝、肾和心脏组织。

对于寡核苷酸定量，将带有荧光标记的pna探针与组织裂解物中的靶寡核苷酸杂交。使用与bdna测定相同的裂解物，不同之处仅在于使用含量经过精确称量的组织。异源双链通过aex-hplc和荧光检测进行定量。

结果如图4所示。

图4展示了根据本发明的修饰对组织摄取的有益效果。数据不仅表明肝和肾中的组织含量高，而且该修饰具有令人惊讶的改善心脏的组织分布的潜力。考虑到该特定分子在该系列中显示出最低的体外靶浓度下降的事实，这些发现更令人惊讶。

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