一种生物体内温度检测纳米晶材料及其制备方法和检测试剂盒与流程

本申请涉及生物检测领域，尤其涉及一种生物体内温度检测纳米晶材料及其制备方法和检测试剂盒。

背景技术：

随着科学的进步，在温度测量领域人们发现了一个新的热点：生物荧光温度检测。对于生物体来说，温度是一个非常重要的因素，环境温度直接或间接影响生物的生长发育、生活状态、繁殖和分布状况，而且温度对于生物的动作行为的理解有着重要的意义，这种情况对多种疾病的早期诊断和治疗是至关重要的。因此对生物体内的温度检测是有着重要意义。

目前，温度测量的方法主要有接触式（例如：热电偶和热电阻的测温）和非接触式（例如：红外热像仪）两种。在强电磁场或酸碱化学实验中，接触式测温方法不能用于温度测量。红外热像仪种非接触式测温方法的应用范围很广，但是它本身有两个局限性：一、温度测试的

精确程度与被测材料的性质有关；二、探测温度发射出的近红外光很容易被生物组织吸收，不利于在生物医疗领域的温度测试。

稀土离子（ln³⁺）掺杂的微、纳米上转换发光材料由于物理化学性质稳定、发射光范围广、荧光寿命长、低毒性、组织穿透深度深和低背景荧光等优点常用来进行温度传感的研究。尽管已有许多原理性应用的研究报道，但较低的发光效率限制了稀土掺杂纳米材料的应用和发展。通过调控掺杂基质、掺杂元素及掺杂方式(用发光中心和敏化离子共掺杂代替传统发光中心单掺杂)可以使稀土掺杂纳米材料的发光得到增强。此外，核壳包覆也是一种能有效增强发光效率的手段。在裸核纳米粒子表面外延包覆同质壳，能够有效隔绝缺陷、溶剂或者表面配体对发光中心的猝灭，避免激发能量的损失，进而增强发光。

技术实现要素：

为了解决上述的技术问题，本申请提供了一种核壳结构的稀土氟化物纳米晶材料，在kbi3f10:ce/tb或kbi3f10:ce/eu纳米晶的表面包覆了一层惰性壳层，增强了纳米晶的荧光强度和发光效率，并通过柠檬酸配体修饰获得良好的水溶性和生物相容性，可以用于生物体内温度检测传感器的制备，具有非接触式、高灵敏度的优势。

为了实现上述目的，本申请采用了以下的技术方案：

一种核壳结构的稀土氟化物纳米晶材料，该纳米晶材料的纳米晶分子式如下：kbi3f10:ce/tb@kbi3f10或kbi3f10:ce/eu@kbi3f10。

优选，该纳米晶材料为水溶性纳米晶材料，由柠檬酸配体包覆kbi3f10:ce/tb@kbi3f10或kbi3f10:ce/eu@kbi3f10纳米晶构成。

优选，kbi3f10:ce/tb@kbi3f10纳米晶为kbi3f10:20ce/10tb@kbi3f10，kbi3f10:ce/eu@kbi3f10纳米晶为kbi3f10:20ce/6eu@kbi3f10。

进一步，本申请提供了一种核壳结构的稀土氟化物纳米晶材料的制备方法，该方法包括以下的步骤：

1）1毫摩尔硝酸钾kno3，2.1毫摩尔硝酸铋bi(no3)3∙5h2o，0.6毫摩尔硝酸铈ce(no3)3∙5h2o，0.3毫摩尔硝酸铽tb(no3)3∙5h2o或0.18毫摩尔硝酸铕eu(no3)3∙5h2o以及4毫摩尔柠檬酸溶于6毫升去离子水中，搅拌20分钟后，加入8毫摩尔氟化铵（nh4f）和40毫升聚乙二醇；

2）搅拌1小时后，在油浴锅120℃条件下，加热12小时，加热过程中及时补充去离子水；3）产物用乙醇和去离子水的混合液洗涤3-5次；

4）再将1毫摩尔硝酸钾kno3，2.1毫摩尔硝酸铋bi(no3)3∙5h2o以及4毫摩尔柠檬酸溶于6毫升去离子水中，搅拌20分钟后，加入8毫摩尔氟化铵（nh4f）和40毫升聚乙二醇，加热到150℃反应1小时，冷却至室温后再加入步骤3）中的产物，搅拌1小时后，在油浴锅120℃条件下，加热12小时，加热过程中及时补充去离子水；

5）待溶液冷却至室温后，用乙醇和去离子水的混合液洗涤3-5次，得核壳纳米晶。

进一步，本申请提供了所述的纳米晶材料用于生物体内温度检测应用。

进一步，本申请提供了一种体内温度检测传感器，该传感器包括权利要求1或2或3所述的纳米晶材料。

本申请通过在kbi3f10:ce/tb或kbi3f10:ce/eu纳米晶的表面包覆了一层惰性壳层获得核壳结构纳米晶，并通过柠檬酸配体修饰使其获得良好的水溶性和生物相容性。根据稀土离子tb³⁺或eu³⁺中的某一特定能级的发光强度可随温度变化的关系,可以将该纳米晶用于生物体内温度检测传感器的制备，同时由于核壳结构极大地增强了纳米晶的荧光强度和发光效率，使温度检测更为灵敏准确，因此该核壳纳米晶能够很好的应用于生物体内荧光温度的检测应用。

附图说明

图1（a）和（b）分别为产物的xrd图谱和透射电子显微镜图，（c）为的透射电子显微镜图。

图2（a）kbi3f10:20ce/10tb纳米晶中tb³⁺离子在紫外区域的激发谱，（b）kbi3f10:20ce/10tb纳米晶在紫外激发条件下的发射谱，产物在紫外激发条件下的发光强度随敏化离子ce³⁺（c）与激活离子tb³⁺（d）的变化关系曲线。

图3裸核(a)和核/惰性壳(b)的荧光光谱和相应的紫外灯激发下的发光照片。

图4hepg2细胞与纳米晶在5%co237℃下共同培养24h后的细胞存活率。

图5kbi3f10:20ce/10tb@kbi3f10在258nm波长激发下98-573k温度范围内的发射谱；

图6（a）kbi3f10:20ce/6eu纳米晶在紫外激发条件下的发射谱，(b)kbi3f10:20ce/6eu@kbi3f10在258nm波长激发下98-573k温度范围内的发射谱；(c)tb³⁺的⁵d4→⁷f5和eu³⁺的⁵d0→⁷f2处发射强度（归一化）随温度变化的变化趋势图谱。

具体实施方式

1实验部分

1.1主要仪器和试剂：

硝酸钾(99.0%)，硝酸铋(98.0%)，硝酸铈(99.9%),硝酸铽(99.9%)，硝酸铕(99.9%)，柠檬酸(99.5%)，氟化铵(99.99%)、乙二醇(99.8%)、mtt和二甲基亚砜（dmso）购买于sigma-aldrich公司，无水乙醇购买于国药集团化学试剂有限公司；hepg2购买于上海艾研生物科技有限公司。

1.2kbi3f10:ce/tb@kbi3f10纳米晶的制备

以kbi3f10:20ce/10tb@kbi3f10为例，1毫摩尔硝酸钾（kno3），1.1毫摩尔硝酸铋（bi(no3)3∙5h2o），0.6毫摩尔硝酸铈（ce(no3)3∙5h2o），0.3毫摩尔硝酸铽（tb(no3)3∙5h2o）以及4毫摩尔柠檬酸溶于6毫升去离子水中，搅拌20分钟后，加入8毫摩尔氟化铵（nh4f）和40毫升聚乙二醇，搅拌1小时后，在油浴锅120℃条件下，加热12小时，加热过程中及时补充去离子水。产物用乙醇和去离子水的混合液洗涤3-5次。

再将1毫摩尔硝酸钾kno3，2.1毫摩尔硝酸铋bi(no3)3∙5h2o以及4毫摩尔柠檬酸溶于6毫升去离子水中，搅拌20分钟后，加入8毫摩尔氟化铵（nh4f）和40毫升聚乙二醇，加热到150℃反应1小时，冷却至室温后再加入上述步骤中的产物，搅拌1小时后，在油浴锅120℃条件下，加热12小时，加热过程中及时补充去离子水；待溶液冷却至室温后，用乙醇和去离子水的混合液洗涤3-5次，得核壳纳米晶。

不同浓度的离子掺杂样品或eu离子掺杂的样品，通过改变前驱溶液中相应的离子浓度或种类来实现。

1.3表征仪器

x射线衍射图谱(brukerd8advance，cu-kα(λ=1.5405å))，透射电子显微镜(tem,feitecnaig2f20)，光谱仪(flurohub-b,horibajobinyvon)，紫外灯功率为50w，电感耦合等离子体原子发射仪（perkinelmeroptima3300dv）。

x射线衍射样品的制备：将烘干的纳米晶铺满样品支架的凹槽；

透射电子显微镜样品的制备：将每次合成的全部纳米晶溶于4毫升乙醇溶液中，超声5分钟后，滴3-6滴液体于超薄碳膜上。

1.4核壳结构的纳米晶形貌、尺寸对比

kbi3f10:20ce/10tb产物的x射线衍射图谱如图1a所示，所有衍射峰均与标准pdf卡片jcpds41-0842号一一对应，且无多余的衍射峰，表明本申请得到的产物为纯立方相kbi3f10。透射电子显微镜分析结果表明产物为片状，分散性良好。如图1c所示，为核壳kbi3f10:20ce/10tb@kbi3f10纳米晶的透射电镜照片,表明核壳结构纳米晶的粒径尺寸更加均一、分散性好，颗粒平均尺寸增加到42nm，这也说明我们在纳米晶核表面成功地包覆了壳层结构。

1.5核壳结构纳米晶荧光增强分析

如图2a所示，激发谱为典型的ce³⁺：4f→5d宽谱带跃迁峰，最佳激发波长约为350nm。在紫外激发条件下，产物在绿光区域表现出明亮的下转移发光，对应于tb³⁺离子的f→f跃迁（图2b）。随着敏化离子ce³⁺离子浓度从10增到20mol%，纳米晶的吸收能力增大，因此发光强度显著增强，当ce³⁺离子浓度超过20mol%，敏化离子与激活离子之间的无辐射交叉弛豫几率增大，导致发光强度下降（图2c）。与之类似，tb³⁺离子的最佳掺杂浓度约为10mol%（图2d）。kbi3f10:20ce/10tb纳米晶的荧光量子效率高达56%。

图3中可以看出核壳结构kbi3f10:20ce/10tb@kbi3f10纳米晶的荧光强度是kbi3f10:20ce/10tb纳米晶的11倍左右，这说明此种惰性壳层包覆结构能够极大地增强纳米晶的荧光强度。此外两种纳米晶的荧光光谱的形状大致一样，只是荧光强度发生明显变化，增强的主要原因是由于包覆壳层之后，表面的发光离子被转移到内部，大幅度地减少了表面缺陷。插图是的两种纳米晶的荧光数码照片，肉眼可见荧光明显增强。

1.6细胞毒性试验

mtt（3-（4,5-二甲基噻唑-2-甲基）-2,5-二苯基四唑溴化铵）细胞毒性检测的方法可以用来反映出核壳纳米晶的生物相容性。首先进行细胞培养，将hepg2细胞接种到96孔板中，在37℃5%co2环境中培养24小时。再将不同浓度的溶液加入到细胞培养皿中，也在相同环境中培养24小时。然后，再将mtt粉末溶于磷酸盐缓冲溶液中，取100µlmtt（0.5mg/ml）溶液加入到培养皿中，在37℃下培养4小时。最后，加入二甲基亚砜，在酶标仪下进行检测。如图4所示，hepg2细胞在不同样品的浓度下生存率都很高，甚至在样品溶液浓度高达100µg/ml时，细胞的生存率仍保持在88%左右。

1.7变温性质的测试

温度的调节采取的牛津仪器公司的液氮恒温槽（(oxfordinstruments,optistatdn)和温控器(oxford,instruments,itc502s)。在98-573k的温度范围内，测量样品的荧光强度随温度的变化。结果如图5显示，tb³⁺的发光强度随着温度的不断升高逐渐减弱。

为了验证本实验方案的通用性，本申请进一步制备了水溶性kbi3f10:20ce/6eu@kbi3f10纳米晶。如图6a所示，产物在紫外激发条件下，表现出eu³⁺特有的发射峰。如图6b所示，eu³⁺的发光强度随着温度的不断升高逐渐减弱。如图6c所示为tb³⁺⁵d4→⁷f5和eu³⁺的⁵d0→⁷f2处发射强度（归一化）随温度变化的变化趋势，结果显示无论是tb³⁺的发光强度还是eu³⁺的发光强度都随着温度的不断升高逐渐减弱，这种现象如其它文献报道的一样，都是在热激活情况下，非辐射衰减所造成的。

2.结论

本申请通过溶剂热法制备出水溶性kbi3f10:ce/tb与kbi3f10:ce/eu纳米晶，其中kbi3f10:20ce/10tb纳米晶的荧光量子效率高达56%。在其表面包覆了一层惰性壳层获得核壳结构纳米晶，并通过柠檬酸配体修饰使其获得良好的水溶性和生物相容性。由于稀土离子tb³⁺或eu³⁺的发光强度与温度之间存在一定的关系，可以将该纳米晶用于生物体内温度检测传感器的制备，同时由于核壳结构极大地增强了纳米晶的荧光强度和发光效率，具有响应快与空间分辨率高的优势，因此该核壳纳米晶在生物体内荧光温度的检测中有很好的应用前景。

以上为对本申请实施例的描述，通过对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本申请。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的。本文中所定义的一般原理可以在不脱离本申请的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本申请将不会被限制于本文所示的这些实施列，而是要符合与本文所公开的原理和新颖点相一致的最宽的范围。

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