降解和去除异常TDP-43的抗体片段的制作方法

本发明涉及一种降解并去除具有结构异常的tdp-43的修饰的抗体片段。此外，本发明涉及一种编码该修饰的抗体片段的核酸、一种包含该核酸的表达载体、一种包含该核酸的基因治疗剂以及一种使用该核酸治疗tdp-43的聚集体积聚的疾病的方法。

背景技术：

核蛋白tdp-43(43kda的tardna结合蛋白)已被确定为肌萎缩性侧索硬化症(als)(是最难治的神经系统疾病)和额颞叶痴呆(ftd)(是痴呆的第二大流行形式)的致病蛋白。在ftd和als的情况下，tdp-43从细胞核脱出，并在细胞质中形成病理性聚集体；然而，其机制尚不清楚。

已发现在ftd和als情况下tdp-43在泛素化包涵体(ubiquitinatedinclusions)中含量很高。目前，具有tdp-43病理异常的疾病被分类为称为tdp-43蛋白病(proteinopathy)的一组疾病。各种报道提出了tdp-43功能障碍可能是als病理学的本质。

因此，说明tdp-43的生理和病理功能可能克服als，并且全世界在这方面都在进行大量研究。tdp-43蛋白病的最明显和最重要的病理学发现是tdp-43的核染色减少和细胞质中包涵体的形成。说明这种异位定位的功能对于理解als的病理生理机制至关重要。

tdp-43的分子结构具有两个rna结合区(rrm)、一个c端富含甘氨酸的区域、一个核定位信号(nls)和一个核输出信号(nes)。tdp-43在所有体细胞中结构性表达，并且主要位于细胞核中。在ftd和als的情况下，在正常组织中tdp-43也无一例外地定位在细胞核中。因此，已经注意到tdp-43的异位定位对病理状况的影响。tdp-43阳性细胞包涵体经常含有碎片化和磷酸化的tdp-43。

除ftd和als外，其他已报告的异位定位的tdp-43疾病还包括佩里综合征(perrysyndrome)、低度神经胶质瘤(low-gradeglioma)、阿尔茨海默病(alzheimer’sdisease)、亨廷顿病(huntington’sdisease)、皮克病(pick’sdisease)、帕金森病(parkinson’sdisease)、路易体病(lewybodydisease)、皮质基底节变性(corticobasaldegeneration)、包涵体肌炎(inclusionbodymyositis)、b-细胞淋巴瘤(m期)等。

本发明人从以下方面进行了深入研究：(1)tdp-43如何从与疾病无关的正常结构转变为毒性病原体结构，以及(2)如何捕获异常结构。结果，已证明tdp-43中rrm1的半胱氨酸残基对于维持正常结构很重要，并且异常修饰可以在体外复制在als和ftd患者的大脑中观察到的异常聚集体(专利文献1)。此外，据报道，鉴定出异常聚集并异常定位在细胞质中的tdp-43分子中的外部暴露序列，并以该序列为靶标，从而可以预测罹患tdp-43的聚集体积聚的疾病的风险(专利文献2)。

此外，ptl3和ptl4报道了检测tdp-43的抗体。然而，这些抗体识别的聚集体处于晚期，进一步需要更早的结构变化作为治疗靶标。

引文清单

专利文献

专利文献1：jp2014-171425a

专利文献2：jp2013-162772a

专利文献3：wo2009/008529

专利文献4：wo2013/061163

技术实现要素：

技术问题

本发明的目的是提供一种能够降解和去除错误折叠的tdp-43的修饰的抗体片段。本发明的另一个目的是提供一种编码该修饰的抗体片段的核酸，一种包含该核酸的表达载体，一种包含该核酸的基因治疗剂以及一种使用该核酸治疗tdp-43的聚集体积聚的疾病的方法。

解决问题的方案

作为实现上述目的的广泛研究的结果，本发明人发现，当将伴侣蛋白介导的自噬(cma)定位信号加入能够结合错误折叠的tdp-43的scfv中，并将所获得的scfv被用作细胞内抗体时，可以在体外抑制细胞死亡，并且错误折叠的tdp-43可以在体内被降解和清除。

基于这些发现，在进一步研究的基础上完成了本发明，并提供了以下修饰的抗体片段、核酸、表达载体、基因治疗剂和使用该核酸治疗tdp-43的聚集体积聚的疾病的方法。

项1.

一种修饰的抗体片段，其包含能够与错误折叠的tdp-43结合的抗体片段和伴侣蛋白介导的自噬定位信号肽；

所述抗体片段包括：

重链可变区，所述重链可变区包含由氨基酸序列gfnikdyy(seqidno:1)组成的重链cdr1、由氨基酸序列idpedget(seqidno:2)组成的重链cdr2、由氨基酸序列tiiyyygsryvdy(seqidno:3)组成的重链cdr3，所述重链可变区任选地具有3个以下的氨基酸取代，和/或

轻链可变区，所述轻链可变区包含由氨基酸序列ssisssy(seqidno:4)组成的轻链cdr1、由氨基酸序列rts组成的轻链cdr2、由氨基酸序列qqgssiplt(seqidno:5)组成的轻链cdr3，所述轻链可变区任选地具有3个以下的氨基酸取代；

所述抗体片段为scfv、vh或vl。

项2.

根据项1所述的修饰的抗体片段，其中所述抗体片段为scfv。

项3.

根据项1或2所述的修饰的抗体片段，其中所述抗体片段为人源化抗体片段。

项4.

一种核酸，其编码根据项1-3中任一项所述的修饰的抗体片段。

项5.

一种表达载体，其包含根据项4所述的核酸。

项6.

一种基因治疗剂，其包含根据项4所述的核酸。

项7.

根据项6所述的治疗剂，用于治疗其中tdp-43的聚集体积聚的疾病。

项8.

根据项7所述的治疗剂，其中，所述tdp-43的聚集体积聚的疾病为肌萎缩性侧索硬化症、额颞叶痴呆或佩里综合症。

项9.

根据项6所述的治疗剂，其用于诱导热激蛋白。

项10.

根据项9所述的治疗剂，其中，所述热激蛋白为hsp70。

项11.

一种治疗tdp-43的聚集体积聚的疾病的方法，所述方法包括向哺乳动物施用有效量的根据项4所述的核酸。

项12.

根据项11所述的方法，其中，所述tdp-43聚集体积聚的疾病为肌萎缩性侧索硬化症、额颞叶痴呆或佩里综合征。

发明的有益效果

通过使用本发明的修饰的抗体片段作为细胞内抗体，可以降解和除去错误折叠的tdp-43，并且可以抑制神经元细胞的死亡。因此，可以预期本发明的修饰的抗体片段对tdp-43的聚集体积聚的疾病具有治疗作用。

此外，本发明的修饰的抗体片段可以诱导热激蛋白。结果，可以获得使tdp-43的聚集体松散的效果，并且可以进一步促进通过自噬的降解。

附图说明

图1显示了抗体片段对错误折叠的tdp-43的结合特异性。n＝3，数据：平均值±sd

图2显示了scfv的降解特性。左：蛋白免疫印迹(westernblotting)，右：显示剩余scfv百分比的图表。每个数据都用肌动蛋白标准化。数据：平均值±sd，来自三个独立实验。与dmso对照组相比，*p<0.05，****p<0.001。该测试基于dunnett的双向方差分析。n.s.表示不显著。

图3显示了scfv的错误折叠的tdp-43降解特性。对于每个时间数据，将荧光带的光密度数据用肌动蛋白标准化。数据：平均值±sd，来自三个独立实验。与载体对照组相比，***p<0.005，****p<0.001。该测试基于dunnett的双向方差分析。n.s.表示不显著。

图4的上部图显示scfv对错误折叠的tdp-43诱导的细胞死亡和聚集体形成的保护作用。数据：来自三个不同盲选视野的平均值±sd，与载体对照组相比，*p<0.05，***p<0.005，****p<0.001。该测试基于dunnett的双向方差分析。图4的下部图显示，scfv抑制了由错误折叠的tdp-43引起的细胞死亡并提高了存活率。n＝3，数据：平均值±sd，与载体对照组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005，****p<0.001。该测试基于dunnett的双向方差分析。

图5显示在错误折叠的tdp-43存在下，scfv-cma诱导热激伴侣蛋白hsp70。左：hsp70mrna量，n＝3，数据：平均值±sd，与载体对照组相比，***p<0.005，****p<0.001。该测试基于dunnett的双向方差分析。n.s.表示不显著。右：hsp70蛋白量，数据：均值±sd，来自三个独立实验。每个数据均用肌动蛋白标准化。与载体对照组相比，**p<0.01。该测试基于dunnett的双向方差分析。n.s.表示不显著。

图6显示hsp70使错误折叠的tdp-43的聚集体溶解。平均值±sd，来自三个独立的实验。每个数据均用肌动蛋白标准化。与载体对照组相比，*p<0.05。该测试基于dunnett的双向方差分析。n.s.表示不显著。

图7显示，如在als患者中，通过子宫内电穿孔引入脑中的外源错误折叠的tdp-43形成泛素化和磷酸化的tdp-43阳性聚集体。

图8显示通过子宫内电穿孔引入脑中的外源错误折叠的tdp-43和scfv-cma共存于脑聚集体中。

图9显示通过子宫内电穿孔引入的胎儿脑中的tdp-43聚集体通过scfv-cma的共表达而减少。数据：平均值±sd，n＝7，与载体对照组相比，****p＜0.001。该测试基于非配对的t检验。

图10显示通过子宫内电穿孔引入的胎儿脑中的野生型tdp-43不会通过scfv-cma的共表达而减少。数据：平均值±sd，n＝7。该测试基于非配对的t检验。n.s.表示不显著。

图11显示在胎儿期通过子宫内电穿孔表达的scfv-myc-cma不影响小鼠的早期发育，并且不引起脑中的神经毒性或异常胶质增生。比例尺＝100μm

具体实施方式

下面将详细描述本发明。

在本说明书中，术语“包含”包括“基本上由...组成”和“由...组成”的含义。

在本发明中，除非另有说明，否则术语“基因”包括双链dna、单链dna(有义链或反义链)及其片段。此外，在本发明中，除非另有说明，否则术语“基因”没有区别地指调节区、编码区、外显子和内含子。

在本发明中，术语“核酸”、“核苷酸”和“多核苷酸”具有相同的含义并且包括dna和rna，其可以是双链或单链的。

如下所示的参考序列id已在ncbi网站上登记。

本发明的修饰的抗体片段的特征在于，其包含能够与错误折叠的tdp-43结合的抗体片段和伴侣蛋白介导的自噬定位信号肽；

该抗体片段包括：

重链可变区，该重链可变区包含由氨基酸序列gfnikdyy(seqidno:1)组成的重链cdr1、由氨基酸序列idpedget(seqidno:2)组成的重链cdr2和由氨基酸序列tiiyyygsryvdy(seqidno:3)组成的重链cdr3，该重链可变区任选地具有3个以下的氨基酸取代，和/或

轻链可变区，该轻链可变区包含由氨基酸序列ssisssy(seqidno:4)组成的轻链cdr1、由氨基酸序列rts组成的轻链cdr2和由氨基酸序列qqgssiplt(seqidno:5)组成的轻链cdr3，该轻链可变区任选地具有3个以下的氨基酸取代；

抗体片段为scfv、vh或vl。

本发明中的tdp-43通常来自动物，优选来自哺乳动物，特别优选来自人。

人源tdp-43是一种包含414个氨基酸的蛋白质，其一级结构与核不均一核糖核蛋白(hnrna)家族具有高度同源性。tdp-43具有两个高度保守的rna识别基序(rrm1和rrm2)，并在c端侧包含一个富含甘氨酸的区域，该区域与hnrnp家族的成员结合。

人源tdp-43蛋白的氨基酸序列登记为refseq登录号np_031401，并如seqidno:6所示。此外，编码人源tdp-43蛋白的基因登记为refseq登录号nm_007375，其碱基序列如seqidno:7所示。

本发明中的tdp-43可以为具有由seqidno:6表示的氨基酸序列的蛋白质的变体，只要其具有与包含由seqidno:6表示的氨基酸序列的蛋白质相同的生物活性即可。

错误折叠的tdp-43是指被折叠成不同于天然结构的结构的tdp-43，特别是指具有与tdp-43蛋白病相关的致病性结构的tdp-43。

本发明的抗体片段中包含的互补决定区(cdr)的特征在于能够与错误折叠的tdp-43结合。期望本发明的抗体片段特异性结合错误折叠的tdp-43并且不结合具有正常结构的tdp-43。

本发明的抗体片段优选包含：

重链可变区，该重链可变区包含由氨基酸序列gfnikdyy(seqidno:1)组成的重链cdr1、由氨基酸序列idpedget(seqidno:2)组成的重链cdr2和由氨基酸序列tiiyyygsryvdy(seqidno:3)组成的重链cdr3，该重链可变区任选地具有3个以下的氨基酸取代，和/或

轻链可变区，该轻链可变区包含由氨基酸序列ssisssy(seqidno:4)组成的轻链cdr1、由氨基酸序列rts组成的轻链cdr2和由氨基酸序列qqgssiplt(seqidno:5)组成的轻链cdr3，该轻链可变区任选地具有3个以下的氨基酸取代。

由于本发明中使用的重链cdr2包含pest序列，因此它具有在没有错误折叠的tdp-43的情况下迅速降解的性质。

进行氨基酸取代，以保持抗体片段与错误折叠的tdp-43的结合。短语“任选地具有3个以下的氨基酸取代”是指在重链可变区或轻链可变区中总共3个以下的氨基酸可以被取代。氨基酸取代优选在cdr中进行。

氨基酸取代的数目优选为2以下，更优选为1以下，甚至更优选为0。当进行氨基酸取代时，认为通过用具有相似性质的氨基酸取代，可以保持原始抗体片段的活性。特定氨基酸序列中氨基酸取代的技术是已知的。

scfv是指包含重链可变区和轻链可变区的fv通过适当的肽接头连接的抗体片段。vh和vl分别指由重链可变区组成的抗体片段和由轻链可变区组成的抗体片段。

本发明的抗体片段优选为scfv。scfv可以为vh和vl以任何顺序连接的scfv。

对本发明的抗体片段的可变区中的构架区(fr区)的序列没有特别限制，只要该抗体片段能够与错误折叠的tdp-43结合即可，并且可以使用任何序列。本发明的抗体片段优选是具有人源框架区的人源化抗体片段。这样的人源化抗体可以通过已知方法来制备。

伴侣蛋白介导的自噬(cma)定位信号肽是指诱导定位到cma的信号肽。cma是指其中蛋白被伴侣蛋白识别并且复合物通过与被认为是溶酶体上的受体的lamp2a结合而被转移到溶酶体中并被降解的途径。因此，本发明的修饰的抗体片段中cma的存在促进了与抗体片段结合的错误折叠的tdp-43的自噬降解。

可以使用任何伴侣蛋白介导的自噬(cma)定位信号肽而没有特别限制，只要其为可以诱导定位到cma的信号肽即可。其实例包括包含氨基酸序列kfreq(seqidno:8)的肽。

在本发明的修饰的抗体片段中，抗体片段和伴侣蛋白介导的自噬定位信号肽可以以任何顺序结合，只要可以获得本发明的效果即可。此外，它们可以直接键合，或者它们之间可以存在任何氨基酸序列。除抗体片段和肽外，其他蛋白质和肽可与本发明的修饰的抗体片段结合。

本发明的核酸的特征在于编码上述修饰的抗体片段。可以使用编码构成修饰的抗体片段的抗体片段和肽中的每一个的核酸，通过常规方法如生化切割/重组来制备核酸。编码抗体片段和伴侣蛋白介导的自噬定位信号肽的核酸可以通过常规方法来制备，例如pcr、化学合成和生物化学裂解/重组。

本发明的表达载体的特征在于包含上述核酸。表达载体没有特别限制，并且可以广泛使用已知的表达载体。考虑到例如转移核酸的细胞的类型，可以适当地选择合适的表达载体。除了上述核酸外，表达载体还可包含启动子、增强子、终止子、多腺苷酸化信号、选择标记、复制起点等。表达载体可以是自主复制载体，也可以是当转移到宿主细胞中时整合到宿主细胞基因组中并与整合的染色体一起复制的载体。可以通过已知方法将上述核酸插入表达载体。

如何构建表达载体以及如何将表达载体转移到细胞中是众所周知的。例如，可以参考sambrookandrussell,molecularcloning,alaboratorymanual,3rdedition,coldspringharborlaboratorypress(2001)。

本发明的基因治疗剂的特征在于包含上述核酸。通过使用本发明的基因治疗剂在细胞中表达核酸，可以将本发明的修饰的抗体片段用作细胞内抗体(体内抗体)。

为了在细胞中表达核酸，例如，可以使用非病毒载体或病毒载体。非病毒载体的实例包括脂质体、聚合物胶束、阳离子载体等。病毒载体的例子包括逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒(adeno-associatedvirus)、仙台病毒(sendaivirus)、博纳病毒(bornavirus)等。将包含上述核酸的载体引入解毒的病毒中，并用该病毒感染细胞或组织，从而可以将核酸引入细胞或组织中。

根据使用形式，本发明的基因治疗剂可以任选地包含生物学上可接受的载体\赋形剂等。本发明的基因治疗剂可以通过常规方法制备。例如，本发明的基因治疗剂可以以片剂、胶囊剂、酏剂、微胶囊等形式口服使用，任选地具有糖衣或肠衣；作为外用制剂(如软膏和膏药)、喷雾剂、吸入剂等经皮、经鼻或经气管使用；以及与水或其他药学上可接受的液体一起以注射形式(例如无菌溶液或悬浮液)胃肠外使用。

作为本发明的基因治疗剂中的活性成分的核酸的量，根据剂型、给药途径等适当选择，通常为在制剂总量中的约0.0001-90重量％，优选为约0.001-70重量％。

将本发明的基因治疗剂施用于包括人在内的哺乳动物。施用本发明的基因治疗剂的方法没有特别限制，并且可以通过本领域技术人员已知的方法进行，例如动脉内注射、静脉内注射或皮下注射。根据剂型的种类、给药方法、患者的年龄和体重、患者的症状等，最终可以通过医生的判断适当确定本发明的基因治疗剂的剂量。

本发明的基因治疗剂可以在细胞中表达修饰的抗体片段，并降解和去除错误折叠的tdp-43，因此可以用于治疗tdp-43的聚集体积聚的疾病。其中tdp-43的聚集体积聚的疾病没有特别限制。其实例包括肌萎缩性侧索硬化、额颞叶痴呆、佩里综合征、低度神经胶质瘤、阿尔茨海默病、亨廷顿病、皮克病、帕金森病、路易体病、皮质基底节变性、包涵体肌炎、b细胞淋巴瘤(m期)等。其中，本发明的基因治疗剂可优选用于肌萎缩性侧索硬化症、额颞叶痴呆和佩里综合征。

本发明的基因治疗剂还可以用于诱导热激蛋白。热激蛋白具有使tdp-43的聚集体疏松并促进其降解的作用。热激蛋白优选是在错误折叠的蛋白的存在下诱导的蛋白，其实例包括hsp70、hsp25、hsp104、hsp110等。其中，优选hsp70。

当本发明的修饰的抗体片段用作细胞内抗体时，它不影响野生型tdp-43，可以降解并去除错误折叠的tdp-43，并且可以抑制神经元细胞死亡。因此，本发明的修饰的抗体片段对tdp-43的聚集体积聚的疾病具有治疗作用。

本发明的修饰的抗体片段也可以诱导热激蛋白。结果，可以获得松散tdp-43的聚集体的效果，并且因此可以进一步促进通过自噬的降解。

实施例

下面将提供实施例以更详细地描述本发明。但是，本发明不限于这些实施例。

实验方法

除非另有说明，否则以下测试实施例中的材料，试剂和实验方法如下。

scfv的制备

从小鼠杂交瘤中，使用商业化的mrna提取试剂盒(invitrogen,carlsbad,ca,usa)和cdna合成试剂盒(superscriptiiireversetranscriptase(invitrogen))，以信使rna为模板分别用寡聚dt引物制备信使rna和cdna。通过常规pcr扩增，使用5’-gactcgagtcgacatcgattttttttttttttttt-3’(seqidno:9)和5’-ctcaattttcttgtccaccttggtgc-3’(seqidno:10)的引物对克隆vhcdna，以及使用5’-gactcgagtcgacatcgattttttttttttttttt-3’(seqidno:11)和5’-ctcattcctgttgaagctcttgacaatggg-3’(seqidno:12)的引物对克隆vlcdna。

vh和vl通过接头序列连接，在接头序列中三个ggggs(seqidno:13)串联连接(5’-tgaaccgcctccacctatttccaactttgtcccc-3’(seqidno:14),5’-ggcggtggcggatctgaggttcagctgcagcagt-3’(seqidno:15))。此外，将伴侣蛋白介导的自噬信号(cma)氨基酸序列kfreq(5’-cgagcatgcatctagaaaattcagagaacaatgatctagagggccctatt-3’(seqidno:16),5’-aatagggccctctagatcattgttctctgaattttctagatgcatgctcg-3’(seqidno:17))和myc标签(5’-gcccaggcccgaattcgccatggaaattgtgctcacccagt-3’(seqidno:18),5’-tagatgcatgctcgagttattgttctctgaatttcaggtcctcctctgagatc-3’(seqidno:19))添加到羧基末端。这些vh-vl和vl-vh被亚克隆到pcdna3载体(invitrogen)中。

克隆的dna编码的vh和vl的氨基酸序列如下所示。带下划线的部分依次为cdr1、cdr2和cdr3。此外，vh在cdr2中包含pest序列(ridpedgetk(seqidno:20))。此外，与vh和vl的以下氨基酸序列相对应的碱基序列也显示在下面。

vh(氨基酸序列)

evqlqqsgaelvkpgasvklsctasgfnikdyymhwvkqrteqglewigridpedgetkyapkfqgkatitadtssntaylqlssltsedtavyyctiiyyygsryvdywgqgttltvs(seqidno:21)

vl(氨基酸序列)

eivltqspttmaaspgekititcsasssisssylhwyqqkpgfspklliyrtsnlasgvparfsgsgsgtsysltigtmeaedvatyycqqgssipltfgsgtklei(seqidno:22)

vh(碱基序列)

gaggttcagctgcagcagtctggggcagagcttgtgaagccaggggcctcagtcaagttgtcctgcacagcttctggcttcaacattaaagactactatatgcactgggtgaagcagaggactgaacagggcctggagtggattggaaggattgatcctgaggatggtgaaactaaatatgccccgaaattccagggcaaggccactattacagcagacacatcctccaacacagcctacctgcagctcagcagcctgacatctgaggacactgccgtctattactgtactatcatttattactacggtagtcgctacgttgactactggggccaaggcaccactctcacagtctcc(seqidno:23)

vl(碱基序列)

gaaattgtgctcacccagtctccaaccaccatggctgcatctcccggggagaagatcactatcacctgcagtgccagctcaagtataagttccagttacttgcattggtatcagcagaagccaggattctcccctaaactcttgatttataggacatccaatctggcttctggagtcccagctcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaattggcaccatggaggctgaagatgttgccacttactactgccagcagggtagtagtataccactcacgttcggctcggggacaaagttggaaata(seqidno:24)

培养细胞与转染

使用补充了10％胎牛血清(fbs)和青霉素-链霉素(100倍)的dulbecco改良的eagle培养基(dmem；nacalaitesque,inc.)在具有5％co2的37℃的培养箱中培养hek293a细胞和neuro2a细胞。使用fugenehd(roche)根据所附文件进行质粒转染。

蛋白免疫印迹法和免疫沉淀法

将hek293a细胞在含有蛋白酶抑制剂(roche)的ripa缓冲液(20mmhepes-koh(ph7.4)、125mmnacl、2mmedta、1％nonidet-p40、1％脱氧胆酸钠)中裂解以产生裂解物。

将裂解物调整为2％sds和100mm二硫苏糖醇(dtt)。为了进行蛋白质免疫印迹，将样品添加到商业聚丙烯酰胺凝胶(wako)中，进行电泳，然后转移到pvdf膜上，然后与一抗反应，然后与过氧化物酶标记的二抗(jacksonimmunolaboratory)反应，之后使用商用化学发光试剂盒(ecl；thermo-fisherscientific或nacalaitesque,inc.)显色。

夹心elisa法

进行夹心elisa以定量scfv与抗原的细胞内结合。使用上述方法，将flag标记的tdp-43(tdp-43-flag)和myc标记的scfv(scfv-myc)转染到hek293a细胞中。48小时后，将细胞在ripa缓冲液中裂解以制备裂解物。分别将裂解物添加到以1:1000稀释的抗flag抗体(m2sigma)包被的elisa板(nunc)中，在22℃下反应1小时，然后与以1:500稀释的兔源抗myc抗体(cellsignaling)在4℃下反应16小时。

洗涤后，过氧化物酶标记的抗兔igg抗体(jacksonimmunolaboratory)在22℃反应30分钟。最后，加入abs(2,2'-叠氮基-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸盐(roche))以显色，然后用多板读数器(multiplatereader)进行分析(吸光度：405nm，参考值：490nm)。

scfv蛋白的半衰期和降解抑制分析

将myc标记的scfv(scfv-myc、scfv-myc-cl1和scfv-myc-cma)转染到培养的细胞中(hek293a)。48小时后，以100μg/ml的浓度添加环己酰亚胺(chx)以停止新的蛋白合成。之后立即分别以10μm和0.1μm的浓度添加蛋白酶体抑制剂(乳胞素(lactacystin))和溶酶体抑制剂(巴弗洛霉素(bafilomycin))，并在10小时和24小时后收集细胞，包括不添加任何化合物的对照，然后通过将它们溶解在含有2-巯基乙醇的2％sds样品缓冲液中进行变性。之后，根据上述蛋白免疫印迹法，使用抗myc抗体进行检测，通过光密度法对条带进行定量。

scfv的tdp-43蛋白降解效率的分析

通过上述方法共表达用halo标签(promega)标记的tdp-43(tdp-43-halo)和myc标记的scfv(scfv-myc)。48小时后，通过添加1μm的diacfam配体(promega)来对表达的tdp-43-halo进行标记15分钟，然后洗涤培养基，并在正常培养基中继续培养。加入diacfam配体12小时和24小时后，立即用2％sds样品缓冲液收集细胞，并进行5-20％聚丙烯酰胺凝胶电泳。然后，用荧光照相机(las-3000；fujifilm)对凝胶照相。此后，将凝胶转移到pvdf膜上进行蛋白免疫印迹，并进行分析。

延时视频显微镜分析

使用上述方法，在hek293a细胞中共表达gfp标记的tdp-43(tdp-43-gfp)和scfv-cma。24小时后，将hoechst33342(nacalaitesque,inc.)添加到培养基中以使细胞核染色，并使用定时荧光显微镜(bzx-710；keyence,osaka)以及随附的软件每30分钟进行连续拍摄，持续48小时。在第一次拍摄之前，随机选择了四个位置，然后在相同的位置拍摄照片。

细胞存活和细胞死亡分析

通过上述方法，在96多孔板的neuro2a细胞中共表达flag标记的tdp-43和myc标记的scfv。48小时后，同时加入商购活/死细胞定量试剂盒(multitox-fluor多重细胞毒性测定；promega)中的甘氨酰-苯基丙氨酰基-氨基氟香豆素(gf-afc)和双丙氨酰基-丙氨酰基-苯基丙氨酰-罗丹明110(bis-aaf-r110)，并在培养箱中反应2小时。然后，使用荧光多板读数器(perkinelmer)，以400/505nm的荧光计数活细胞，并以485/520nm的荧光计数死细胞。

定量pcr分析

使用市售的rna提取试剂盒(invitrogen)和cdna制备试剂盒(invitrogen)由通过上述方法转染的hek293a细胞制备cdna。根据sybergreen定量试剂盒(toyobo)的说明手册的协议，使用实时pcr检测系统(bio-rad)进行pcr，并使用随附的软件进行定量分析。使用的引物序列如下。hsp70:5’-caagatcaccatcaccaacg-3’(seqidno:25)和5’-tcgtcctccgctttgtactt-3’(seqidno:26)；gapdh:5’-gcaccgtcaaggctgagaac-3’(seqidno:27)和5’-tggtggtgaagacgccagtgga-3’(seqidno:28)

子宫内电穿孔

在异氟烷吸入麻醉下，从妊娠13.5天的sjr妊娠小鼠中取出子宫。在保持子宫的同时，将1-2μl溶解在纯净pbs中的tdp-43-gfp或gfp、scfv-myc和mcherry(takarabioinc.)(pcag-tdp-43-gfp、pcag-scfv-myc、pcag)的表达质粒可视地注射到胎儿侧脑室。然后，用圆形电极(cuy650p5；nepagene)轻轻捏住大脑外侧，将阴极置于质粒注射侧，间歇施加5次电刺激(31v，50ms，950毫秒的间隔)。此后，将子宫归还母体的腹腔，然后缝合，并继续妊娠。

小鼠脑切片的免疫组织化学染色方法

通过上述方法继续妊娠后，取出胎儿，腹膜内施用戊巴比妥。然后，心脏灌注施用4％pfa进行灌注固定。取出大脑后，将其在4℃的4％pfa溶液中进一步后固定16小时，然后嵌入oct化合物(sakurafinetekjapanco.,ltd.)中，并用液氮固定。用低温恒温器制备12μm切片，并将其附着在涂有mas的载玻片上。

在免疫染色中，首先通过用含1％triton-x100的0.1mpbs-t缓冲液洗涤去除oct化合物，然后添加含3％牛血清白蛋白的pbs-t缓冲液(nacalaitesque,inc.)进行封闭。之后，与一抗在4℃反应16小时，然后洗涤。然后，与荧光标记的二抗(fluo抗体，invitrogen)在22℃下反应1小时，然后洗涤。然后，使用包含4’,6二脒基-2-苯基吲哚(dapi)的固定介质(载体)进行盖玻片(coverglass)处理。使用共聚焦激光显微镜(fv1000-dix81,olympuscorporation)观察切片并拍照。

试验例1：体外试验

在培养的细胞(hek293a)中表达scfv-myc和tdp-43(野生型，突变的核定位信号类型(mnls)、核聚集体形成类型(c173s/c175s)和细胞质聚集体形成型(cytoplasmicaggregate-formingtype)(mnls-c173s/c175s))，并通过夹心elisa法分析裂解物，以定量tdp-43和scfv的结合。结果显示在图1中。

在培养的细胞中表达scfv(未标记、cli1标记和cma标记)，并添加环己酰亚胺(100μg/ml)以停止蛋白合成。24小时后，收集细胞，并通过蛋白免疫印迹法定量剩余的scfv-myc。结果显示在图2的右侧。

在培养的细胞中表达halo标记的tdp-43(野生型和细胞质聚集体形成型(mnls-c173s/c175s))，并在24小时后添加荧光halo配体。0小时、12小时和24小时后，收集细胞，施加于sds-page，用荧光成像设备分析并定量。结果显示在图3中。

在培养的细胞(hek293a细胞)中共表达tdp-43-egfp(细胞质聚集体形成型)和scfv，并用延时荧光显微镜随时间拍照。定量每100个细胞的聚集体的数量、每个细胞的聚集体的尺寸以及剩余的细胞，并且计算四个视野的平均值。结果显示在图4的上部。

将载体或scfv(未标记、cl1标记和cma标记)与野生型或错误折叠的tdp-43在培养的细胞(neuro2a)中共表达，并对细胞活力和细胞毒性进行定量。结果显示在图4的下部。

试验例2：hsp70的诱导

tdp-43-flag(野生型和细胞质聚集形成型(mnls-c173s/c175s))或载体、以及scfv-myc(无信号、cl1和cma信号)或载体在培养细胞(hek293a)中共表达，并在48小时后收集细胞。从细胞中收集cdna，并通过实时pcr法分析hsp70的mrna。结果显示在图5的左侧。通过：蛋白免疫印迹在细胞裂解物中检测到hsp70，并且通过光密度测定法定量蛋白水平。结果显示在图5的右侧。

tdp-43-flag在培养的细胞(hek293a)中用载体、hsp90或hsp70过表达，并将细胞溶解在表面活性剂(1％tritonx100)中，然后分离为上清液和沉淀物。使用hsp70抗体通过蛋白免疫印迹法分析上清液和沉淀物，并通过光密度测定法定量检测的条带。用不溶的tdp-43除以可溶的tdp-43获得的数据显示在图6中。

试验例3：体内测试

将tdp-43-gfp和scfv-cma转移到13.5的胎龄(e13.5)的小鼠的胎儿大脑的侧脑室，继续妊娠。在怀孕的第16天，固定胎儿的大脑，并准备脑切片并用抗gfp抗体、抗泛素抗体和抗磷酸化tdp-43抗体进行免疫染色。错误折叠的tdp-43为mnls-tdp-43c173s/c175s。结果显示在图7中。

以与上述相同的方式，将tdp-43-egfp和scfv-myc-cma转移至e13.5的胎儿大脑中，并继续妊娠。在e16时固定胎儿大脑，准备脑切片并用抗gfp抗体和抗myc抗体免疫染色。结果显示在图8中。

以与上述相同的方式，将tdp-43-egfp、scfv-myc-cma和mcherry转移至e13.5的胎儿大脑中，并继续妊娠。在e16时固定胎儿大脑，准备脑切片并用抗gfp抗体、抗myc抗体和抗mcherry抗体免疫染色。然后，通过荧光强度和大小对聚集体进行定量。错误折叠的tdp-43的结果显示在图9中，野生型tdp-43的结果显示在图10中。在表达野生型tdp-43的小鼠大脑中，scfv-myc-cma没有影响tdp-43的表达水平。

以与上述相同的方式，将scfv-myc-cma和mcherry转移到e13.5的胎儿脑中。怀孕和分娩后，持续观察至第21天。后代被正常泌乳和断奶，并显示出与对照相同的生长。在同一天，固定大脑，并用抗myc抗体、抗mcherry抗体、抗neun抗体、抗iba1抗体和抗gfap抗体免疫染色。结果显示在图11中。

序列表

<110>国立大学法人滋贺医科大学

<120>降解和去除异常tdp-43的抗体片段

<130>p19-052wo

<150>jp2018-049752

<151>2018-03-16

<160>28

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>8

<212>prt

<213>小白鼠

<400>1

glypheasnilelysasptyrtyr

15

<210>2

<211>8

<212>prt

<213>小白鼠

<400>2

ileaspprogluaspglygluthr

15

<210>3

<211>13

<212>prt

<213>小白鼠

<400>3

thrileiletyrtyrtyrglyserargtyrvalasptyr

1510

<210>4

<211>7

<212>prt

<213>小白鼠

<400>4

serserilesersersertyr

15

<210>5

<211>9

<212>prt

<213>小白鼠

<400>5

glnglnglyserserileproleuthr

15

<210>6

<211>414

<212>prt

<213>智人

<400>6

metserglutyrileargvalthrgluaspgluasnaspgluproile

151015

gluileprosergluaspaspglythrvalleuleuserthrvalthr

202530

alaglnpheproglyalacysglyleuargtyrargasnprovalser

354045

glncysmetargglyvalargleuvalgluglyileleuhisalapro

505560

aspalaglytrpglyasnleuvaltyrvalvalasntyrprolysasp

65707580

asnlysarglysmetaspgluthraspalaserseralavallysval

859095

lysargalavalglnlysthrseraspleuilevalleuglyleupro

100105110

trplysthrthrgluglnaspleulysglutyrpheserthrphegly

115120125

gluvalleumetvalglnvallyslysaspleulysthrglyhisser

130135140

lysglypheglyphevalargphethrglutyrgluthrglnvallys

145150155160

valmetserglnarghismetileaspglyargtrpcysaspcyslys

165170175

leuproasnserlysglnserglnaspgluproleuargserarglys

180185190

valphevalglyargcysthrgluaspmetthrgluaspgluleuarg

195200205

gluphepheserglntyrglyaspvalmetaspvalpheileprolys

210215220

propheargalaphealaphevalthrphealaaspaspglnileala

225230235240

glnserleucysglygluaspleuileilelysglyileservalhis

245250255

ileserasnalagluprolyshisasnserasnargglnleugluarg

260265270

serglyargpheglyglyasnproglyglypheglyasnglnglygly

275280285

pheglyasnserargglyglyglyalaglyleuglyasnasnglngly

290295300

serasnmetglyglyglymetasnpheglyalapheserileasnpro

305310315320

alametmetalaalaalaglnalaalaleuglnsersertrpglymet

325330335

metglymetleualaserglnglnasnglnserglyproserglyasn

340345350

asnglnasnglnglyasnmetglnarggluproasnglnalaphegly

355360365

serglyasnasnsertyrserglyserasnserglyalaalailegly

370375380

trpglyseralaserasnalaglyserglyserglypheasnglygly

385390395400

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405410

<210>7

<211>1245

<212>dna

<213>智人

<400>7

atgtctgaatatattcgggtaaccgaagatgagaacgatgagcccattgaaataccatcg60

gaagacgatgggacggtgctgctctccacggttacagcccagtttccaggggcgtgtggg120

cttcgctacaggaatccagtgtctcagtgtatgagaggtgtccggctggtagaaggaatt180

ctgcatgccccagatgctggctggggaaatctggtgtatgttgtcaactatccaaaagat240

aacaaaagaaaaatggatgagacagatgcttcatcagcagtgaaagtgaaaagagcagtc300

cagaaaacatccgatttaatagtgttgggtctcccatggaaaacaaccgaacaggacctg360

aaagagtattttagtacctttggagaagttcttatggtgcaggtcaagaaagatcttaag420

actggtcattcaaaggggtttggctttgttcgttttacggaatatgaaacacaagtgaaa480

gtaatgtcacagcgacatatgatagatggacgatggtgtgactgcaaacttcctaattct540

aagcaaagccaagatgagcctttgagaagcagaaaagtgtttgtggggcgctgtacagag600

gacatgactgaggatgagctgcgggagttcttctctcagtacggggatgtgatggatgtc660

ttcatccccaagccattcagggcctttgcctttgttacatttgcagatgatcagattgcg720

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gaacctaagcacaatagcaatagacagttagaaagaagtggaagatttggtggtaatcca840

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aacaatcaaggtagtaatatgggtggtgggatgaactttggtgcgttcagcattaatcca960

gccatgatggctgccgcccaggcagcactacagagcagttggggtatgatgggcatgtta1020

gccagccagcagaaccagtcaggcccatcgggtaataaccaaaaccaaggcaacatgcag1080

agggagccaaaccaggccttcggttctggaaataactcttatagtggctctaattctggt1140

gcagcaattggttggggatcagcatccaatgcagggtcgggcagtggttttaatggaggc1200

tttggctcaagcatggattctaagtcttctggctggggaatgtag1245

<210>8

<211>5

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>cma-目标基序

<400>8

lyspheargglugln

15

<210>9

<211>35

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>9

gactcgagtcgacatcgattttttttttttttttt35

<210>10

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>10

ctcaattttcttgtccaccttggtgc26

<210>11

<211>35

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>11

gactcgagtcgacatcgattttttttttttttttt35

<210>12

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>12

ctcattcctgttgaagctcttgacaatggg30

<210>13

<211>5

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>接头

<400>13

glyglyglyglyser

15

<210>14

<211>34

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>14

tgaaccgcctccacctatttccaactttgtcccc34

<210>15

<211>34

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>15

ggcggtggcggatctgaggttcagctgcagcagt34

<210>16

<211>50

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>16

cgagcatgcatctagaaaattcagagaacaatgatctagagggccctatt50

<210>17

<211>50

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>17

aatagggccctctagatcattgttctctgaattttctagatgcatgctcg50

<210>18

<211>41

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>18

gcccaggcccgaattcgccatggaaattgtgctcacccagt41

<210>19

<211>53

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>19

tagatgcatgctcgagttattgttctctgaatttcaggtcctcctctgagatc53

<210>20

<211>10

<212>prt

<213>小白鼠

<400>20

argileaspprogluaspglygluthrlys

1510

<210>21

<211>119

<212>prt

<213>小白鼠

<400>21

gluvalglnleuglnglnserglyalagluleuvallysproglyala

151015

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202530

tyrmethistrpvallysglnargthrgluglnglyleuglutrpile

354045

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505560

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65707580

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859095

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100105110

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115

<210>22

<211>107

<212>prt

<213>小白鼠

<400>22

gluilevalleuthrglnserprothrthrmetalaalaserprogly

151015

glulysilethrilethrcysseralaserserserileserserser

202530

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354045

iletyrargthrserasnleualaserglyvalproalaargpheser

505560

glyserglyserglythrsertyrserleuthrileglythrmetglu

65707580

alagluaspvalalathrtyrtyrcysglnglnglyserserilepro

859095

leuthrpheglyserglythrlysleugluile

100105

<210>23

<211>357

<212>dna

<213>小白鼠

<400>23

gaggttcagctgcagcagtctggggcagagcttgtgaagccaggggcctcagtcaagttg60

tcctgcacagcttctggcttcaacattaaagactactatatgcactgggtgaagcagagg120

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ctgcagctcagcagcctgacatctgaggacactgccgtctattactgtactatcatttat300

tactacggtagtcgctacgttgactactggggccaaggcaccactctcacagtctcc357

<210>24

<211>321

<212>dna

<213>小白鼠

<400>24

gaaattgtgctcacccagtctccaaccaccatggctgcatctcccggggagaagatcact60

atcacctgcagtgccagctcaagtataagttccagttacttgcattggtatcagcagaag120

ccaggattctcccctaaactcttgatttataggacatccaatctggcttctggagtccca180

gctcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaattggcaccatggag240

gctgaagatgttgccacttactactgccagcagggtagtagtataccactcacgttcggc300

tcggggacaaagttggaaata321

<210>25

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>25

caagatcaccatcaccaacg20

<210>26

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>26

tcgtcctccgctttgtactt20

<210>27

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>27

gcaccgtcaaggctgagaac20

<210>28

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>28

tggtggtgaagacgccagtgga22

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