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您当前的位置： 早期检测禽种群中坏死性肠炎爆发的方法与流程
2021-02-02 17:02:58|
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本发明涉及早期检测禽种群中坏死性肠炎爆发的体外方法。更具体地，本发明提供了随时间监测粪便样本材料中两种毒素编码基因的量的比(分别为netb/cpa和cpa/netb)的方法，其能够早期指示坏死性肠炎的爆发。
背景技术：
产气荚膜梭菌(clostridiumperfringens)是一种普遍存在的病原体，它使用大量毒素在动物以及人类中引起组织毒性和肠道感染。产气荚膜梭菌(c.perfringens)是革兰氏阳性、杆状、形成孢子、耐氧的厌氧菌。并非所有产气荚膜梭菌菌株都具有毒性。根据四种可疑主要毒素(α、β、ε和ι)的产生，有毒的产气荚膜梭菌菌株传统上可分为五种毒素类型(a、b、c、d和e)。根据产生的毒素(主要和其他毒素，如netb、cpb2等)，可以在不同的宿主生物中诱导产气荚膜梭菌亚种特定的综合征/疾病[rood，ji(1998)"virulencegenesofclostridiumperfringens"；annualreviewofmicrobiology52:333-360]。毒素由位于染色体和/或毒素质粒上的多核苷酸序列编码[popoff，m.r.和p.bouvet(2013),"geneticcharacteristicsoftoxigenicclostridiaandtoxingeneevolution"toxicon75:63-89]。
作为一种动物病原体，产气荚膜梭菌是包括禽坏死性肠炎的多种严重疾病的缘由，每年从全球农业系统中消耗掉约60亿美元[wade，b.，keyburn，al(2015)，"thetruecostofnecroticenteritis"worldpoultry31,16–17]。
坏死性肠炎(ne)是一种最早于1961年被描述的家禽肠道疾病。鸡的ne表现为急性或慢性肠毒血症。急性疾病由于肠壁坏死性病变的发展而导致显著水平的死亡率，而慢性疾病导致生产力和福利的重大损失。早期关于ne的研究表明，与该疾病有关的主要毒力因子是α毒素(称为cpa或plc)，其具有磷脂酶c和鞘磷脂酶活性[keyburn，a.l.等人(2006)"alpha-toxinofclostridiumperfringensisnotanessentialvirulencefactorinnecroticenteritisinchickens",infectionandimmunity74(11):6496-6500]。所有产气荚膜梭菌菌株均携带编码α毒素的基因[rood，j.i.(1998)"virulencegenesofclostridiumperfringens",annualreviewofmicrobiology52:333-360；titball,r.w.等人(1999)"theclostridiumperfringensα-toxin."anaerobe5(2):51-64]。然而，最近的研究表明，α毒素似乎不是必需的毒力因子，因为α毒素突变株能够引起ne，这使得α毒素在疾病中的作用受到怀疑。在更近的研究中，新的成孔毒素netb被提出在这种疾病的发展中起着重要的作用[keyburn，a.l.等人(2008)"netb,anewtoxinthatisassociatedwithaviannecroticenteritiscausedbyclostridiumperfringens"plospathogens4(2)]。
已知ne会影响肉鸡、蛋鸡、火鸡和鹌鹑。临床形式最常见于两至五周大的肉鸡。通常，这也分别接近将饲料从开口饲料转换为育肥饲料的时间，以及接近从母体免疫系统到适应性免疫系统的过渡时期，因此机会性产气荚膜梭菌可以利用在肠道环境中的这一过渡时期并增殖[timbermont，l.等人(2011)"necroticenteritisinbroilers:anupdatedreviewonthepathogenesis."avianpathology40(4):341-347]。
由于并非所有产气荚膜梭菌菌株都能引起ne，因此需要进行差异分析以进一步区分引起ne的菌株。诸如pcr、aflp(扩增片段长度多态性)和/或pfge(脉冲场凝胶电泳)等分子方法可用于鉴定产气荚膜梭菌菌株。然而，这些方法在定量鉴别引起ne的产气荚膜梭菌菌株的能力上仍然受到限制。
此外，早期检测禽种群中ne爆发的方法尤为重要，因为这种早期检测可以进行早期干预，与传统的检测禽种群中ne的方法相比，可以给农民带来几天的优势。因此，迫切需要提供快速且可靠、非侵入性的屠宰前(antemortem)方法，以早期检测禽种群中坏死性肠炎爆发。
发明概述
由此，本发明的一个目的是提供用于早期检测禽种群中坏死性肠炎爆发的方法，该方法包括：
a)在连续的时间点收集源自禽种群的粪便样本材料；和
b)确定步骤a)中获得的样本材料中所包含的标志物基因netb与cpa的量的比；
其中netb与cpa的量的比随时间的逆转(“转变”)是坏死性肠炎爆发的早期指示。
本发明的额外的目的是提供用于控制禽种群中坏死性肠炎状态的体外方法，该方法包括监测在连续的时间点收集的粪便样本中所含的标志物基因netb与cpa的量的比，
其中
a)netb与cpa的量的比随时间的逆转(“转变”)表明营养或治疗干预的必要性，和/或
b)施用营养或治疗剂后，netb与cpa的量的比随时间的再逆转(“反向转变”)表明营养或治疗干预的有效性。
此外，本发明提供了适用于上述方法的多重qpcr试剂盒，该试剂盒包括针对netb的一对特异性引物和针对cpa的一对特异性引物。
在下文中，详细描述了本发明的关键方面。
发明详述
本发明人出乎意料地发现，在禽种群中坏死性肠炎的病理诊断之前，标志物基因netb与cpa的量的比(即分别为netb/cpa和cpa/netb之比)的逆转一致地发生。也就是说，标志物基因netb与cpa的量的比的所述逆转能够用作诊断标志物，以预测禽种群中坏死性肠炎的发作和/或爆发。
因此，本发明涉及用于早期检测禽种群中坏死性肠炎爆发的体外方法，该方法包括：
a)在连续的时间点收集源自禽种群的粪便样本材料；和
b)确定步骤a)中获得的样本材料中所包含的标志物基因netb与cpa的量的比；
其中netb与cpa的量的比随时间的逆转(“转变”)是坏死性肠炎爆发的早期指示。
在本发明的上下文中，术语“标志物基因”包括各个标志物基因的功能片段；即netb和cpa的功能片段。
术语“坏死性肠炎”/ne涉及临床和亚临床/潜伏性病况。因此，术语“爆发”应理解为在正常禽种群中疾病(坏死性肠炎)的突然或自发发生，以及通过单独施用产气荚膜梭菌或与诱发因素(predisposingconditions)结合施用所致的引发[shojadoost,b.,vince,a.r.,prescott,j.f.,2012.thesuccessfulexperimentalinductionofnecroticenteritisinchickensbyclostridiumperfringens:acriticalreview.vet.res.43,74；fernandesdacosta,s.p.,mot,d.,bokori-brown,m.,savva,c.g.,basak,a.k.,vanimmerseel,f.,titball,r.w.,2013.protectionagainstaviannecroticenteritisafterimmunisationwithnetbgeneticorformaldehydetoxoids.vaccine31,4003–4008；williams,r.b.,marshall,r.n.,laragione,r.m.,catchpole,j.,2003.anewmethodfortheexperimentalproductionofnecroticenteritisanditsuseforstudiesontherelationshipsbetweennecroticenteritis,coccidiosisandanticoccidialvaccinationofchickens.parasitol.res.90,19–26；wu,s.b.,rodgers,n.,choct,m.,2010.optimizednecroticenteritismodelproducingclinicalandsubclinicalinfectionofclostridiumperfringensinbroilerchickens.aviandis.54,1058–1065；wus-b,stanleyd,rodgersn,swickra,moorerj.twonecroticenteritispredisposingfactors,dietaryfishmealandeimeriainfection,inducelargechangesinthecaecalmicrobiotaofbroilerchickens.vetmicrobiol2014；169:188e97]。
本发明人发现，标志物基因netb与cpa的量的比的逆转与使用常规技术进行的坏死性肠炎的病理诊断之间的时间间隔在1天至5天之间。
作为这种逆转或转变的示例，netb/cpa比可以在一天中<1(对应于cpa/netb比>1)；而在接下来的一天中，netb/cpa比可以>1(对应于cpa/netb比<1)。
根据这些发现，前述方法可以进一步包括
c)确定标志物基因netb与cpa的量的比逆转的时间点(“转变点”)。
所述转变点可以通过例如图形分析来确定。因此，需要绘制两张图：第一张图代表netb的量与样本收集时间点的关系；而第二张图代cpa的量与样本收集时间点的关系。从这两张图的交叉点，可以读取转变点。
netb和cpa的多核苷酸序列是本领域已知的。然而，为了清楚和完整起见，netb的共有序列示于seqidno.：1，cpa的共有序列示于seqidno.2。cpa基因位于所有产气荚膜梭菌菌株(致病性和非致病性)的染色体上；而netb基因位于致病性(诱导ne的)产气荚膜梭菌菌株的毒素质粒上。
步骤a)的粪便样本材料可以是来自随机选择的个体样本的复合粪便样本。
在本发明的上下文中，术语“粪便”应理解为禽受试者的泄殖腔排便产物。粪便样本材料因此以非侵入性方式获得并通过下述采样技术收集。
理想地，从特定禽种群收集的粪便样本是在动物房内的离散的点收集的，以便获得代表整个动物种群的合并样本。
必须根据实际的饲养密度(即根据属于待测试的禽种群的动物的实际数量)确定样本量(即，待收集的粪便样本的数量；在动物房内特定的点收集的每个样本)。
可以使用下式计算样本量：
其中
n0是样本量建议
95％置信水平下的z为1.96
p是具有问题属性q的种群的估计部分，其中q为1-p，并且
e是以小数表示的置信区间。
通常，最少80至100个个体粪便样本就足以满足大多数畜禽种群。作为一个实例，对于20000只动物的肉鸡群，95％置信水平需要96个个体样本。
为了获得步骤a)中所需的合并的粪便样本材料，可以使用几种采样方法。在一个实施方案中，通过系统网格采样(系统随机采样)来获得合并的粪便样本。对于这种方法，根据所需的个体粪便样本数量(即样本量)，将动物房或饲养动物种群的区域划分为均匀单元或子区域的网格图案。然后，在第一网格单元内识别出随机样本收集点，并且在所述点收集第一样本。最后，在每个单元内使用相同的相对点，依次从相邻单元中获得其他样本(例如以蛇形、角形或锯齿形的方式)。可以使用骰子或随机数生成器获得随机起点。
对于重复样本，可以任选地重复上述过程。即，为在所有单元中待重复的单个收集点建立了新的随机位置。通过分析重复样本，可以确定原始样本提供的均值估计中的变化。
因此，上述方法可以进一步包括以下子步骤：
(a1)将动物房或饲养动物种群的区域划分为均匀单元的网格图案；
(a2)识别第一单元内的至少一个随机样本收集点，并在所述至少一个样本收集点收集一个第一样本；和
(a3)在每个单元内使用相同的相对样本收集点，依次收集其余单元内的个体粪便样本；
以及任选地
(a4)对至少一个重复样本重复步骤(a2)和(a3)。
如果每个单元待获取一个样本，则样本量对应于网格图案中的单元数。通常，如果每个单元待获取x个样本，则样本量除以x是单元数。
系统网格采样方法可以在野外轻松实现。由此，可以避免子区域的代表性过多或不足。图1和图2示出了根据本发明的系统网格采样图案。
另一种采样方法是分层随机采样(即网格内的随机采样)。这里，样本是从相邻的网格单元中依次获得的，但是样本在每个单元内的位置是随机的。
可替代地，可以通过简单的随机采样来获取样本，其中，样本是从动物饲养区域的随机位置(没有网格)获取的。对于这种方法，必须使用确定随机样本位置的正式方法，例如基于随机数生成器。
可以用刮刀(spatula)或类似装置手动收集样本，然后立即将其转移到样本收集容器或管中。
在替代实施方案中，可以在沿着动物房走动的同时使用套鞋法，使用将会产生动物房的所有部分或各个扇区的代表性样本的路线，获得合并的粪便样本。这样的路线可以例如是形状均匀的蛇形或弯曲的线、角线或锯齿形线。具有充分吸收性以吸收水分的靴子拭子特别适合。但是，管型纱布袜子也是可以接受的。
用于收集的个体样本的合适的样本质量为例如0.1至20g，特别是0.2至10g，优选0.5至5g。可以用刮刀、小抓具(littergrab)或类似装置手动收集样本。
完成样本收集后，必须将样本材料均质化。本领域技术人员知晓合适的、常用的均质化技术。由此获得的合并的样本可以被稀释和/或稳定化。在此上下文中，样本稳定化是指保护样本中包含的核酸材料免受溶液中核酸酶的破坏，例如通过使用包含核酸酶抑制剂的缓冲溶液。
样本材料应在连续的时间点收集。粪便样本材料可以每周、每天或每小时收集和分析。例如，从出生到被屠宰，每天都可以收集并分析粪便测试样本。
禽种群优选是禽群。根据本发明的禽群优选是家禽。根据本发明的优选的家禽是鸡、火鸡、鸭和鹅。可以对家禽进行优化以生产幼畜。这种类型的家禽也称为亲本动物和祖代亲本动物。因此，优选的亲本动物和祖代亲本动物是(祖代)亲本肉鸡、(祖)亲本鸭、(祖代)亲本火鸡和(祖代)亲本鹅。
根据本发明的家禽还可以选自观赏家禽和野禽。优选的观赏家禽或野禽是孔雀、野鸡、鹧鸪、珍珠鸡、鹌鹑、松鸡、鹅、鸽子和天鹅。根据本发明的进一步优选的家禽是鸵鸟和鹦鹉。根据本发明的最优选的家禽是肉鸡。
对于肉鸡群，可在初始生长期(开口期，第5天至第10天)和/或增强生长期(第11天至第18天)每天收集和分析粪便样本，并任选地，也在稍后的阶段收集和分析。
在一个实施方案中，从第10天开始每天收集并分析粪便样本材料，特别是来自肉鸡群的粪便样本材料。
可以在定量之前从粪便样本中分离标志物基因netb和cpa。多核苷酸分离可以通过例如使用十六烷基三甲基溴化铵(ctab)方法进行提取或通过各种商业核酸提取试剂盒进行，其中通过化学裂解和/或通过机械细胞破碎来实现细胞裂解，并且将核酸捕获在二氧化硅基质上或覆有二氧化硅的磁珠上。专门针对粪便或刺激性物质(harshmaterial)的商业提取试剂盒特别适合。
可以通过众所周知的方法，例如测序、杂交或本领域已知的各种pcr技术来检测和/或定量标志物基因。
在替代的实施方案中，可以直接定量动物样本中包含的标志物基因，例如通过pcr、qpcr、测序或杂交技术。
在一个特定的实施方案中，通过qpcr确定在步骤a)中获得的样本材料中包含的标志物基因netb与cpa的量或这些标志物基因的同源物或功能片段的量的比。
在以上特定的发明方法中，一种或多种选自下述的寡核苷酸可用作pcr引物和/或pcr探针：
a)与seqidno.:3所示的多核苷酸具有至少80％，优选至少85、90或95％，最优选100％的序列同一性的寡核苷酸；
b)与seqidno.:4所示的多核苷酸具有至少80％，优选至少85、90或95％，最优选100％的序列同一性的寡核苷酸；
c)与seqidno.:5所示的多核苷酸具有至少80％，优选至少85、90或95％，最优选100％的序列同一性的寡核苷酸；
d)与seqidno.:6所示的多核苷酸具有至少80％，优选至少85、90或95％，最优选100％的序列同一性的寡核苷酸；
e)与seqidno.:7所示的多核苷酸具有至少80％，优选至少85、90或95％，最优选100％的序列同一性的寡核苷酸；
f)与seqidno.:8所示的多核苷酸具有至少80％，优选至少85、90或95％，最优选100％的序列同一性的寡核苷酸；
g)与根据(a)至(f)的寡核苷酸互补的寡核苷酸；
h)寡核苷酸，其包含根据(a)至(g)中任一项的寡核苷酸，并且与根据(a)至(g)的寡核苷酸相比被延长不超过5个碱基对；
其中，如seqidno.：3所示的多核苷酸是用于检测netb的pcr引物(正向)。如seqidno.：4所示的多核苷酸是用于检测netb的pcr引物(反向)。如seqidno.：5所示的多核苷酸是用于检测netb的pcr探针。
此外，如seqidno.：6所示的多核苷酸是用于检测cpa的pcr引物(正向)。如seqidno.：7所示的多核苷酸是用于检测cpa的pcr引物(反向)。如seqidno.：8所示的多核苷酸是用于检测cpa的pcr探针。
根据以上所述，本发明进一步涉及选自下述的寡核苷酸的用途，用于早期检测禽种群中坏死性肠炎爆发：
a)与seqidno.:3所示的多核苷酸具有至少80％，优选至少85、90或95％，最优选100％的序列同一性的寡核苷酸；
b)与seqidno.:4所示的多核苷酸具有至少80％，优选至少85、90或95％，最优选100％的序列同一性的寡核苷酸；
c)与seqidno.:5所示的多核苷酸具有至少80％，优选至少85、90或95％，最优选100％的序列同一性的寡核苷酸；
d)与seqidno.:6所示的多核苷酸具有至少80％，优选至少85、90或95％，最优选100％的序列同一性的寡核苷酸；
e)与seqidno.:7所示的多核苷酸具有至少80％，优选至少85、90或95％，最优选100％的序列同一性的寡核苷酸；
f)与seqidno.:8所示的多核苷酸具有至少80％，优选至少85、90或95％，最优选100％的序列同一性的寡核苷酸；
g)与根据(a)至(f)的寡核苷酸互补的寡核苷酸；
h)寡核苷酸，其包含根据(a)至(g)中任一项的寡核苷酸，并且与根据(a)至(g)的寡核苷酸相比被延长不超过5个碱基对；
本发明提供了上述用于早期检测坏死性肠炎爆发的非侵入性方法，其可以在屠宰前进行。这使农民能够在早期阶段采取措施来预防坏死性肠炎的爆发。
因此，本发明还涉及前述任何一种方法在确定营养或治疗干预的必要性中的用途。
此类干预或措施包括饲喂或施用促进健康的物质，例如畜牧学饲料添加剂或治疗剂。术语“施用”或相关术语包括口服施用。口服施用可以通过饮用水、口服管饲、气雾喷雾或动物饲料进行。术语“畜牧学饲料添加剂”是指用于有利地影响健康状况下动物的性能或有用于有利地影响环境的任何添加剂。畜牧学饲料添加剂的实例是消化率增强剂，即当饲喂动物时可通过作用于目标饲料原料而增加饲料消化率的物质；肠道菌群稳定剂；微生物或其他化学定义的物质(当饲喂动物时，会对肠道菌群产生积极影响)；或有利地影响环境的物质。优选地，促进健康的物质选自益生菌剂、益生元剂、植物性药物、有机/脂肪酸、噬菌体和溶菌酶或其任意组合。
此外，本发明人已经发现netb与cpa的量的比随时间的再逆转(“反向转变”)指示禽种群中坏死性肠炎的消退或消失。所述消退或消失可以自然发生(作为自发恢复)或可以由治疗或营养干预引起。
因此，本发明提供了用于控制禽种群中坏死性肠炎状态的体外方法，该方法包括监测在连续的时间点收集的粪便样本中所含的标志物基因netb与cpa的量的比，
其中
a)netb与cpa的量的比随时间的逆转(“转变”)表明营养或治疗干预的必要性，并且
b)施用营养或治疗剂后，netb与cpa的量的比随时间的再逆转(“反向转变”)表明营养或治疗干预的有效性。
可以如上文针对转变点所述以图形方式确定再逆转的时间点(“反向转变点”)。
术语“控制坏死性肠炎状态”应理解为分别确定是否存在坏死性肠炎爆发或坏死性肠炎消退/消失的指示。
合适的样本材料和用于该方法的样本收集方法如上所述。
营养或治疗干预可涉及施用选自下述的物质：益生菌剂、益生元剂、植物性药物、有机/脂肪酸、噬菌体和溶菌酶或其任意组合。益生菌剂是特别优选的。
因此，本发明还涉及用于治疗坏死性肠炎的益生菌剂，其中坏死性肠炎的爆发是通过前述任何一种方法来检测的。
作为上述控制禽种群中坏死性肠炎状态的方法的示例，坏死性肠炎是根据netb与cpa的量的比随时间的逆转而诊断的；例如netb/cpa的比从值<1变为值>1。诊断后，农民立即进行干预，例如通过施用益生菌剂。在连续的时间点收集的粪便样本中所含的netb与cpa的量的比进一步受到监测。在干预有效的情况下，netb与cpa的比会再次逆转，例如netb/cpa比从值>1变为值<1。
在用于控制禽种群中坏死性肠炎状态的上述方法的一个实施方案中，一种或多种选自下述的寡核苷酸用作pcr引物和/或pcr探针：
a)与seqidno：3所示的多核苷酸具有至少80％，优选至少85、90或95％，最优选100％的序列同一性的寡核苷酸；
b)与seqidno：4所示的多核苷酸具有至少80％，优选至少85、90或95％，最优选100％的序列同一性的寡核苷酸；
c)与seqidno：5所示的多核苷酸具有至少80％，优选至少85、90或95％，最优选100％的序列同一性的寡核苷酸；
d)与seqidno：6所示的多核苷酸具有至少80％，优选至少85、90或95％，最优选100％的序列同一性的寡核苷酸；
e)与seqidno：7所示的多核苷酸具有至少80％，优选至少85、90或95％，最优选100％的序列同一性的寡核苷酸；
f)与seqidno：8所示的多核苷酸具有至少80％，优选至少85、90或95％，最优选100％的序列同一性的寡核苷酸；
g)与根据(a)至(f)的寡核苷酸互补的寡核苷酸；
h)寡核苷酸，其包含根据(a)至(g)中任一项的寡核苷酸，并且与根据(a)至(g)的寡核苷酸相比被延长不超过5个碱基对；
根据以上所述，本发明进一步涉及选自下述的寡核苷酸的用途，用于确定营养或治疗干预的有效性：
a)与seqidno：3所示的多核苷酸具有至少80％，优选至少85、90或95％，最优选100％的序列同一性的寡核苷酸；
b)与seqidno：4所示的多核苷酸具有至少80％，优选至少85、90或95％，最优选100％的序列同一性的寡核苷酸；
c)与seqidno：5所示的多核苷酸具有至少80％，优选至少85、90或95％，最优选100％的序列同一性的寡核苷酸；
d)与seqidno：6所示的多核苷酸具有至少80％，优选至少85、90或95％，最优选100％的序列同一性的寡核苷酸；
e)与seqidno：7所示的多核苷酸具有至少80％，优选至少85、90或95％，最优选100％的序列同一性的寡核苷酸；
f)与seqidno：8所示的多核苷酸具有至少80％，优选至少85、90或95％，最优选100％的序列同一性的寡核苷酸；
g)与根据(a)至(f)的寡核苷酸互补的寡核苷酸；
h)寡核苷酸，其包含根据(a)至(g)中任一项的寡核苷酸，并且与根据(a)至(g)的寡核苷酸相比被延长不超过5个碱基对；
本发明进一步提供了诊断多重qpcr试剂盒，其用于分别确定netb与cpa的量的比，以及监测netb与cpa的量的比随时间的变化。
所述试剂盒包括用于检测netb的引物对和用于检测cpa的引物对，
其中netb的引物对包括：
与seqidno.：3所示的多核苷酸具有至少80％，优选至少85、90或95％，最优选100％的序列同一性的寡核苷酸，和
与seqidno.：4所示的多核苷酸具有至少80％，优选至少85、90或95％，最优选100％的序列同一性的寡核苷酸；
并且cpa的引物对包括：
与seqidno.：6所示的多核苷酸具有至少80％，优选至少85、90或95％，最优选100％的序列同一性的寡核苷酸，和
与seqidno.：7所示的多核苷酸具有至少80％，优选至少85、90或95％，最优选100％的序列同一性的寡核苷酸。
任选地，根据本发明的多重qpcr试剂盒可以另外包含一种或多种用于检测netb的探针和/或一种或多种用于检测cpa的探针。
在一个实施方案中，多重qpcr试剂盒除上述针对netb和cpa的引物对外，还包括用于检测netb的探针和用于检测cpa的探针，
其中用于检测netb的探针包括：
与seqidno.：5所示的多核苷酸具有至少80％，优选至少85、90或95％，最优选100％的序列同一性的寡核苷酸；
并且用于检测cpa的探针包括：
与seqidno.：8所示的多核苷酸具有至少80％，优选至少85、90或95％，最优选100％的序列同一性的寡核苷酸。
所述试剂盒可进一步包含缓冲溶液，例如pcr缓冲液；镁盐；脱氧核苷酸三磷酸(dntp)。该试剂盒还可包括元件，例如样本收集管、分离核酸的试剂和/或其使用说明。
根据本发明的方法的应用是例如((i)帮助禽坏死性肠炎的诊断和/或预后，(ii)监测禽坏死性肠炎的进展或复发(iii)帮助评价对于正在接受或正在考虑进行治疗的动物种群的治疗功效，或(iv)控制针对产气荚膜梭菌引起的禽坏死性肠炎的(治疗性)疫苗接种效率。
根据本发明的方法的应用特别有助于避免动物性能(例如体重增加和饲料转化)的损失。
下文通过非限制性实施例和示例性实施方案来举例说明本发明。
实施例
根据美国人道协会认证的计划(该计划将屠宰时的密度限制在6.2磅/平方英尺，包括严格的管理和审核需求)，将大约20,000只肉鸡随机分配到作为公司的正常鸡只放置程序的一部分的肉鸡舍中。所有鸡群均按照公司的标准规程进行管理，所述规程符合饲养员对光照、温度和通风的建议。饲料由基础饲料(玉米和大豆)组成，并根据鸡对开口饲料、育肥饲料和后期饲料的需求进行了调整。每天监测鸡群的一般状况：饲料和水的可获性、温度控制以及任何异常状况。将死鸡移出并进行尸检以确定死亡原因，并扑杀衰弱的鸡以避免进一步的痛苦。
样本收集
持续2年从第10/11至24/25天每天收集来自几种标准肉鸡现场生产过程的粪便样本和鸡群性能数据。在此期间，通过在坏死性肠炎疾病窗口期的死亡率飙升和兽医对死禽尸检观察到的肠道内的坏死性肠炎典型病变，将三个鸡群(实施例1、2和3)诊断为坏死性肠炎阳性鸡群(爆发鸡群)。将从坏死性肠炎爆发鸡群收集的所有粪便样本按照evonik专有的样本处理和qpcr工作流程的说明分别处理。
在每个收集时间点或事件中，用塑料钳从鸡舍的每个象限中收集24个个体样本，以锯齿形的方式行走每个象限。为了避免样本的交叉污染，每个鸡舍都使用了新的无菌钳，并观察到规定的生物安全措施。此外，在将来自4个象限的所有样本复合以在无菌样本收集袋中形成一个合并样本(由96个个体粪便样本组成)之前，从样本中去除诸如刨花、垃圾等碎屑。将样本置于冰上并转移至实验室于-80℃下保存。
dna提取
将装有合并的96个样本的每个袋子在室温下缓慢融化；然后，将粪便转移到无菌容器中，并用无菌压舌器充分混合。将五(5)克均质化的样本转移到一个专有样本收集管中，其中装有20ml的稳定缓冲液和玻璃珠。样本收集管中的粪便样本在+15℃至+30℃的温度下最多可稳定7天。
将装有粪便样本的试管在水浴中于70℃孵育20分钟。然后将试管转移至polymixmill(珠磨器)中，以20hz均质化15分钟。均质化结束时，将样本以2000g离心5分钟，然后将500μl上清液用于dna提取。dna提取是根据evonik专有粪便提取试剂盒的操作规程，使用kingfisherflex系统(thermofisher，美国)进行的。
kingfisher仪器是通过上传定义提取过程各个步骤的预定义程序(“cper_extraction_01”)而准备的；如下所述制备取样吸头、dna洗脱板、洗涤板和样本板。
将96吸头的梳子插入空的深孔板中，并将其放入仪器中。随后在洗脱板上引入100μl洗脱缓冲液，并将此板也放入仪器中。此外，将500μl洗涤缓冲液3、2和1分别置于3个不同洗涤板的每个孔中，并将这些板以相同顺序放在仪器上。最后，将300μl裂解缓冲液、25μl磁珠、20μl增强剂、10μl内对照和500μl粪便样本上清液添加到样本板的每个孔中。将样本板放在仪器上后，按开始按钮开始提取。
dna定量
为了定量dna中的标志物，根据evoniknutrition&caregmbh专有实时pcr检测试剂盒的说明制备了由5μlmastera、15μlmasterb和1μlic(内对照)组成的20μl反应混合物。准备足够的反应混合物，以适应所有样本、非模板对照(ntc)和4个标准品(s1至s4)一式两份的运行。将20μl的反应混合物分配到96孔板的各个孔中。然后，将10μl提取的dna样本转移到每个孔中。相应地将10μl的各标准品和1μl的ic转移到每个标准孔中。为了制备ntc，将10μl无菌无核酸酶水和1μlic各自转移到ntc孔中。用多通道移液器将板的内容物充分混合，并用clearweldsealmarkii箔膜密封板。将板以1000g(约3000rpm)离心30秒。最后，将板在cfx96实时pcr仪(biorad，德国)上以下列pcr条件运行：在95℃下变性15秒，在58℃下退火45秒，在72℃延伸15秒，45个循环。在qpcr运行的扩增阶段获取数据。运行结束时，将从bioradcfx96接收的数据用bioradcfxmanager3.1进行预处理，然后导出到excel2013以进行进一步分析。由标准曲线确定样本中标志物的定量，其中由包含相等浓度的两个靶标的标准溶液(s1至s4)建立得到该标准曲线。s1、s2、s3和s4中的netb和cpa浓度分别为104个拷贝/μl、103个拷贝/μl、102个拷贝/μl和101个拷贝/μl。标准品的对数沿x轴绘制，而ct(循环阈值)沿y轴绘制。所得的线性回归线[y＝mx+b或ct＝m(对数数量)+b]用于确定所测试的样本中靶标的浓度。
用于定量靶标表达水平的qpcr的引物和探针列表：
实施例1
在此实施例中，netb与cpa的量的比的逆转(转变点)在第14天至第15天之间发生。坏死性肠炎的爆发通过兽医诊断(尸检)在第16天确定。
实施例1的数据的图形表示可在图3中找到。
实施例2：
在此实施例中，netb与cpa的量的比的逆转(转变点)在第14天至第15天之间发生。坏死性肠炎的爆发通过兽医诊断(尸检)在第16天确定。
实施例1的数据的图形表示可在图4中找到。
实施例3：
在此实施例中，netb与cpa的量的比的逆转(转变点)在第14天至第17天之间发生。坏死性肠炎的爆发通过兽医诊断(尸检)在第17天确定。
实施例1的数据的图形表示可在图5中找到。
总结：
上述实验表明，标志物基因netb和cpa的相对量的逆转在对禽种群进行坏死性肠炎的病理诊断之前一致地发生。因此，所述标志物基因netb和cpa的相对量的逆转有资格作为预测禽种群近期坏死性肠炎爆发的诊断标志物。
序列表
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<120>早期检测禽种群中坏死性肠炎爆发的方法
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