一组来源于植物的胞嘧啶脱氨酶和其在碱基编辑系统中的应用的制作方法

[0001]
本发明属于基因的应用技术领域，具体涉及在生物技术领域中，在碱基编辑系统中用来源于植物的胞嘧啶脱氨酶替代非植物源的胞嘧啶脱氨酶，对植物进行的基因编辑的应用。
[0002]


背景技术：

[0003]
基因编辑技术作为近年来飞速发展的生物技术之一，被广泛用于动物，植物和微生物中，针对该技术原理的探索或者应用的扩展也在积极的开展中。基因编辑技术就是通过对细胞基因组中目的基因的一段核苷酸序列甚至是单个核苷酸进行替换，切除，增加或者是插入外源的dna序列，使之产生可遗传的改变。[1]
-ꢀ
[3] 虽然各种基因编辑技术的原理及作用方式并不相同，但它们的共同之处是基因编辑都建立在使目标基因dna产生双链断裂（double strand breaking，dsb）的基础上。因为dna分子单链断裂或缺失后容易被细胞内的各种修复机制所修复而不产生任何改变 [4] ，但dna双链断裂的结果则有很大的不同。细胞内dna双链断裂的修复有两种方式，即同源重组修复(homologous recombination, hr)和非同源末端链接修复(non-homologous end join, nhej) 。[5]
ꢀ-
[7]对于这两种修复方式，同源重组的效率很低，而非同源末端链接修复会造成基因的功能的缺失或者影响基因的正常功能。与此同时，人类的遗传疾病或者植物的一些缺陷是由碱基突变引起的，所以开发出精确的编辑工具对碱基突变的修复有着重要的应用价值。从2016年到2017年，哈佛大学的david r liu研究团队主要开发了两种碱基基因编辑工具（be系统）。第一种工具可以将c-g碱基对转变成t-a碱基对，第一代的单碱基编辑工具在发表的文章中称为be1（cytidine base editing），之后在提高编辑效率，扩大be可以编辑的基因组位点方面又有持续的研究发展，be的后续版本分别称为be1，be2和be3；第二种工具可以将a-t碱基对转变成为g-c碱基对，称为abe（adenine base editing）。
[0004]
be系统实现c->t碱基替换的原理是通过胞嘧啶脱氨酶可以直接实现对单个胞嘧啶（cytosine，c）碱基的编辑，突变为胸腺嘧啶（thymine，t），其中尿嘧啶糖苷酶抑制剂（uracil dna glycosylase inhibitor, ugi）可以提高突变效率。具体的替换过程为是grna引导cas9与胞嘧啶脱氨酶的融合蛋白结合在目标dna上，产生单链断裂，胞嘧啶脱氨酶会将靶点上的c脱氨变成u，尿嘧啶糖苷酶抑制剂（uracil dna glycosylase inhibitor, ugi）能够抑制尿嘧啶dna糖苷酶（uracil dna glycosylase, udg）清除dna中的u，之后u：g配对将其更多的修复为u：a，通过dna的复制，u：a实现t：a配对，从而实现c到t的精确替换。在此过程中胞嘧啶脱氨酶是实现碱基替换的关键，在david liu开发的各个be版本中，胞嘧啶脱氨酶始终用的是来源于小鼠的胞嘧啶脱氨酶（rapobec1），其他的研究人员也在持续优化改良碱基基因编辑工具，而后期陆续发现的也可用在碱基编辑工具中的胞嘧啶脱氨酶有pmcda1/apobec3a等，但是它们都来源于动物或者微生物。[8] [9] 至今尚未发现一个来源
于植物的胞嘧啶脱氨酶可以成功的用于碱基基因编辑。
[0005]
在对植物进行基因编辑的研发过程中，寻找一个从植物来源并可以用于碱基基因编辑的胞嘧啶脱氨酶基因就尤为重要。关于植物中的胞嘧啶脱氨酶的研究有很多，但是从未有研究植物来源的胞嘧啶脱氨酶在基因编辑技术中的应用，国内外也未有任何关于植物来源的胞嘧啶脱氨酶在基因编辑技术中应用的报导。而在对胞嘧啶脱氨酶（apobec）家族中的研究发现，apobec家族中的每个蛋白的功能十分的多样化，虽然可能在蛋白质结构上可以将这些蛋白归于一类，但是对于每种apobec蛋白来说，其功能和组织特异性表达都有着很大的差异。 [10] [11] 本发明的意义在于找到了来自于植物源的胞嘧啶脱氨酶，并且在碱基基因编辑的系统中对水稻成功的实现了碱基c到t的替换。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的在于提供一个或者多个可用于碱基基因编辑的来源于植物的胞嘧啶脱氨酶的基因序列。在碱基编辑过程中，使用上述序列之一，可以对目标核苷酸的碱基进行编辑，使其发生c到t的替换。
[0007]
本发明的一个目的在于提供与基因序列表序列1到序列46中的任一的基因的不低于90%的基因相似性的基因，其来源于植物，包括但不限于拟南芥，水稻，大豆，玉米，木薯，亚麻，大叶杨，苜蓿，菜豆，苹果，棉花，高粱，花生，马铃薯，黄瓜，番茄等等。在碱基编辑过程中，使用上述序列之一，可以对目标核苷酸的碱基进行编辑，使其发生c到t的替换。
[0008]
本发明的另一个目的在于提供一个或者多个的基因序列，上述基因序列选自基因序列表中序列1到序列46, 上述基因都来自于植物，其来源分别为拟南芥，水稻，大豆，玉米，木薯，亚麻，大叶杨，苜蓿，菜豆，苹果，棉花，高粱，花生，马铃薯，黄瓜，番茄。在碱基编辑过程中，使用上述序列之一，可以对目标核苷酸的碱基进行编辑，使其发生c到t的替换。
[0009]
本发明的另一个目的在于提供一种可用于植物的碱基基因编辑的方法，具体可为方法g1，采用该方法，在不引入非植物源的胞嘧啶脱氨酶的情况下，可以对目标核苷酸的碱基进行编辑，使其发生c到t的转变。具体的步骤包括：在受体中表达sgrna，cas9蛋白和植物来源的胞嘧啶脱氨酶，从而所述受体基因中的目标核苷酸的碱基进行编辑，发生从c到t的替换。
[0010]
本发明的另一个目的在于提供一种用于植物的碱基基因编辑的方法，具体可为方法g2，采用该方法，在不引入非植物源的胞嘧啶脱氨酶的情况下，可以对目标核苷酸的碱基进行编辑，使其发生c到t的转变。具体的步骤包括：在受体中表达sgrna，cas9蛋白，植物来源的胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶糖苷酶抑制剂，从而所述受体基因中的目标核苷酸的碱基进行编辑，发生从c到t的替换。
[0011]
所述方法g1中，“在受体中表达sgrna，cas9蛋白和植物来源的胞嘧啶脱氨酶”可通过将所述sgrna的编码基因，cas9蛋白的编码基因和所述的植物来源的胞嘧啶脱氨酶的编码基因导入受体实现。具体的，可以放在一个载体中导入受体，也可以放在不同载体中分别导入受体。
[0012]
所述方法g2中，“在受体中表达sgrna，cas9蛋白，植物来源的胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶糖苷酶抑制剂”可通过将所述sgrna的编码基因，cas9蛋白的编码基因，所述的植物来源的胞嘧啶脱氨酶的编码基因和尿嘧啶糖苷酶抑制剂的编码基因导入受体实现。具体的，可
以放在一个载体中导入受体，也可以放在不同载体中分别导入受体。
[0013]
上述任一所述的方法中，还可在受体中表达抗潮霉素蛋白（用于筛选）。所述“在受体中表达抗潮霉素蛋白”可通过将所述抗潮霉素蛋白的编码基因导入受体实现。具体的，可以跟上述元件放在一个载体中导入受体，也可以放在不同的载体中分别导入受体。
[0014]
上述任一所述的方法中，所述受体可为n1)或n2)或n3)或n4)：n1)植物；n2)单子叶植物或双子叶植物；n3)禾本科植物；n4)水稻。
[0015]
上述任一所述的方法中，所述受体可为植物愈伤组织。
[0016]
上述任一所述的方法中，“导入受体”可经过侵染，共培养，筛选等步骤，得到编辑后的植物愈伤组织。
[0017]
上述任一所述的方法中，所述sgrna可根据受体基因组中预期进行碱基编辑的靶基因设计。
[0018]
上述任一所述的方法中，所述cas9蛋白可为spcas9n蛋白。spcas9n蛋白的氨基酸序列可如序列表中基因序列47 自5
’
末端起第3061至7161位所示的核苷酸序列翻译而成。编码所述的spcas9n蛋白的核苷酸序列可如序列表中基因序列47自5
’
末端起第3061至7161位所示。
[0019]
上述任一所述的方法中，所述尿嘧啶糖苷酶抑制剂的氨基酸序列可如序列表中基因序列47自5
’
末端起第2743至2991位所示的核苷酸序列翻译而成。编码所述的尿嘧啶糖苷酶抑制剂的核苷酸序列可如序列表中基因序列47自5
’
末端起第2743至2991位所示。
[0020][0021]
上述任一所述的方法中，所述抗潮霉素蛋白可为潮霉素磷酸转移酶。潮霉素磷酸转移酶的氨基酸序列可由序列表中基因序列47自5
’
末端起第318至1343位所示的核苷酸序列翻译而成。编码所述的潮霉素磷酸转移酶的核苷酸序列可如序列表中基因序列47自5
’
末端起第318至1343位所示。
[0022]
上述任一所述的方法中，所述植物来源的胞嘧啶脱氨酶可为基因序列表中序列1 到序列46的任一基因或者与基因序列表中序列1 到序列46的任一基因有至少90%的相似性的基因。
[0023]
上述任一所述的方法中，所述植物来源的胞嘧啶脱氨酶可来源于拟南芥，其氨基酸序列可为基因序列表中序列1的所示。编码所述的来源于拟南芥的胞嘧啶脱氨酶的核苷酸序列可如序列表中序列47第7216至8115位所示。
[0024]
上述任一所述的方法中，所述植物来源的胞嘧啶脱氨酶可来源于水稻，其氨基酸序列可为基因序列表中序列2的所示。编码所述的来源于水稻的胞嘧啶脱氨酶的核苷酸序列可如序列表中序列 48 第7216至8148 位所示。
[0025]
本发明的另一个目的在于提供一个可用于植物的碱基编辑载体，其特征在于：包括基因序列表中序列1 到序列46的任一基因或者与基因序列表中序列1 到序列46的任一基因有至少90%的相似性的基因序列的编码基因的重组载体。
[0026]
本发明的另一个目的在于提供一个用于植物的碱基编辑载体，其特征在于：包括sgrna的编码基因, cas9蛋白的编码基因，和基因序列表中序列1 到序列46的任一基因或者与基因序列表中序列1 到序列46的任一基因有至少90%的相似性的基因序列的编码基因的重组载体。
[0027]
本发明的另一个目的在于提供一个可用于植物的碱基编辑载体，其特征在于：包括sgrna的编码基因, cas9蛋白的编码基因，基因序列表中序列1 到序列46的任一或者与基因序列表中序列1 到序列46的任一基因有至少90%的相似性的基因序列的编码基因和尿嘧啶糖苷酶抑制剂的编码基因的重组载体。
[0028]
本发明的另一个目的在于提供任一上述胞嘧啶脱氨酶基因在x1）或x2）或x3）或x4）中的碱基基因编辑的应用: x1)植物；x2)单子叶植物或双子叶植物；x3)禾本科植物；x4)水稻。
[0029]
在本发明的一个实施例中，本发明的发明人构建了载体ncas9&atcda1&ugi。该载体中的靶基因名称，对应的靶点名称和靶点序列如表1所示。该载体的核苷酸序列如序列表中序列47所示。上述序列中，第93至277位为polya终止子的核苷酸序列，第318至1343位为潮霉素磷酸转移酶的核苷酸序列，第1378至2157位为35s启动子的核苷酸序列，第2452至2706位为nos终止子的核苷酸序列，第2743至2991位为ugi的核苷酸序列，第3061至7161 位为spcas9n的核苷酸序列(不含有终止密码子)，第7216至8115 位为atcda1的核苷酸序列(不含有终止密码子)，第8140至10111位为玉米ubiquitin启动子的核苷酸序列，第10138至10220位为sgrna骨架的核苷酸序列，第10221至10240位为靶点als4的核苷酸序列，第10241至10623位为osu3启动子的核苷酸序列。将该载体导入农杆菌eha105，得到重组农杆菌，之后制备农杆菌侵染液，将制备好的水稻愈伤浸泡置于农杆菌侵染液中，经过暗培养，恢复培养，再生培养，最后得到水稻e0苗，经过筛选，成功得到编辑后的水稻阳性e0苗。
[0030]
在本发明的一个实施例中，本发明的发明人构建了载体ncas9&osapobec1&ugi。该载体中的靶基因名称，对应的靶点名称和靶点序列如表1所示。该载体的核苷酸序列如序列表中序列48所示。上述序列中，第93至277位为polya终止子的核苷酸序列，第318至1343位为潮霉素的核苷酸序列，第1378至2157位为35s启动子的核苷酸序列，第2452至2706位为nos终止子的核苷酸序列，第2743至2991位为ugi的核苷酸序列，第3061至7161 位为spcas9n的核苷酸序列(不含有终止密码子)，第7216至8148 位为osapobec的核苷酸序列(不含有终止密码子)，第8173至10144位为玉米ubiquitin启动子的核苷酸序列，第10171至10253位为sgrna骨架的核苷酸序列，第10254至10273位为靶点als4的核苷酸序列，第10274至10656位为osu3启动子的核苷酸序列。将该载体导入农杆菌eha105，得到重组农杆菌，之后制备农杆菌侵染液，将制备好的水稻愈伤浸泡置于农杆菌侵染液中，经过暗培养，恢复培养，再生培养，最后得到水稻e0苗，经过筛选，成功得到编辑后的水稻阳性e0苗。
[0031]
上述实施例中，使用植物来源的胞嘧啶脱氨酶成功的完成了碱基编辑，证明植物来源的胞嘧啶脱氨酶确实可以代替非植物源的胞嘧啶脱氨酶在碱基编辑中的应用，本发明具有重要的应用价值。
[0033]
表一为具体实验中所涉及的靶基因名称，对应的靶点名称和靶点序列。
[0034]
表二为实验1&2的基因编辑结果的总结表。
[0035]
具体实施方式
[0036]
以下的实施例只是便于更好地理解本发明，但并不会限定本发明。
[0037]
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述。下述实施例中的实验方
法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列第1位均为5
’
端核苷酸，末位均为3
’
端核苷酸。
[0038]
引物对由引物f026：5
’-ꢀ
ggtcatcaccaaccacctcttc
ꢀ-
3
’
和引物r026：5
’
ccaccaccgacatagagaatcg
ꢀ-
3
’
组成，用于扩增靶点als4。
[0039]
以下实施例中，c到t的碱基替换是指靶点序列中第6位到第10位的c突变为t。
[0040]
c->t碱基替换效率＝发生c->t碱基替换的阳性抗性e0苗数/分析的总阳性抗性e0苗数
×
100％。
[0041]
水稻南梗46：公众可以从中国农科院水稻所获得。
[0042]
共培培养基：含有2mg/l 2,4-二氯苯氧乙酸的nb固体培养基。
[0043]
恢复培养基：含有200mg/l特美汀的nb固体培养基。潮霉素筛选培养基：含有30-50mg/l潮霉素的nb固体培养基。
[0044]
氯磺隆筛选培养基：含有0.5-20mg/l氯磺隆的nb固体培养基。
[0045]
分化培养基：含有0.5g/l谷氨酰胺、0.5g/l脯氨酸、2mg/l卡那霉素和0.2mg/lα-萘乙酸的nb固体培养基。
[0046]
生根培养基：含有0.5g/l谷氨酰胺、0.5g/l脯氨酸、0.2mg/lα-萘乙酸的ms固体培养基。
[0047]
下列实施例选择表1中所示的靶点名称进行实验，靶点序列见表1中第3列，对应的靶基因名称见表1中第1列。
[0048]
表1：靶基因名称靶点名称靶点序列alsals4caggtcccccgccgcatgat实施例1：用来源于拟南芥的胞嘧啶脱氨酶在水稻中进行碱基基因编辑。
[0049]
1.1．基因编辑载体的构建本发明的发明人构建了载体ncas9&atcda1&ugi。其中atcda1是来源于拟南芥的胞嘧啶脱氨酶，其氨基酸序列为序列表中的序列1 所示。
[0050]
本例子使用的载体ncas9&atcda1&ugi为环状质粒，其核苷酸序列如序列表中序列47所示。上述序列中，第93至277位为polya终止子的核苷酸序列，第318至1343位为潮霉素磷酸转移酶的核苷酸序列，第1378至2157位为35s启动子的核苷酸序列，第2452至2706位为nos终止子的核苷酸序列，第2743至2991位为ugi的核苷酸序列，第3061至7161 位为spcas9n的核苷酸序列(不含有终止密码子)，第7216至8115 位为atcda1的核苷酸序列(不含有终止密码子)，第8140至10111位为玉米ubiquitin启动子的核苷酸序列，第10138至10220位为sgrna骨架的核苷酸序列，第10221至10240位为靶点als4的核苷酸序列，第10241至10623位为osu3启动子的核苷酸序列。
[0051]
1.2 在水稻愈伤中进行基因编辑1、将载体ncas9&atcda1&ugi导入农杆菌eha105，得到重组农杆菌。
[0052]
2、在转化实验之前1-5天，在含50mg/l 卡那霉素+15mg/l 利富平的yeb固体培养基上接种重组农杆菌，用3m 胶带封皿；28 ℃，倒置，暗培养 1-5天。
[0053]
3、用接菌环刮取“ｚ”字形尾部的菌体，温和悬于100μm 含2mg/l 2,4-二氯苯氧乙
酸的nb液体培养基中，使菌液浓度达到od
600
=0.1，制成农杆菌侵染液备用。
[0054]
4、将稻谷去掉种皮后置于三角瓶中，无菌水洗3次,加入75 %酒精浸没种子，轻轻晃动1 min，倒掉酒精。加入2.5 % 氯酸钠水溶液，150-170 rpm振荡25 min。加入无菌水轻摇振荡冲洗5-8次，倒净水。将种子接种于愈伤诱导培养基上，于30℃暗培养4-6周左右，得到水稻愈伤。
[0055]
5、将步骤4得到的水稻愈伤浸泡置于农杆菌侵染液中浸泡10min，然后，放在铺有两层灭菌滤纸的共培培养基上，22℃暗培养3天。
[0056]
6、取步骤5得到的水稻愈伤放入恢复培养基上，30℃培养4-7天。
[0057]
7、取步骤6得到的水稻愈伤，置于潮霉素筛选培养基，30℃培养2周。
[0058]
8、取步骤7得到的水稻愈伤，置于氯磺隆筛选培养基，30℃培养2周。
[0059]
9、将旺盛生长的愈伤组织转移到再生培养基上,在30
°
c培养20-30天。植株将从淡黄色或绿色的愈伤组织上产生。
[0060]
10、挑选健壮的大于3cm高的再生绿色幼苗，转移至生根培养基上，培养7-14天后，得到水稻e0苗。
[0061]
1.3 水稻e0苗的检测及分析11、提取上述步骤10得到的水稻e0苗的基因组dna并以其作为模板，采用引物f022（gtgagcgtggtggtagttgttg）和r022（atgaagaggattgaggagggtatc）组成的引物对进行 pcr扩增，得到pcr扩增产物；将该pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行如下判断：如果pcr扩增产物中含有约615bp的dna片段，则相应的抗性愈伤为水稻阳性e0苗；如果pcr扩增产物中不含有约615bp的dna片段，则相应的抗性愈伤不为水稻阳性e0苗。
[0062]
12、取步骤11所获得的水稻阳性e0苗的基因组dna作为模板，采用引物f026（ggtcatcaccaaccacctcttc）和r026（ccaccaccgacatagagaatcg）组成的引物对进行 pcr扩增，得到pcr扩增产物。
[0063]
13、将步骤12得到的pcr扩增产物进行sanger测序和分析。测序结果只针对靶点区进行分析。
[0064]
1.4 统计结果统计als4发生c->t碱基替换的水稻阳性e0苗数, 计算得出c->t碱基替换效率且同时统计突变基因型及对应水稻e0苗数，结果见表2。所产生的突变类型主要为靶点内单个c和三个c的突变。结果表明该碱基编辑系统的活性窗口主要为靶点序列内4-9bp，编辑效率最高的c主要发生在c7或c7附近位置。 ncas9&atcda1&ugi碱基编辑系统在水稻植株中实现了对als基因的编辑，实现了约36.4%的碱基编辑，证实了植物来源的胞嘧啶脱氨酶确实可以实现碱基编辑的功能。
[0065]
实施例2：用来源于水稻的胞嘧啶脱氨酶apobec1在水稻中进行碱基基因编辑。
[0066]
2.1 基因编辑载体的构建本发明的发明人构建了载体ncas9&apobec1&ugi。其中apobec1是来源于水稻的胞嘧啶脱氨酶，其氨基酸序列为序列表中的序列2所示。
[0067]
本例子使用的载体ncas9&apobec1&ugi为环状质粒，其核苷酸序列如序列表中序列48所示。上述序列中，第93至277位为polya终止子的核苷酸序列，第318至1343位为潮霉素的核苷酸序列，第1378至2157位为35s启动子的核苷酸序列，第2452至2706位为nos终止
子的核苷酸序列，第2743至2991位为ugi的核苷酸序列，第3061至7161 位为spcas9n的核苷酸序列(不含有终止密码子)，第7216至8148 位为osapobec的核苷酸序列(不含有终止密码子)，第8173至10144位为玉米ubiquitin启动子的核苷酸序列，第10171至10253位为sgrna骨架的核苷酸序列，第10254至10273位为靶点als4的核苷酸序列，第10274至10656位为osu3启动子的核苷酸序列。
[0068]
2.2 在水稻愈伤中进行基因编辑1、将载体ncas9&apobec1&ugi导入农杆菌eha105，得到重组农杆菌。
[0069]
2、在转化实验之前1-5天，在含50mg/l 卡那霉素+15mg/l 利富平的yeb固体培养基上接种重组农杆菌，用3m 胶带封皿；28 ℃，倒置，暗培养 1-5天。
[0070]
3、用接菌环刮取“ｚ”字形尾部的菌体，温和悬于100μm 含2mg/l 2,4-二氯苯氧乙酸的nb液体培养基中，使菌液浓度达到od
600
=0.1，制成农杆菌侵染液备用。
[0071]
4、将稻谷去掉种皮后置于三角瓶中，无菌水洗3次,加入75 %酒精浸没种子，轻轻晃动1 min，倒掉酒精。加入2.5 % 氯酸钠水溶液，150-170 rpm振荡25 min。加入无菌水轻摇振荡冲洗5-8次，倒净水。将种子接种于愈伤诱导培养基上，于30℃暗培养4-6周左右，得到水稻愈伤。
[0072]
5、将步骤4得到的水稻愈伤浸泡置于农杆菌侵染液中浸泡10min，然后，放在铺有两层灭菌滤纸的共培培养基上，22℃暗培养3天。
[0073]
6、取步骤5得到的水稻愈伤放入恢复培养基上，30℃培养4-7天。
[0074]
7、取步骤6得到的水稻愈伤，置于潮霉素筛选培养基，30℃培养2周。
[0075]
8、取步骤7得到的水稻愈伤，置于氯磺隆筛选培养基，30℃培养2周。
[0076]
9、将旺盛生长的愈伤组织转移到再生培养基上,在30
°
c培养20-30天。植株将从淡黄色或绿色的愈伤组织上产生。
[0077]
10、挑选健壮的大于3cm高的再生绿色幼苗，转移至生根培养基上，培养7-14天后，得到水稻e0苗。
[0078]
2.3水稻e0苗的检测及分析11、提取步骤10得到的水稻e0苗的基因组dna并以其作为模板，采用引物f022（gtgagcgtggtggtagttgttg）和r022（atgaagaggattgaggagggtatc）组成的引物对进行 pcr扩增，得到pcr扩增产物；将该pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行如下判断：如果pcr扩增产物中含有约615bp的dna片段，则相应的抗性愈伤为水稻阳性e0苗；如果pcr扩增产物中不含有约615bp的dna片段，则相应的抗性愈伤不为水稻阳性e0苗。
[0079]
12、取步骤11所获得的水稻阳性e0苗的基因组dna作为模板，采用引物f026（ggtcatcaccaaccacctcttc）和r026（ccaccaccgacatagagaatcg）组成的引物对进行 pcr扩增，得到pcr扩增产物。
[0080]
13、将步骤12得到的pcr扩增产物进行sanger测序和分析。测序结果只针对靶点区进行分析。
[0081]
2.4统计结果统计als4发生c->t碱基替换的水稻阳性e0苗数, 计算得出c->t碱基替换效率且同时统计突变基因型及对应水稻e0苗数，结果见表2。所产生的突变类型主要为靶点内单个c和三个c的突变。结果表明该碱基编辑系统的活性窗口主要为靶点序列内4-9bp，编辑效率最
高的c主要发生在c7或c7附近位置。ncas9&osapobec1&ugi碱基编辑系统在水稻植株中实现了对als基因的编辑，实现了约10%的碱基编辑，证实了植物来源的胞嘧啶脱氨酶确实可以实现碱基编辑的功能。
[0082]
表2 碱基编辑的统计结果
重组表达载体靶点名称 发生c->t碱基替换的阳性e0苗数总阳性 e0苗数c->t碱基 替换效率（%）突变基因型及对应e0苗数ncas9&atcda1&ugials441136.4c6c7c8->t6t7t8（2)；c7->t7（1)；c9->t9（1)ncas9&osapobec1&ugials411010c7->t7（1)
注：表2中，“突变基因型及对应e0苗数”列中，括号内数字表示e0苗数，c和t后面的数字表示发生c->t碱基替换的c所处的核苷酸位数(自靶点中的非pam序列一端(即5
′
端)的第一位核苷酸开始计数)，
“-
>”表示替换为。
[0083]
参考文献1. esvelt, k.m. and wang, h.h. (2013) genome-scale engineering for systems and synthetic biology. molecular systems biology, 9, 641. http://dx.doi.org/10.1038/msb.2012.662. puchta, h. and fauser, f. (2013) gene targeting in plants: 25 years later. the international journal of developmental biology, 57, 629-637. http://dx.doi.org/10.1387/ijdb.130194hp3. tan, w.s., carlson, d.f., walton, m.w., fahrenkrug, s.c. and hackett, p.b. (2012) precision editing of large animal genomes. advances in genetics, 80, 37-97. http://dx.doi.org/10.1016/b978-0-12-404742-6.00002-84. dianov, g.l. and hubscher, u. (2013) mammalian base excision repair: the forgotten archangel. nucleic acids research, 41, 3483-3490. http://dx.doi.org/10.1093/nar/gkt0765. h
ä
ndel, e.m. and cathomen, t. (2011) zinc-finger nuclease based ge-nome surgery: it
’
s all about specificity. current gene therapy, 11, 28-37. http://dx.doi.org/10.2174/1566523117945201206. jinek, m., chylinski, k., fonfara, i., hauer, m., doudna, j.a. and charpentier, e. (2012) a programmable dual
-ꢀ
rna-guided dna endonuclease in adaptive bacterial immunity. science, 337, 816-821. http://dx.doi.org/10.1126/science.12258297. yuchang zhu, xiaojiang zhang and yibing hu. (2015) methods, principles and application of gene editing. 05(03):32-418. satomi banno, keiji nishida, takayuki arazoe, hitoshi mitsunobu and akihiko kondo. (2018) deaminase-mediated multiplex genome editing in escherichia coli. nature microbiology. https://doi.org/10.1038/s41564-017-0102-69. xiaowang，jianan li, ying wang, bei yang, jia wei, jing wu, ruixuan wang, xingxu huang, jia chen and li yang. (2018) efficient base editing in methylated regions with a human apobec3a-cas9 fusion. nature biotechnology; http://dx.doi.org/10.1038/nbt.4198
10. jason d. salter, ryan p. bennett and harold c. smith. the apobec protein family: united by struture, divergent in function. trends biochem sci. 2016 jul; 41(7): 578-594.11. harold c. smith, ryan p. bennett, ayse kizilyer, william m. mcdougall and kimberly m. prohaska. functions and regulation of the apobec family of proteins (2012) semin cell dev biol. 2012 may; 23(3):258-268.

起点商标作为专业知识产权交易平台，可以帮助大家解决很多问题，如果大家想要了解更多知产交易信息请点击 【在线咨询】或添加微信 【19522093243】与客服一对一沟通，为大家解决相关问题。

此文章来源于网络,如有侵权,请联系删除