一种参与金银花花色变化的类胡萝卜素裂解双加氧酶编码基因的筛选鉴定及应用的制作方法

[0001]
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种参与金银花花色变化的类胡萝卜素裂解双加氧酶基因的筛选、功能验证方法及应用。


背景技术：

[0002]
植物天然产物是药物的重要来源，不同类型的天然产物也赋予植物各种各样的颜色，如花青素、类胡萝卜素等。植物花色形成与其授粉、育种及天然产物的开发密切相关，其分子机制是国际研究热点。类胡萝卜素类化合物的合成与降解和植物所呈现出的黄色花具有密切联系。研究显示，菊花的白色及黄色即是受到降解途径中的类胡萝卜素裂解双加氧酶cmccd4a的影响；柑橘中的citccd4b1作用于玉米黄质和β-隐黄质，产生以β-橙色素为主的c30脱辅基类胡萝卜素，赋予柑橘鲜艳的橙红色。因此，通过解析植物花色的分子变化机制，可为利用分子手段对其花期调控、花色以及分子育种等研究奠定基础。
[0003]
金银花为忍冬科植物干燥花蕾或带初开的花，可用于治疗发热、流感等，是一种传统的中药材。金银花一年之内能多次开花，花色由绿变白，再由白变黄，变化尤为明显，可将其分为幼蕾、三青、二白、大白、银花、金花等不同的时期，本研究旨在揭示金银花花色变化的内在分子机制，为金银花的花期调控及分子育种等提供前提。


技术实现要素：

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本发明的目的在于提供参与金银花花色变化的类胡萝卜素裂解双加氧酶编码基因及其编码的蛋白质。
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本发明的另一目的在于提供一种金银花中类胡萝卜素裂解双加氧酶关键基因的筛选方法。
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本发明的第三个目的在于提供对上述筛选出的关键酶基因ljccd4的功能验证方法。
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本发明提供的ljccd4基因，其核苷酸序列为seq id no.1所示，或其突变序列。
[0008]
本发明提供的ljccd4基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如seq id no.2所示。
[0009]
本发明目的可通过如下技术方案实现，技术方案一：基于转录组的金银花类胡萝卜素裂解双加氧酶关键基因筛选，步骤如下：
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1)基于金银花基因组，鉴定金银花ccd基因家族成员，构建进化树分析金银花与其他物种ccd之间的进化关系，初筛金银花类胡萝卜素裂解双加氧酶氨基酸序列。
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2)基于金银花不同发育时期花器官的转录组数据，分析差异基因表达，进一步筛选金银花类胡萝卜素裂解双加氧酶关键基因。
[0012]
技术方案二：参与金银花花色变化的关键酶ljccd4的功能验证。采用原核表达体系，以β-胡萝卜素及叶黄素为底物，体外鉴定金银花类胡萝卜素裂解双加氧酶ljccd4的功能。
[0013]
本发明公开了金银花类胡萝卜素裂解双加氧酶ljccd4筛选及功能鉴定，ljccd4具有催化β-胡萝卜素和叶黄素分别生成10
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apo-β-胡萝卜素醛、β-紫罗兰酮和3-羟基-10
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apo-β-胡萝卜素醛、3-oh-10
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apo-α-胡萝卜素醛、3-羟基-β-紫罗兰酮、3-羟基-α-紫罗兰酮的功能，揭示了金银花花色变化的内在分子机制，为金银花花期调控及分子育种等奠定基础。
附图说明
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图1：基于金银花基因组的类胡萝卜素裂解双加氧酶ljccd4家族成员鉴定及进化分析；
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图2：ljccd4编码基因在金银花不同发育时期花器官中的差异表达；
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图3：金银花花色变化相关的ljccd4蛋白催化机制。a：ljccd4能够催化β-胡萝卜素生成10
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apo-β-胡萝卜素醛，ljccd4能够催化叶黄素生成3-羟基-10
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apo-β-胡萝卜素醛和3-oh-10
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apo-α-胡萝卜素醛；b：推测的类胡萝卜素裂解途径；
[0017]
图4：液相-质谱联用鉴定ljccd4催化底物及产物：β-胡萝卜素、叶黄素、10
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apo-β-胡萝卜素醛、3-羟基-10
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apo-β-胡萝卜素醛和3-oh-10
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apo-α-胡萝卜素醛。
具体实施方案
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以下结合实例详细说明本发明。实施是为更好的理解本发明，但不限定于本发明。以下实施方法中的实验方法均为常规方法，所涉及的实验试剂均为常规生化试剂。
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实施例1基于金银花基因组与转录组数据ljccd4基因的筛选及系统进化分析
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1.1实验方法
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将六个不同发育时期的花器官置于45℃烘干，利用研磨仪mixer mill mm400磨成细粉，称取0.1g粉末加入4ml甲醇后，再加入200μl 60％的氢氧化钾，60℃加热20分钟，冷却后用乙酸乙酯∶石油醚＝1∶1进行萃取，上层萃取液浓缩至干后，用甲醇重溶，利用紫外分光光度计及液相进行检测，每个样品重复三次。
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基于金银花基因组数据，从tair数据库中提取拟南芥的ccd蛋白序列，通过blastp鉴定金银花ljccds。蛋白序列经muscle比对，构建nj系统进化树，bootstrap选择重复1000次。利用hisat2将金银花6个不同发育时期花器官的rna-seq转录组数据比对至金银花基因组，采用cufflinks计算基因表达fpkm值。
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1.2结果与分析
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类胡萝卜素总含量分析研究表明类胡萝卜素类化合物在花色由白变黄时大量积累，液相检测结果显示β-胡萝卜素和叶黄素为其中主要的两种类胡萝卜素类化合物。
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基于金银花基因组数据，筛选出了7个ljccd4，主要分布于4个亚家族，其中包括3个ljccd1s，1个ljccd4，1个ljccd7和2个ljccd8s，如图1。通过转录组数据分析，发现ljccd4基因的表达与金银花不同花期类胡萝卜素总含量积累呈负相关。随着金银花花色由白变黄，ljccd4基因表达呈显著降低趋势，如图2。因此，推测其为参与金银花花色变化的关键酶基因。
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实施例2参与金银花花色变化的关键酶ljccd4的功能验证
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2.1实验方法
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将ljccd4编码基因克隆至pet32a载体中形成pet32a-ljccd4重组表达载体，将载体转化至bl21(de3)大肠杆菌表达菌株中。取过夜培养的菌液2ml加入50ml lb液体培养集中(含有50μg/ml氨苄抗性的培养基)，37℃，200rpm，活化2-3h，待其od600至0.4-0.5时，加入终浓度为0.3mm的iptg进行诱导，16℃，130rpm。诱导24h后，离心取菌体沉淀，超声破碎后所得上清即为粗酶液，可进行体外催化反应。
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将粗酶液在体外按照以下反应体系进行功能验证(50μl)：100mm hepes(ph 8.0)，100μl粗酶液，1mm fe
2+
，100μm的β-胡萝卜素或叶黄素。用甲醇终止反应后混匀过0.22μm滤膜，利用uplc检测其化学成分。仪器型号，thermo ultimate 3000。进样量10μl，色谱柱：waters acquitybeh c18 column(1.7μm，100
×
2.1mm)，柱温：30℃。色谱条件：uv 440nm，流动相：检测叶黄素及其裂解产物条件：a：0.1％甲酸乙腈，b：0.1％甲酸水，流速：0.3ml/min，洗脱程序：0-5min，10％a增长至50％a；5-8min，50％a增长至90％a；8-10min，90％a增长至100％a，100％a持续一分钟后回到起始状态；检测β-胡萝卜素及其裂解产物条件：a：0.1％甲酸乙腈，b：0.1％甲酸水，流速：0.3ml/min，洗脱程序：0-5min，10％a增长至50％a；5-8min，50％a增长至90％a；8-10min，90％a增长至100％a，维持20min后回到起始状态。
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2.2结果与分析
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体外催化结果显示ljccd4能够催化β-胡萝卜素产生一个与10
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apo-β-胡萝卜素醛具有相同的色谱行为(如：保留时间、光谱图等)的色谱峰，如图3；当以叶黄素为底物时，可产生两个新的化合物，催化产物的定性分析需要进行液质检测。
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实施例3液相-质谱联用鉴定ljccd4催化底物及产物
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3.1实验方法
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利用agilent technologies 1290 infinity ii和6545 q-tof液质联用仪器检测产生的反应提取出来的产物，进行定性分析。进样量10μl，色谱柱：waters acquitybeh c18 column(1.7μm，100
×
2.1mm)，柱温：30℃。色谱条件：uv 440nm，流动相：(a)：乙腈(0.1％甲酸)，(b)：水(0.1％甲酸)，流速：0.3ml/min，洗脱程序：检测叶黄素及其裂解产物条件：a：0.1％甲酸乙腈，b：0.1％甲酸水，流速：0.3ml/min，洗脱程序：0-5min，10％a增长至50％a；5-8min，50％a增长至90％a；8-10min，90％a增长至100％a，100％a持续一分钟后回到起始状态；检测β-胡萝卜素及其裂解产物条件：a：0.1％甲酸乙腈，b：0.1％甲酸水，流速：0.3ml/min，洗脱程序：0-5min，10％a增长至50％a；5-8min，50％a增长至90％a；8-10min，90％a增长至100％a，维持20min后回到起始状态。6545 q-tof质谱参数为：干燥气体温度为350℃，流速5.0l/min；喷雾器为40psig；vcap为4000v。
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3.2结果与分析
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液质检测结果显示：ljccd4具有催化β-胡萝卜素生成10
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apo-β-胡萝卜素醛、β-紫罗兰酮；催化叶黄素生成3-羟基-10
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apo-β-胡萝卜素醛、3-oh-10
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apo-α-胡萝卜素醛、3-羟基-β-紫罗兰酮、3-羟基-α-紫罗兰酮的功能，如图3，图4。
[0037]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

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