一种荧光微球活化剂复溶液及其应用的制作方法

本发明属于生化检测试剂技术领域，具体涉及一种荧光微球活化剂复溶液及其应用。

背景技术：

荧光免疫层析技术是基于抗原抗体特异性免疫反应的新型膜检测技术。该技术以固定有检测线(包被抗体或抗原)和质控线(抗抗体)的条状纤维层析材料为固定相，测试液为流动相，荧光标记抗体或抗原固定于连接垫，通过毛细管作用使待分析物在层析条上移动。对于带有多个抗原决定簇的大分子抗原(蛋白、病毒、致病菌等)，通常采用“三明治”型双抗夹心免疫层析方法，即待测物在流动相作用下先与荧光标记抗体结合，当到达检测线时再与包被抗体结合形成双抗夹心的“三明治”型。

时间分辨荧光微球作为一种特殊的功能微球，每个微球中可能包裹成千上万个荧光分子，可大大提高荧光的标记效率，有效提高了分析灵敏度；同时荧光微球表面修饰有合适密度的羧基或其他功能基团，用于与蛋白或抗体的共价偶联，提高了标记物的稳定性。在荧光微球与蛋白或者抗体共价偶联之前，微球羧基的活化是极其关键的一步，利用edc和nhs作为交联剂活化微球羧基是常用的采用的一种方法。传统工艺中溶解化学试剂edc和nhs时一般使用的是超纯水，然而由于edc和nhs在水中容易水解，因此需要现配现用，并且微球的羧基与edc和nhs反应后形成酰胺键，使微球处于一种激发状态，极其的不稳定，需要立即与蛋白或者抗体共价偶联，否则微球将会影响共价偶联的效果。因此每次进行活化步骤时都需重新配置edc和nhs溶液，操作十分不方便，并且活化后的微球不稳定会影响活化效率进而影响检测成品试纸条的批间差和灵敏度。

技术实现要素：

本发明针对现有技术存在的缺陷，提供了一种荧光微球活化剂复溶液及其应用，通过特殊选取表面活性剂s22chcmalla-9，将其与二甲基亚砜配置的mes缓冲液复配作为活化剂复溶液用于溶解edc和nhs，进而用于活化微球，从而得到了一种活化效率高，操作方便，且稳定性和灵敏度显著增强的荧光微球免疫层析试纸条，并且批间差得到有效控制，适合大批量生产使用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种荧光微球活化剂复溶液，所述活化剂复溶液用于溶解edc和nhs，所述活化剂复溶液由浓度20～100mmmes缓冲液和质量浓度0.5～2％的表面活性剂s22chcmalla-9组成，其中所述mes缓冲液由二甲基亚砜溶解mes配制而成。

本发明使用了一种活化剂复溶液，以替代传统使用的超纯水，用于溶解活化剂edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)制成活化剂，通过特殊选取表面活性剂剂s22chcmalla-9，使其与mes缓冲液和二甲基亚砜产生协同作用，可以减缓edc和nhs的水解速度，使活化剂更加稳定，利于长期保存使用。将该活化剂用于荧光微球的活化也可显著增强活化效率和活化后荧光微球的稳定性，其中表面活性剂剂s22chcmalla-9可使荧光微球分布更加均一，显著增强荧光微球的稳定性和偶联效率，进而显著增强了试剂的灵敏度。

进一步的，所述活化剂复溶液由浓度50mmmes缓冲液和质量浓度1％的表面活性剂s22chcmalla-9组成。通过对缓冲液和表面活性剂的浓度进行优化，得到了一种稳定性和灵敏度最优的活化剂复溶液。

本发明还提供了所述活化剂复溶液在荧光微球活化中的应用。

本发明还提供了一种活化的荧光微球，即采用所述的活化剂复溶液分别溶解edc和nhs，然后依次加入至荧光微球中进行活化，得到所述活化的荧光微球，其中nhs和edc的终浓度为0.03-0.1mg/ml。

本发明还提供了一种荧光微球免疫层析试纸条，所述试纸条包含上述活化的荧光微球。

进一步的，所述试纸条中还包括：样品垫和硝酸纤维素膜。

本发明还提供了一种荧光微球免疫层析试纸条的制备方法，包括：

s1、将荧光微球溶解于微球稀释液中，然后加入上述活化剂复溶液分别溶解得到的edc溶液和nhs溶液进行活化；

s2、离心去上清，将沉淀重悬，然后加入抗体进行偶联；

s3、加入封闭剂，离心去上清，将沉淀用保存液重悬得到荧光溶液；

s4、将上述荧光溶液稀释后喷涂于玻璃纤维素膜上，烘干得到荧光微球垫；

s5、将抗体包被于硝酸纤维素膜上，并制备样品垫；

s6、将上述荧光微球垫、硝酸纤维素膜和样品垫依次组装即得所述荧光微球免疫层析试纸条。

进一步的，步骤s1具体为：将荧光微球溶解于微球稀释液中至浓度为5～10mg/ml，然后加入活化剂复溶液分别溶解得到的nhs溶液和edc溶液，至终浓度分别为0.03～0.1mg/ml，于28-32℃下摇床活化20-30min。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明主要针对现有技术中用于活化微球的edc和nhs溶液易水解，且活化后的荧光微球稳定性差的问题，提供了一种用于溶解edc和nhs的活化剂复溶液，不仅可减缓edc和nhs的水解速度，显著增强活化剂的稳定性和活化效率；并且通过对活化剂复溶液中的表面活性剂种类及浓度进行优选，显著增强了活化后的荧光微球的稳定性，使其可在2-8℃稳定保存至少65天，同时增强了荧光微球抗体共价偶联的效果进而显著增强了试剂的灵敏度。将本发明所述的活化剂复溶液应用于荧光微球活化和荧光微球免疫层析试纸条制备中，不仅操作方便，节省时间，使标记工艺更加稳定，适用范围广泛，同时有效控制了批间差，适合大规模生产使用。

具体实施方式

下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例和对比例通用的实验材料和试剂包括：

(1)荧光微球：来源于bangslaboratories公司，粒径250nm；

(2)微球稀释液：ph为7.0，浓度为50mm磷酸盐缓冲液；

(3)edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)：来源于thermoscientific公司；

(4)mes(2-(n-吗啉代)乙磺酸)：来源于贝克生物科技有限公司；

(5)二甲基亚砜：来源于西宝生物科技有限公司；

(6)抗体：标记抗体：pct单克隆抗体1、ck-mb单克隆抗体1、crp单克隆抗体1和myo单克隆抗体1；包被抗体：pct单克隆抗体2、ck-mb单克隆抗体2、crp单克隆抗体2和myo单克隆抗体2，均来源于武汉华美生物工程有限公司；

(7)封闭剂：ph为7.4，包括50mm磷酸盐缓冲液和质量浓度1-10％的牛血清白蛋白；

(8)保存液：ph为8.5，包括20mm磷酸盐缓冲液，质量浓度为1-5％的酪蛋白和0.1-0.5％的tx-100；

(9)包被缓冲液：ph为7.4，20mmpbs缓冲液；

(10)样品垫处理液：ph8.5，20mmtris缓冲液，质量浓度0.1-0.5％的牛血清白蛋白，1-5％的酪蛋白，0.1-0.5％的tx-100和0.05％的防腐剂proclin300；实施例1

本实施例提供了一种荧光微球活化剂复溶液及其在荧光微球活化中的应用，以及包含有上述活化的荧光微球的的荧光微球免疫层析试纸条及其制备方法，具体为：

(1)配制活化剂：取mes，用二甲基亚砜溶解并配制成50mmmes缓冲液，并加入质量浓度1％的表面活性剂s22chcmalla-9(来源于苏州鸿信生物技术有限公司)，混合均匀后调节ph为6.0，即得活化剂复溶液，用活化剂复溶液分别溶解nhs和edc得到nhs溶液和edc溶液，保存备用，无需现配先用；

(2)取荧光微球，加入10ml微球稀释液中，使微球终浓度为8mg/ml；

(3)向上述溶液中依次加入nhs溶液至终浓度为0.05mg/ml和edc溶液至终浓度为0.05mg/ml，放置于30℃的摇床中活化30min；

(4)活化后于12000rpm离心，去上清，并将沉淀重悬于10mlph为7.4的50mm磷酸盐缓冲液中，混匀；

(5)向上述重悬液中加入pct(降钙素原)单克隆抗体1至终浓度为1mg/ml，进行偶联反应4h；

(6)偶联反应后加入500μl封闭剂以封闭荧光微球的多余位点；然后于16000rpm离心，去上清后加入10ml的保存液，混匀即得荧光溶液；

(7)将上述荧光溶液用保存液稀释5倍后，喷涂于1cm宽的玻璃纤维素膜上，置于烘箱中45℃烘干16h得到荧光微球垫；

(8)检测线制备：将pct单克隆抗体2包被于硝酸纤维素膜上，其中抗体的浓度为1mg/ml，使用划膜仪在硝酸纤维素膜上的包被量为1μl/cm.检测线划在硝酸纤维素膜的中间位置，然后置于烘箱中45℃烘干16h；

(9)样品垫制备：将玻璃纤维素膜切成1.8cm宽的长条，将切好成条的玻璃纤维素膜浸泡在配置好的样品垫处理液中，然后置于烘箱中45℃烘干16h；

(10)将步骤(7)的荧光微球垫、步骤(8)的硝酸纤维素膜和步骤(9)的样品垫组装成组装成大板、切成4.0mm宽的检测条组装成检测卡，即为荧光微球免疫层析试纸条。

实施例2

本实施例与实施例1的不同之处在于：其中步骤(1)的活化剂复溶液中表面活性剂s22chcmalla-9的质量浓度0.5％。

实施例3

本实施例与实施例1的不同之处在于：其中步骤(1)的活化剂复溶液中表面活性剂s22chcmalla-9的质量浓度2％。

实施例4

本实施例与实施例1的不同之处在于：其中步骤(1)的活化剂复溶液中用二甲基亚砜溶解并配制成的mes缓冲液的浓度为20mm。

实施例5

本实施例与实施例1的不同之处在于：其中步骤(1)的活化剂复溶液中用二甲基亚砜溶解并配制成的mes缓冲液的浓度为100mm。

实施例6

本实施例与实施例1的不同之处在于：步骤(6)中采用ck-mb(肌酸激酶)单克隆抗体1；步骤(8)中采用ck-mb单克隆抗体2。

实施例7

本实施例与实施例1的不同之处在于：步骤(6)中采用crp(c反应蛋白)单克隆抗体1；步骤(8)中采用crp单克隆抗体2。

实施例8

本实施例与实施例1的不同之处在于：步骤(6)中采用myo(肌红蛋白)单克隆抗体1；步骤(8)中采用myo单克隆抗体2。

对比例1

本对比例与实施例1的不同之处在于：其中步骤(1)的活化剂复溶液中无表面活性剂，仅为用二甲基亚砜溶解并配制成50mmmes缓冲液。

对比例2

本对比例与实施例1的不同之处在于：其中步骤(1)的活化剂复溶液中表面活性剂s22chcmalla-9的质量浓度0.3％。

对比例3

本对比例与实施例1的不同之处在于：其中步骤(1)的活化剂复溶液中表面活性剂s22chcmalla-9的质量浓度3％。

对比例4

本对比例与实施例1的不同之处在于：将步骤(1)的活化剂复溶液中表面活性剂s22chcmalla-9更换为表面活性剂s19tween-20(来源于simga公司)。

对比例5

本对比例与实施例1的不同之处在于：将步骤(1)的活化剂复溶液中表面活性剂s22chcmalla-9更换为表面活性剂s14tx-100(来源于国药集团化学试剂有限公司)。

对比例6

本对比例与实施例1的不同之处在于：将步骤(1)的活化剂复溶液中表面活性剂s22chcmalla-9更换为表面活性剂s9tetronic1307(来源于苏州鸿信生物技术有限公司)。

评价方案

(1)精密度：将实施例1-5和对比例1-6得到的荧光微球免疫层析试纸条分别检测同一pct样本(浓度7ng/ml)，实施例6检测15ng/mlck-mb样本，实施例7检测10mg/lcrp样本，实施例8检测100ng/mlmyo样本，检测10次，将样本加入至试纸条的样本孔中，15min后使用荧光免疫分析仪定量检测信号判断样本浓度，计算均值、标准差(sd)和变异系数(cv)，其中cv小于10％可满足使用需求，结果如表1所示。

(2)灵敏度：将实施例1-5和对比例1-6得到的试纸条分别检测同一低浓度pct样本(0.5ng/ml)，实施例6检测1ng/mlck-mb低浓度样本，实施例7检测0.5mg/lcrp低浓度样本，实施例8检测50ng/mlmyo低浓度样本，每个样本检测10次，计算均值、标准差(sd)、偏差和变异系数(cv)，其中cv小于10％且偏差小于10％能满足使用需求，结果如表2所示。

(3)稳定性：将实施例1-8和对比例1-6步骤(4)得到的活化后的荧光微球放置于2-8℃条件下，分别放置0天、10天、20天、30天、45天和65天，然后分别检测放置不同天数后，制备得到的试纸条的精密度和灵敏度，结果如表1-2所示。

(4)批间差：分别用3个不同批号的试纸条检测同一浓度的样本，每个批号测试3次，分别计算每批3次测定的均值，计算其批间相对偏差(r)，计算方法为：

式中：

每批3次测定的均值(i＝1，2，3)；中的最大值；

中的最小值；批试剂检测均值；r：批间相对偏差。

测定结果如表3所示。

表1精密度评价数据

表2灵敏度评价数据

表3批间差评价数据

根据表1的测定结果，其中实施例1-5和实施例6-8的变异系数均小于10％，即按照本发明所述的方法制备得到的荧光微球免疫层析试纸条均可满足使用需求，并且随着活化后的荧光微球的放置时间延长，在放置了65天后，其变异系数仍满足使用需求，即精密度和稳定性好。同时其适用范围广，对于多种不同的待测项目：pct、ck-mb，crp或myo，其精密度和稳定性均可满足使用需求。进一步的，其中实施例1和实施例6-8的精密度最优。将对比例1-6与实施例1进行比较，在第0天时，对比例1-6的精密度显著低于实施例1，并且随着放置时间的延长，对比例1-6的变异系数显著增高，即精密度显著降低。上述结果说明相比于实施例1，无表面活性剂(对比例1)或改变表面活性剂s22chcmalla-9的浓度(对比例2-3)或改变表面活性剂的种类(对比例4-6)，试剂的精密度和稳定性均显著降低。

与表1的结果类似，根据表2的测定结果，其中实施例1-5和实施例6-8的偏差值和变异系数均小于10％，满足使用需求，并且随着活化后的荧光微球的放置时间延长，在放置了65天后，其偏差和变异系数均仍满足使用需求，即灵敏度和稳定性高，并且使用范围广泛。进一步的，其中实施例1和实施例6-8的灵敏度最优。而表面活性剂种类和浓度的变化(对比例1-6)对试纸条的稳定性和灵敏度均有显著影响。

根据表3的测定结果，其中实施例1-5和实施例6-8的批间差均低于10％，即不同批次的产品之间，测值稳定，而表面活性剂种类和浓度的变化对批间差会产生显著影响，进一步的，其中实施例1和实施例6-8的批间差最优。

综合上述结果，在荧光微球免疫层析试纸条的制备过程中，活化剂复溶液对于试纸条的性能有一定的影响，其中当活化剂复溶液为：二甲基亚砜配制的20～100mmmes缓冲液和质量浓度0.5～2％的表面活性剂s22chcmalla-9时，试纸条的稳定性显著提高，进一步的，当活化剂复溶液为：二甲基亚砜配制的50mmmes缓冲液和质量浓度1％的表面活性剂s22chcmalla-9时，试纸条的精密度和灵敏度最高，且批间差最小。即本发明通过特殊选取表面活性剂s22chcmalla-9，并将其与二甲基亚砜配制的mes缓冲液复配得到活化剂复溶液用于荧光微球活化，可使活化后的荧光微球于2-8℃条件下稳定保存65天后，精密度和灵敏度仍满足使用需求，因此可在偶联抗体时随时拿出来在室温平衡后使用，操作方便快速，节约时间，有利于批间差的控制，适合大规模生产使用。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

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