一种丙型肝炎病毒检测试剂盒的制作方法

[0001]
本发明涉及一种丙型肝炎病毒检测试剂盒，属于检测试剂盒领域。


背景技术：

[0002]
丙型病毒性肝炎(hepatitis c virus，hcv)是慢性肝炎的重要类型，是目前全世界流行最为广泛的传染病之一，其引发的慢性丙型肝炎(chronic hepatitis c，chc)发病隐匿，易被患者忽视，是导致肝硬化、肝癌及肝功能衰竭的主要原因之一。国际上治疗chc的标准方案为聚乙二醇干扰素α(peg-ifnα)联合利巴韦林(rbv)，近年来有研究证明，chc抗病毒治疗的临床疗效除了受病毒载量、年龄、种族、肝脏形态因素影响外，还与位于人体染色体19的编码干扰素λ3的白细胞介素-28b(il-28b)单核苷酸多态性高度相关，但多数报道多集中于il-28b rs8099917位点，且il-28b对丙肝治疗疗效及预后的预测价值尚处于初步研究阶段。
[0003]
但除il-28b rs8099917位点外，il-28b rs12979860位点据报道也与乙肝病毒的易感性相关。由于丙型肝炎流行广泛，因此针对丙型肝炎及其预后的快速检测试剂盒的研发对于临床有重要的意义。


技术实现要素：

[0004]
针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是获得一种丙型肝炎病毒检测试剂盒。
[0005]
为实现上述发明目的，本发明采用的丙型肝炎病毒检测试剂盒的技术方案如下：
[0006]
所述试剂盒包括两对扩增引物、多重pcr混合反应液，其中扩增引物用于扩增肥胖基因多态性位点，包括rs8099917位点和rs12979860位点，每对引物分别对应一个snp位点的上下游区域。
[0007]
优选的，所述rs8099917位点的扩增引物序列如序列表seq id no：1～2所示。
[0008]
优选的，所述rs12979860位点的扩增引物序列如序列表seq id no：3～4所示。
[0009]
优选的，所述多重pcr混合反应液包括dna聚合酶、mg
2+
和dntps。更进一步优选的，多重pcr混合反应液中还包括pcr稳定剂和增强剂。
[0010]
优选的，所述扩增体系中，每个snp位点的扩增引物和模板的加入量相同。
[0011]
本发明中的检测试剂盒一般采用处理过的dna样品作为扩增模板，样品一般来源于人全血或组织，处理样品可以减少血液中的免疫球蛋白g、血红蛋白和乳铁蛋白对pcr反应体系的干扰。
[0012]
优选的，所述检测试剂盒还包括全血样品pcr缓冲液，所述缓冲液含有100mmol/l tris-hcl，50mmol/l kcl，ph 9.3～9.5。全血样品pcr缓冲液是本发明的一种优选的实施方案，其他类型的全血pcr试剂均可以采用，不限于本发明中的缓冲液和缓冲液配方。
[0013]
优选的，试剂盒扩增体系为50μl的pcr体系，体系中同时含有rs8099917位点和rs12979860位点的扩增引物。
ggcaaatgac aagagctagt gcaagctcct ggggccagca tgggtgaggg gcctcatcca caggcctaaa ggaaggggag agggttgagg gtgtgcatgt ggttgcctga cttggggagg agagagtcac ttagatttgt ggaggaaaca gatgaattgt ggtggcccag cacagggagg agccctgggg aaaaaacacc tgacctcctc tcccctctac ctggggccca gagtaggttg gagaagcagg gacagtagat aaggaggggc aaacggaaga catcccccac ccccacacca
[0030]
根据ncbi中公布的多态性位点进行引物设计，rs12979860位点为“c/t”碱基突变，以“y”表示。具体序列如下：
[0031]
ggcctgagga tgcagagaag ctggcggggg agaggggcgg cggggcgcgg ccgtcactca cgcaggccgc cacatccctc cccgcggccg ccagcagctc caggatcggg ccggcgccgg ggagcagctc cgagcggtgc aggccgctga gcactgcctg ggcgtccgcg atgccccggg ccacgtggcg gagccgagcg caggactgcg gggacgagag ggcgttagag cgggccgcgc ccgggccatg cctctcccgc ccactcccgg gcctcaccga tggccgcgga ggatccctcc tggggcggaa ggagcagttg cgctgccccc agctcagcgc ctcttcctcc tgcgggacaa gcggcgctta tcgcatacgg ctaggccccc tcgccagggc ccctaacctc tgcacagtct gggattcctg gacgtggatg ggtactggca gcgcacggtc gtgcctgtcg tgtactgaac cagggagctc cccgaaggcg
[0032]
y
[0033]
gaaccagggt tgaattgcac tccgcgctcc cccagcaaag cccctcgccc cgacctggag ccgagtcctc ccggcagggc tcccttctgt gattgaccct gagcctgcgt tcgcgctgac gacggggact gcgggggtct cgtggtggga attgtgggcg ctgacatagg agaggcgcct gctgggcgct aggacgcagg accccttggg acaggaacgg gtgtatggga acccggtggg gccagggtcc cagggggcac aggggctggg cggtgactta cgtagcggtc cctcagcgcc ttggcagccg ccagcgtccg gggctccagc gagcggtagt gcgagagcag gcagcgccgg ggggccttct gcgatcaccg tgcacaggac ccacagcccc gcggccactg cggcccagac actcggccgc atctctgctt ctgcagcagg cgagagacgt cagggaagcc aaagagaggg tccagcgcgt ccagcccccc
[0034]
针对上述序列设计特异性扩增引物，便于进行快速高效的扩增。引物序列如下：
[0035][0036]
本实施例采用多重pcr法对两个snp位点进行同时扩增后检测。
[0037]
二、试剂盒组成
[0038]
本实施例中的快速检测试剂盒为针对il-28b两个较高的snp位点进行同时扩增的多重pcr试剂盒，其中包括两对snp位点的上下游扩增引物及扩增模板提取试剂、多重pcr混合反应液，反应液包括dna聚合酶、mg
2+
、dntps、pcr稳定剂和增强剂。
[0039]
本实施例试剂盒中采用的dna模板为处理后提取的人血dna模板，对于采集的人全血或组织来说，需要预先进行处理。如待扩增样品为未经处理的全血样品，需采用用于全血样品pcr的缓冲液，其中含有100mmol/l tris-hcl，50mmol/l kcl，ph 9.3～9.5。
[0040]
三、多重pcr
[0041]
多重pcr选择platinum multiplex pcr master mix作为反应体系，其中包括dna聚合酶、mg
2+
、dntps、pcr稳定剂和增强剂，本次实验选择invitrogen platinum multiplex pcr master mix，pcr体系为50μl，其中
[0042]
2
×
platinum multiplex pcr master mix 25μl；
[0043]
模板2μl；
[0044]
rs8099917、rs12979860上下游引物(10μmol/l)各1μl；无菌双蒸水补齐至50μl。
[0045]
pcr反应条件：95℃预变性10min；然后94℃变性30s，55℃退火90s，72℃延伸60s，40个循环后，再次72℃延伸10min，恢复至4℃。
[0046]
四、扩增结果检测
[0047]
1、扩增产物检测
[0048]
由于多重pcr的影响因素较多，扩增时需要对反应条件和引物位点、扩增产物等信息进行综合考虑，本实施例中的扩增引物组合是通过多次实验反复验证，相互间影响最小可以实现多重pcr的组合。
[0049]
采用本实施例中的上下游引物组合扩增后验证扩增产物，pcr产物选择2％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果中条带1、2为rs12979860的扩增产物序列，条带3、4为rs17817449的扩增产物序列，电泳条带位置说明扩增结果无误。
[0050]
将电泳结果胶回收后送测序，测序结果也与目的产物序列一致。
[0051]
2、il-28b基因snp位点基因型频率
[0052]
最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。

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