热带假丝酵母菌突变株及其在BCAA制备中的应用的制作方法

热带假丝酵母菌突变株及其在bcaa制备中的应用


背景技术：

[0001]
l-亮氨酸(l-leu)、l-缬氨酸(l-val)与l-异亮氨酸(l-ile)同属于支链氨基酸，在食品、保健品、饲料等方面也有广泛的应用。在运动营养方面，支链氨基酸有助于促进训练后的肌肉恢复，特别适合健美人群和运动员作为膳食补充剂使用。
[0002]
发酵法生产支链氨基酸的过程中往往采用离子交换法和多步结晶方法等去除杂酸，由于杂酸和产物的理化性质相似，从而影响纯化和精制的收率，其中难以去除的杂酸中l-丙氨酸(l-ala)占比较大。专利cn201510744314.7采用离子交换柱分离l-缬氨酸和杂质氨基酸，l-缬氨酸提取收率在68％左右，且生产废水较大。
[0003]
市场上支链氨基酸(bcaa)产品的类型主要为干混类、颗粒类、速溶类等，通常采用三种氨基酸原料按照不同比例和不同工艺进行制备。目前支链氨基酸发酵液中经常或多或少存在其他两种支链氨基酸，既然产品是三种氨基酸混合使用，因此在产品分离提取过程中只需要除掉支链氨基酸以外的杂酸，既减少生产废水，又提高产品收率。为了简化目标氨基酸的分离纯化和精制工艺，专利cn200910047124.4采用多种酶联合催化法去除反应体系中的丙氨酸和某些手性氨基酸，但从结果上来看并不能完全去除l-丙氨酸，且酶无法回收再利用。
[0004]
从技术现状来看，高纯度支链氨基酸(bcaa)的制备工艺中，产物提纯分离技术需要进一步精进。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的在于提供一种可以特异性消除生产体系中的游离l-丙氨酸(l-ala)、l-谷氨酸(l-glu)的方法，从而提高支链氨基酸纯度。
[0006]
首先，本发明提供一株热带假丝酵母菌(candida tropicalis)突变株ibec-16，保藏于中国北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmcc no.17928，保藏日期为2019年06月16日。
[0007]
本发明的上述突变株是以热带假丝酵母菌(candida tropicalis)(cicc编号1253)为出发菌株，通过诱变筛选得到的。该突变菌能特异性地除掉发酵体系中的游离氨基酸l-ala和l-glu，而且在l-ala和l-glu存在时不利用l-ile、l-val和l-leu。
[0008]
基于该突变株ibec-16的上述特征，本发明的另一目的在于提供一种高纯度支链氨基酸(bcaa)的生产方法，包括对发酵生产bcaa的发酵产物体系(即bcaa发酵液)进行后处理的步骤，所述的后处理包括将上述本发明的热带假丝酵母菌突变株菌体接种入bcaa发酵液中进行培养的除杂酸的步骤。
[0009]
本发明提供了一株热带假丝酵母突变株及利用其制备高纯度bcaa产品的方法。以热带假丝酵母(cicc编号1253)为出发菌株，采用紫外诱变并驯化筛选得到一株热带假丝酵母突变株ibec-16，该酵母菌能特异性地除掉l-ala、l-glu，而且在l-ala和l-glu存在时不利用l-ile、l-val和l-leu。将酵母接入bcaa发酵液中培养，滤液通过脱色、除盐、浓缩结晶、烘干后得到bcaa产品，产品收率达到85％以上。通过简单的培养过程，既去除杂酸，又不影
响目标氨基酸的得率，且突变株菌体能够重复利用。整个工艺过程环保、易控制，有效地简化分离纯化和精制工艺，产品纯度高且收率高，产品可直接用于下游产品制备，适合大规模工业化应用。
附图说明
[0010]
本发明附图4幅:
[0011]
图1是热带假丝酵母cicc no.1253与其突变株ibec-16对l-丙氨酸和l-缬氨酸利用情况差异试验结果。
[0012]
图2是热带假丝酵母突变株ibec-16对不同氨基酸的降解测试结果图。
[0013]
图3是热带假丝酵母突变株ibec-16对bcaa发酵液中氨基酸的利用情况测试结果图。
[0014]
图4是无机盐对热带假丝酵母突变株ibec-16利用l-丙氨酸的影响测试结果图。
具体实施方式
[0015]
本发明关于一个新的突变菌株，热带假丝酵母菌突变株及其应用。该突变株的保藏编号为cgmcc no.17928。该菌株可应用于清除发酵体系中的l-丙氨酸(l-ala)、l-谷氨酸(l-glu)等杂酸。因此，该突变株可用于高纯度bcaa的生产方法，包括对bcaa反应液进行后处理的步骤，所述的后处理包括将前述热带假丝酵母菌突变株菌体接种入bcaa发酵液中进行培养的除杂酸的步骤。
[0016]
在产生l-亮氨酸、l-异亮氨酸或l-缬氨酸的bcaa微生物发酵液中(本文中也称bcaa发酵液)，会有杂酸的残留，所述杂酸包括l-丙氨酸(l-ala)、l-谷氨酸(l-glu)。本案的具体实施即为除去这两种杂酸。
[0017]
更为具体的实施方式中，所述的除杂酸的步骤是：将bcaa发酵液的ph调至6.0，接入热带假丝酵母菌突变株菌体；初始时，体系od＝4～6，然后在30
±
2℃条件下培养，do控制在30～50％，ph控制在5.5-6.0；培养结束后，离心并分别收集滤液和菌体。在该反应过程中，每小时取样测氨基酸的含量，至反应完全，离心、分别收集滤液和菌体，菌体回收重复利用。其中，所述的反应完全是指体系中l-丙氨酸含量被消耗至0.01g/l(浓度)以下。氨基酸的含量检测参照中国药典2010年版二部附录v d高效液相色谱法。
[0018]
上述任意技术方案中所述的热带假丝酵母菌突变株菌体通过下述方法制备：取一环活化的热带假丝酵母菌突变株(ibec-16)接入装有50ml ypd培养基的锥形瓶中，置于30℃、220rpm摇床中培养约16h；然后取1ml培养液接入另一盛有50ml ypd培养基的锥形瓶中，置于30℃、220rpm摇床中培养20h左右，离心收集菌体。
[0019]
斜面保存的热带假丝酵母菌突变株(ibec-16)的活化培养使用ypd培养基，具体方式是：取100μl甘油管中菌液接入ypd培养基中，置于30℃、220rpm摇床中培养约16h培养，划线培养后挑取单克隆接入斜面保存。
[0020]
如无特殊说明，本发明中所述及的ypd培养基均为：葡萄糖20g/l，酵母膏10g/l，蛋白胨20g/l，121℃灭菌20min。
[0021]
本发明中所述热带假丝酵母菌突变株的应用中，菌体是可以重复使用的。所述的菌体重复使用的方法与首次使用相同，同一批菌体可重复使用3次。
[0022]
进一步具体的实施方式中，除杂酸的反应后，还包括对除杂酸步骤后所获得的滤液进行纳滤膜除盐及蒸发结晶的步骤。具体地，可经截留分子量400da纳滤膜除盐，减压蒸馏至有大量固体析出，降温过滤，固体在50℃减压烘干得bcaa纯品。
[0023]
更为具体地，本发明所述的方法包括对bcaa发酵液的下述处理步骤：
[0024]
(1)除杂酸
[0025]
将bcaa反应液调ph至6.0，接入热带假丝酵母菌突变株菌体，使初始od＝5，然后于30
±
2℃条件下培养，培养过程控制溶氧量(do)30～50％，ph值5.5～6.0；培养结束后，离心并分别收集滤液和菌体；
[0026]
(2)除盐、结晶
[0027]
步骤(1)所得滤液经截留分子量400da纳滤膜除盐，减压蒸馏至有大量固体析出，降温过滤，固体在50℃减压烘干得bcaa纯品。
[0028]
另一方面，对于bcaa发酵液，本发明通常指产生l-亮氨酸、l-异亮氨酸或l-缬氨酸的微生物发酵液，这于本领域技术人员是可以选择与判定的。
[0029]
下面结合附图及实施例对本发明的内容作进一步的说明。这些非限制性实施例不应当被理解为对本发明内容任意形式的限定。
[0030]
实施例1.酵母菌获得与培养
[0031]
以热带假丝酵母(cicc编号1253)为出发菌株，通过紫外诱变并驯化筛选得到一株热带假丝酵母突变株ibec-16，该酵母菌能特异性地除掉l-ala和l-glu，而且在l-ala和l-glu存在时不能利用l-ile、l-val、l-leu；添加一定无机盐的培养条件下该菌能彻底消耗培养基中含有的30g/l l-丙氨酸。
[0032]
所使用的培养基组成如下：
[0033]
斜面培养基：葡萄糖5g/l，酵母膏10g/l，蛋白胨10g/l，15-20g/l琼脂，121℃灭菌20min。
[0034]
平板培养基：葡萄糖5g/l，酵母膏10g/l，蛋白胨10g/l，15-20g/l琼脂，121℃灭菌20min。
[0035]
驯化培养基：l-丙氨酸10-40g/l，无机盐(kh
2
po
4
·
3h
2
o 2.5g/l，mgso
4
·
7h
2
o1.0g/l，kcl 0.5g/l)。
[0036]
摇瓶培养基：l-缬氨酸40g/l，l-异亮氨酸20g/l，l-亮氨酸15g/l，l-丙氨酸30g/l，l-谷氨酸10g/l，无机盐(kh
2
po
4
·
3h
2
o 2.5g/l，mgso
4
·
7h
2
o 1.0g/l，kcl 0.5g/l)，ph6.0。
[0037]
1、突变株ibec-16选育过程，包括如下步骤：
[0038]
(1)突变株ibec-16菌悬液的制备
[0039]
取一环活化的热带假丝酵母(cicc编号1253)接入装有50ml ypd培养基的锥形瓶中，置于30℃、220rpm摇床中培养至对数生长期。取培养液于无菌离心管中，8000rpm离心10min，弃去上清液，使用生理盐水再次洗涤离心，采用生理盐水重悬细胞后振荡10min，调整细胞浓度为1
×
10
8
个/ml，为突变株ibec-16菌悬液。
[0040]
(2)紫外诱变和驯化
[0041]
取步骤(1)所得菌悬液5ml加入无菌平皿中，置于磁力搅拌器上搅拌，于20w紫外光下30cm处照射30-180s，并取样稀释涂布平板，挑选长得快、菌落大的单菌落接种于斜面培养基，进行斜面保存。
[0042]
取一环斜面上菌株接入装有50ml ypd培养基的锥形瓶中，置于30℃、220rpm摇床中培养至对数生长期，然后将其接入驯化培养基中，挑选耐受l-丙氨酸最高浓度的菌株用于摇瓶复筛。
[0043]
(3)摇瓶复筛
[0044]
取一环步骤(2)中斜面保存的菌株接入装有50ml ypd培养基的锥形瓶中，置于30℃、220rpm摇床中培养20h，离心收集菌体，将其接入摇瓶培养基中，30℃、220rpm培养24小时，培养过程中每小时取样并控制ph6.0左右，采用液相色谱分析反应液中各种氨基酸的含量。在所有检测菌株中，24h消耗l-丙氨酸最多的菌株为目标的突变株ibec-16。
[0045]
(4)突变株ibec-16遗传稳定性的检测
[0046]
将步骤(3)获得的热带假丝酵母ibec-16连续斜面传代10次，并将每一代分别接种一环于ypd培养基的锥形瓶中，置于30℃、220rpm摇床中培养至对数生长期，然后转接入摇瓶培养基中，30℃、220rpm摇床发酵24h，培养过程中每小时取样并控制ph6.0左右，测定反应液中氨基酸含量。同时以1代的热带假丝酵母ibec-16作对照。
[0047]
实施例2
[0048]
本实施例中所使用的bcaa发酵液通过下述方法获得：按照“l-缬氨酸发酵工艺研究”一文所记载的方法制备l-缬氨酸发酵液，《中国药学会学术年会》，2004。
[0049]
取一环活化的突变株ibec-16接入装有ypd培养基的锥形瓶中，置于30℃、220rpm摇床中培养16h；按接种量为10％接入含有ypd培养基的5l发酵罐中，初始通气量0.7vvm，在30℃、200-700rpm条件下培养，do控制在20％，ph控制在5.0，培养6h左右。将3l bcaa发酵液的ph调至6.0，接入热带假丝酵母菌，反应初始od
620
＝5左右，初始通气量0.7vvm，在30℃、300-600rpm条件下培养，do控制在30-50％，ph控制在5.5-6.0，每小时取样测氨基酸含量，结果记载于表1。可见，培养24h时发酵液中l-丙氨酸和l-谷氨酸都被完全利用，而三种支链氨基酸的含量都基本没有下降。离心收集滤液，滤液经截留分子量400da纳滤膜脱色、除盐，减压蒸馏至有大量固体析出，降温过滤，滤饼烘干得bcaa产品，收率达90.2％。
[0050]
表1
[0051][0052]
实施例3
[0053]
热带假丝酵母cicc no.1253与其突变株ibec-16对l-丙氨酸和l-缬氨酸的利用情况试验
[0054]
取一环活化的两种菌分别接入装有100ml ypd培养基的锥形瓶中，置于30℃、220rpm摇床中培养20h。离心收集菌体，然后分别接入摇瓶培养基(l-缬氨酸40g/l，l-丙氨酸30g/l，kh
2
po
4
·
3h
2
o 2.5g/l，mgso
4
·
7h
2
o 1.0g/l，kcl 0.5g/l)中，反应初始od
620
＝10左右，30℃、220rpm培养24小时，ph控制5.5-6.0左右，每8小时取样并采用液相色谱分析反应
液中氨基酸的含量，结果如图1所示。从图1中结果来看，出发菌株cicc no.1253会不同程度地利用l-丙氨酸(l-ala)和l-缬氨酸(l-val)；突变株ibec-16在培养24h过程中基本不会利用l-缬氨酸，并且l-丙氨酸在24h左右被完全利用。
[0055]
实施例4
[0056]
热带假丝酵母突变株ibec-16对氨基酸的降解测试
[0057]
取一环活化的突变株ibec-16接入装有100ml ypd培养基的锥形瓶中，置于30℃、220rpm摇床中培养20h。离心收集菌体，接入摇瓶培养基(l-缬氨酸40g/l，l-异亮氨酸20g/l，l-亮氨酸15g/l，l-丙氨酸30g/l，l-谷氨酸7g/l，kh
2
po
4
·
3h
2
o 2.5g/l，mgso
4
·
7h
2
o 1.0g/l，kcl 0.5g/l)中，反应初始od
620
＝10左右，30℃、220rpm培养24小时，培养过程中每小时取样并控制ph6.0左右，采用液相色谱分析反应液中氨基酸的含量，其结果如附图2所示。从图2中来看，培养24h过程中l-缬氨酸(l-val)、l-异亮氨酸(l-ile)、l-亮氨酸(l-leu)基本没有降解，而l-谷氨酸(l-glu)在4h左右被完全消耗，l-丙氨酸(l-ala)在24h左右被完全利用。
[0058]
实施例5
[0059]
热带假丝酵母突变株ibec-16对bcaa发酵液中氨基酸的利用测试
[0060]
本实施例中所使用的bcaa发酵液通过下述方法获得：按照“l-缬氨酸发酵工艺研究”一文所记载的方法制备l-缬氨酸发酵液，《中国药学会学术年会》，2004。按照“l-异亮氨酸发酵工艺条件的研究”一文所记载的方法制备l-异亮氨酸发酵液，《食品与发酵工业》，2002。按照“l-亮氨酸的发酵中试生产究”一文所记载的方法制备l-亮氨酸发酵液，《现在食品科技》，2010。
[0061]
取一环活化的突变株ibec-16接入装有ypd培养基的锥形瓶中，置于30℃、220rpm摇床中培养16h；按接种量为10％接入含有ypd培养基的50l发酵罐中，初始通气量0.7vvm，在30℃、150-400rpm条件下培养，do控制在20％，ph控制在5.0，培养6h左右。将300l含有bcaa发酵液的ph调至6.0，接入突变株ibec-16(反应初始od＝5左右)，初始通气量0.7vvm，在30℃、200-400rpm条件下培养，do控制在30-50％，ph控制在5.5-6.0，每小时取样测氨基酸的含量，24h结束培养，离心收集滤液，结果如图3所示。从图3中来看，培养24h过程中l-缬氨酸(l-val)、l-异亮氨酸(l-ile)、l-亮氨酸(l-leu)基本没有降解，l-谷氨酸(l-glu)在8h左右被完全消耗，主要是因为发酵液中剩余葡萄糖先被酵母利用，而l-丙氨酸(l-ala)在24h左右被完全利用。
[0062]
实施例6
[0063]
热带假丝酵母突变株ibec-16菌体重复利用试验
[0064]
本实施例中所使用的bcaa发酵液通过下述方法获得：按照“l-缬氨酸高产菌诱变育种的研究”一文所记载的方法制备l-缬氨酸发酵液，《食品与生物技术学报》，2011。
[0065]
将bcaa发酵液的ph调至5.5-6.0，接入回收菌体(反应初始od＝10-12左右)中，在30℃、300-500rpm条件下培养20-22h，do控制在30-50％，ph控制在5.5-6.0，每小时取样测氨基酸的含量，离心收集滤液和菌体，回收酵母菌体参考上述步骤进行重复利用，循环使用酵母去除杂酸结果见表2。
[0066]
从表中结果来看，酵母至少可以重复利用三批次。
[0067]
表3
[0068][0069]
实施例7
[0070]
无机盐对热带假丝酵母突变株ibec-16利用l-丙氨酸的影响
[0071]
取一环活化的突变株ibec-16接入装有100ml ypd培养基的锥形瓶中，置于30℃、220rpm摇床中培养20h。离心收集菌体，分别接入含无机盐和不含无机盐的摇瓶培养基(l-缬氨酸和l-丙氨酸的添加量为60和30g/l)中，无机盐包括kh
2
po
4
·
3h
2
o 2.5g/l、mgso
4
·
7h
2
o 1.0g/l、kcl 0.5g/l，反应初始od
620
＝6左右，30℃、220rpm培养24小时，培养过程中每小时取样并控制ph6.0左右，采用液相色谱分析反应液中氨基酸的含量，其结果如附图4所示。从图4中来看，培养24h过程中l-缬氨酸(l-val)基本没有降解，而添加无机盐的培养基中l-丙氨酸(l-ala)在24h左右已被完全利用，未添加无机盐时则消耗50％左右l-丙氨酸，说明无机盐的存在有利于菌株消耗氨基酸。

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