一种生产尿苷二磷酸葡萄糖的方法及其专用工程菌与流程

[0001]
本发明涉及一种生产尿苷二磷酸葡萄糖的方法及其专用工程菌。


背景技术：

[0002]
尿苷二磷酸葡萄糖，简称udp-萄糖或udpg，广泛分布于微生物、动植物细胞内的核苷酸糖的一种，在生物体内，当各种苷、寡糖、多糖的生物合成时用作葡萄糖的供体。此外，在单糖的互变或糠醛酸生成时作为重要的中间产物，而在碳水化合物代谢中起着中心的作用。
[0003]
尿苷二磷酸葡萄糖的合成方法主要是化学合成、发酵法、酶法转化。化学合成需要对糖基上活性基团进行保护和去保护，催化剂昂贵，反应条件苛刻，而且在反应的过程中使用大量有机溶剂，使得化学合成法总成本偏高，环境不友好。发酵法往往需要很长时间，产率低。由酶法合成尿苷二磷酸葡萄糖主要有两种方法,一是以尿苷三磷酸、葡萄糖-1-磷酸为底物，在相应的焦磷酸化酶作用下生成,如李新亮等以尿苷三磷酸、麦芽糊精为原料，表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶和麦芽糊精磷酸化酶的大肠杆菌作为生物催化剂，通过生物转化生产尿苷二磷酸葡萄糖，38小时最多能生成尿苷二磷酸葡萄糖42.5g，但是反应分两步进行，而且要添加大量压榨酵母，反应时间长生产成本高。另一种生产方法是以尿苷二磷酸为底物，经蔗糖合成酶催化合成尿苷二磷酸葡萄糖，10小时催化84.1mm(39g)尿苷酸二磷酸生成尿苷酸二磷酸葡萄糖40.9g，但是底物成本太高也限制了其工业化生产使用。
[0004]
因此，本领域迫切需要构建高效、安全、工艺简单、成本低的尿苷二磷酸葡萄糖基因工程菌，以满足工业化生产尿苷二磷酸葡萄糖的需求。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的是提供一种生产尿苷二磷酸葡萄糖的方法及其专用工程菌。
[0006]
第一方面，本发明保护功能蛋白质在制备尿苷二磷酸葡萄糖中的应用；所述功能蛋白质包括聚磷酸激酶、蔗糖合成酶和尿苷一磷酸激酶。
[0007]
进一步地，所述聚磷酸激酶来源于gemmobacter sp.lw-1。
[0008]
所述蔗糖合成酶来源于拟南芥、大豆或喜温硫杆菌。
[0009]
所述尿苷一磷酸激酶来源于大肠杆菌。
[0010]
进一步地，所述蔗糖合成酶具体可为如下(b1)或(b2)或(b3)：
[0011]
(b1)由序列表中序列1自n端第343-1150所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0012]
(b2)序列表中序列1自n端第343-1150所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且有相同功能的蛋白质；
[0013]
(b3)来源于拟南芥且与(b1)-(b2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；
[0014]
所述蔗糖合成酶具体可为如下(b4)或(b5)或(b6)：
[0015]
(b4)由序列表中序列3自n端第343-1147所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0016]
(b5)序列表中序列3自n端第343-1147所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且有相同功能的蛋白质；
[0017]
(b6)来源于大豆且与(b4)-(b5)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；
[0018]
所述蔗糖合成酶具体可为下(b7)或(b8)或(b9)：
[0019]
(b7)由序列表中序列5自n端第343-1135所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0020]
(b8)序列表中序列5自n端第343-1135所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且有相同功能的蛋白质；
[0021]
(b9)来源于喜温硫杆菌且与(b7)-(b8)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质。
[0022]
所述聚磷酸激酶具体可为如下(a1)或(a2)或(a3)：
[0023]
(a1)由序列表中序列1自n端第1-342所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0024]
(a2)序列表中序列1自n端第1-342所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且有相同功能的蛋白质；
[0025]
(a3)来源于gemmobacter sp.lw-1且与(a1)-(a2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；
[0026]
所述尿苷一磷酸激酶具体可为如下(c1)或(c2)或(c3)：
[0027]
(c1)由序列表中序列1自n端第1151-1391所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0028]
(c2)序列表中序列1自n端第1151-1391所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且有相同功能的蛋白质；
[0029]
(c3)来源于大肠杆菌且与(b1)-(b2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质。
[0030]
以上任一所述功能蛋白质具体可如序列表的序列1所示。
[0031]
以上任一所述功能蛋白质具体可如序列表的序列3所示。
[0032]
以上任一所述功能蛋白质具体可如序列表的序列5所示。
[0033]
第二方面，本发明保护能够表达以上任一所述功能蛋白质的核酸分子在制备尿苷二磷酸葡萄糖中的应用。
[0034]
所述能够表达以上任一所述功能蛋白质的核酸分子具体可为序列表的序列2所示的dna分子。
[0035]
所述能够表达以上任一所述功能蛋白质的核酸分子具体可为序列表的序列4所示的dna分子。
[0036]
所述能够表达以上任一所述功能蛋白质的核酸分子具体可为序列表的序列6所示的dna分子。
[0037]
第三方面，本发明保护重组菌，是对出发菌进行改造使其能够表达以上任一所述功能蛋白质得到的。
[0038]
所述“对出发菌进行改造使其能够表达以上任一所述功能蛋白质”是通过将核酸分子导入出发菌中实现的；所述核酸分子能够表达以上任一所述功能蛋白质。
[0039]
所述“将核酸分子导入出发菌”具体可通过将含有所述核酸分子的表达载体导入
出发菌实现。
[0040]
所述表达载体具体可为将pbad-hisb载体的xho-和spe-酶切位点间的片段替换为序列2所示的dna分子得到的重组表达载体。
[0041]
所述表达载体具体可为将pbad-hisb载体的xho-和spe-酶切位点间的片段替换为序列4所示的dna分子得到的重组表达载体。
[0042]
所述表达载体具体可为将pbad-hisb载体的xho-和spe-酶切位点间的片段替换为序列6所示的dna分子得到的重组表达载体。
[0043]
所述出发菌具体可为大肠杆菌，更具体可为大肠杆菌bw25113。
[0044]
本发明还保护所述重组菌在制备尿苷二磷酸葡萄糖中的应用。
[0045]
第四方面，本发明保护一种制备尿苷二磷酸葡萄糖的方法，包括如下步骤：以尿苷一磷酸和蔗糖为底物，在以上任一所述重组菌的催化作用下反应得到尿苷二磷酸葡萄糖。
[0046]
所述催化反应体系中包括所述重组菌、尿苷一磷酸、蔗糖、atp、mgcl
2
和polyp。
[0047]
所述催化反应体系中具体可含有浓度为20od/ml的所述重组菌、浓度为100mm的尿苷一磷酸、浓度为1m的蔗糖、浓度为5mm的atp、浓度为20mm的mgcl
2
和浓度为20mm的polyp。
[0048]
所述催化反应程序具体可为37℃、220rpm催化反应6小时。
[0049]
第五方面，本发明保护用于制备尿苷二磷酸葡萄糖的试剂盒，包括尿苷一磷酸、蔗糖和以上任一所述的重组菌。
[0050]
所述试剂盒还包括atp、mgcl
2
和polyp。
[0051]
本发明的主要优点包括：(1)原料易得且成本较低；(2)工艺简单：不需要纯化酶，直接用一种共表达聚磷酸激酶、蔗糖合成酶和尿苷一磷酸激酶的细胞破碎液，在一个反应器内一步反应即可制备尿苷二磷酸葡萄糖，不涉及中间步骤和反映，极大地简化了工艺流程，且设备利用率高。
[0052]
本发明提供了一种生产尿苷二磷酸葡萄糖的方法,包括以下步骤:以尿苷一磷酸和蔗糖为原料,在工程菌的作用下,生产尿苷二磷酸葡萄糖；所述工程菌为表达功能蛋白的重组菌,是将编码所述功能蛋白的基因导入出发菌得到的，所述的功能蛋白包括聚磷酸激酶、尿苷一磷酸激酶和蔗糖合成酶。本发明对于尿苷二磷酸葡萄糖的工业化生产具有重要意义。
附图说明
[0053]
图1为尿苷一磷酸标准品hplc峰图。
[0054]
图2为尿苷二磷酸葡萄糖标准品hplc峰图。
[0055]
图3为利用重组工程菌ty001进行催化反应后的上清液hplc峰图。
[0056]
图4为利用重组工程菌生产尿苷二磷酸葡萄糖原理图。
[0057]
图5为尿苷二磷酸葡萄糖的结构。
[0058]
图6为利用对照重组工程菌进行催化反应后的上清液hplc峰图。
具体实施方式
[0059]
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自
常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0060]
pbad-hisb载体：invitrogen公司，货号:854314de。
[0061]
大肠杆菌bw25113：武汉圣达威科技有限公司，货号：p1466。
[0062]
2yt液体培养基：0.5％(质量百分含量)nacl、1％(质量百分含量)酵母提取物、1.6％(质量百分含量)胰蛋白胨，蒸馏水定容。
[0063]
尿苷二磷酸葡萄糖标准品：北京中原合聚经贸有限公司，货号：ab120384。
[0064]
尿苷二磷酸葡萄糖的结构如图5所示。
[0065]
gemmobacter sp.lw-1记载于文献：kumaresan d,wischer d,murrell j c.draft genome sequences of facultative methylotrophs,gemmobacter sp.strain lw1and mesorhizobium sp.strain 1m-11,isolated from movile cave,romania.[j].genome announcements,2015,3(6).。
[0066]
实施例1、重组表达载体的构建
[0067]
1、将pbad-hisb载体的xho-和spe-酶切位点间的片段替换为序列2所示的dna分子，得到重组表达载体pbad-gs-at-ec-1(已经测序验证)。
[0068]
序列表的序列2中，自5
’
端第1-1029位编码来源于gemmobacter sp.lw-1的聚磷酸激酶，第1041-3467位编码来源于拟南芥arabidopsis thaliana的蔗糖合成酶，第3479-4204位编码来源于大肠杆菌escherichia coli的尿苷一磷酸激酶。
[0069]
序列表的序列2所示的dna分子编码序列1所示的蛋白质。序列表的序列1中，自n端第1-342位为来源于gemmobacter sp.lw-1的聚磷酸激酶，第343-1150位为来源于拟南芥arabidopsis thaliana的蔗糖合成酶，第1151-1391位为来源于大肠杆菌escherichia coli的尿苷一磷酸激酶。
[0070]
2、将pbad-hisb载体的xho-和spe-酶切位点间的片段替换为序列4所示的dna分子，得到重组表达载体pbad-gs-gm-ec-2(已经测序验证)。
[0071]
序列表的序列4中，自5
’
端第1-1029位编码来源于gemmobacter sp.lw-1的聚磷酸激酶，第1041-3458位编码来源于大豆glycine max的蔗糖合成酶，第3470-4195位编码来源于大肠杆菌escherichia coli的尿苷一磷酸激酶。
[0072]
序列表的序列4所示的dna分子编码序列3所示的蛋白质。序列表的序列3中，自n端第1-342位为来源于gemmobacter sp.lw-1的聚磷酸激酶，第343-1147位为来源于大豆glycine max的蔗糖合成酶，第1148-1388位为来源于大肠杆菌escherichia coli的尿苷一磷酸激酶。
[0073]
2、将pbad-hisb载体的xho-和spe-酶切位点间的片段替换为序列6所示的dna分子，得到重组表达载体pbad-gs-ac-ec-3(已经测序验证)。
[0074]
序列表的序列6中，自5
’
端第1-1029位编码来源于gemmobacter sp.lw-1的聚磷酸激酶，第1041-3422位编码来源于喜温硫杆菌acidithiobacillus caldus的蔗糖合成酶，第3434-4159位编码来源于大肠杆菌escherichia coli的尿苷一磷酸激酶。
[0075]
序列表的序列6所示的dna分子编码序列5所示的蛋白质。序列表的序列5中，自n端第1-342位为来源于gemmobacter sp.lw-1的聚磷酸激酶，第343-1135位为来源于喜温硫杆菌acidithiobacillus caldus的蔗糖合成酶，第1136-1376位为来源于大肠杆菌
escherichia coli的尿苷一磷酸激酶。
[0076]
实施例2、重组工程菌的制备
[0077]
1、将实施例1制备的重组表达载体pbad-gs-at-ec-1导入大肠杆菌bw25113，得到重组工程菌ty001。
[0078]
2、将实施例1制备的重组表达载体pbad-gs-gm-ec-2导入大肠杆菌bw25113，得到重组工程菌ty002。
[0079]
3、将实施例1制备的重组表达载体pbad-gs-ac-ec-3导入大肠杆菌bw25113，得到重组工程菌ty003。
[0080]
4、将pbad-hisb载体导入大肠杆菌bw25113，得到对照重组工程菌。
[0081]
实施例3、利用重组工程菌生产尿苷二磷酸葡萄糖
[0082]
合成原理如图4所示。
[0083]
一、利用重组工程菌ty001生产尿苷二磷酸葡萄糖
[0084]
1、实施例2制备的重组工程菌ty001接种至含有50μg/ml链霉素的2yt液体培养基中，37℃、220rpm培养至od为0.8，向培养体系中加入阿拉伯糖(上海源叶生物科技有限公司,货号：s11032)(阿拉伯糖在培养体系中的浓度为0.2mm)，30℃、220rpm诱导培养16小时后，收集培养体系，4℃、8000rpm/min离心10min，收集菌体沉淀。
[0085]
2、采用50mm柠檬酸钠缓冲液(ph5.5)重悬步骤1得到的菌体沉淀，超声(功率195w)破碎10min，然后加入尿苷一磷酸、蔗糖、atp、mgcl
2
和polyp配置催化反应体系；反应体系中含有浓度为20od/ml的菌体(细胞)、浓度为100mm的尿苷一磷酸(北京普益华科技有限公司,货号:u820323)、浓度为1m的蔗糖、浓度为5mm的atp、浓度为20mm的mgcl
2
和浓度为20mm的polyp(上海阿拉丁生化科技股份有限公司,货号:s108858)。
[0086]
3、将步骤2的催化反应体系在37℃、220rpm催化反应6小时。
[0087]
4、完成步骤3后，将催化反应体系4℃、12000rpm/min离心5min，取上清。用0.22μm的滤膜过滤上清，收集滤液进行hplc检测尿苷二磷酸葡萄糖的产量。
[0088]
hplc采用ymc triart c18柱，流动相：50mm k
2
hpo
4-kh
2
po
4
(ph6.8)，流速为0.45ml/min，柱温40℃，进样5μl，检测波长260nm。
[0089]
尿苷一磷酸标准品(北京普益华科技有限公司,货号:u820323)的保留时间为7.514min(图1)。
[0090]
尿苷二磷酸葡萄糖标准品的保留时间为8.047min(图2)。
[0091]
利用重组工程菌ty001进行催化反应后的上清液检测结果如图3所示。
[0092]
结果显示，上清液中也有保留时间为8.066的峰值，表明采用尿苷一磷酸为底物生成了尿苷二磷酸葡萄糖。
[0093]
二、三种重组工程菌尿苷二磷酸葡萄糖产量
[0094]
分别采用实施例2制备的重组工程菌ty001、重组工程菌ty002和重组工程菌ty003按照步骤一的方法进行检测。实验设置三次重复，取平均值。
[0095]
结果显示，重组工程菌ty001催化100mm尿苷一磷酸生成尿苷二磷酸葡萄糖59.66mm(33g/l)，ty002催化100mm尿苷一磷酸生成尿苷二磷酸葡萄糖55.68mm(31g/l)，ty003催化100mm尿苷一磷酸生成尿苷二磷酸葡萄糖20mm(11.3g/l)。重组工程菌ty001转化能力最强，转化率最高。
[0096]
将实施例二制备的对照重组工程菌按照步骤一的方法进行检测。结果显示产物中没有得到尿苷二磷酸葡萄糖。结果如图6所示。

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