木霉属丝状菌突变株和蛋白质的制造方法与流程

[0001]
本发明涉及蛋白质制造能力提高了的木霉属丝状菌的突变株和使用该突变株的蛋白质的制造方法。


背景技术：

[0002]
已知木霉属丝状菌具有高的蛋白质制造能力，到目前为止已经进行了使用相同丝状菌的蛋白质的制造的研究。木霉属丝状菌以纤维素、乳糖、纤维二糖等作为诱导剂，在蛋白质之中特别是制造被分类为糖化酶的纤维素酶。
[0003]
为了纤维素酶制造量的进一步提高、特别是强化在糖化酶中所占的比例也低的β-葡糖苷酶制造量，进行了利用基因改变的研究。其中，进行了控制纤维素酶制造的因子的过表达、缺损。
[0004]
非专利文献1中，在控制木霉属丝状菌的纤维素酶的制造的因子之中，通过使作为抑制纤维素酶的制造的转录因子的cre1的功能降低，获得了具有高的纤维素酶制造能力的木霉属丝状菌的突变株。
[0005]
另一方面，还已知基因的改变降低纤维素酶的生产量，非专利文献2中记载了在使里氏木霉的糖转运蛋白缺损的情况下，使用乳糖、纤维素作为诱导剂时的纤维素酶的生产量降低。
[0006]
现有技术文献
[0007]
非专利文献
[0008]
非专利文献1:juliano p,single nucleotide polymorphism analysis of a trichoderma reesei hyper-cellulolytic mutant developed in japan,bioscience,biotechnology,and biochemistry,volume 77,2013,issue 3,p534-543
[0009]
非专利文献2:porciuncula jde,identification of major facilitator transporters involved in cellulase production during lactose culture of trichoderma reesei pc-3-7.biosci biotechnol biochem.77,1014-1022(2013).


技术实现要素：

[0010]
发明要解决的课题
[0011]
如上所述，控制木霉属丝状菌的蛋白质制造的转录因子已经被阐明，但考虑这不过是控制机制的一部分。因此本发明中，以探索控制木霉属丝状菌的蛋白质制造的新机制，获得蛋白质制造能力被强化了的木霉属丝状菌的突变株和提供使用该木霉属丝状菌的突变株的蛋白质的制造方法为课题。
[0012]
用于解决课题的手段
[0013]
本发明者考虑，如果能够特定可以通过基因的改变来增加蛋白质的生产量的基因，则能够进一步提高木霉属丝状菌的蛋白质的制造量，因而进行了深入研究，结果发现，培养通过基因的改变而使包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的功能降低而得的木霉属
for biotechnology information的censerved domain architecture retrieval tool(保守结构域功能区检索工具)，公开了从n末端侧起第26位～第499位的氨基酸残基具有糖(及其他)转运蛋白结构域。由该记载推定包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽至少参与菌体的内侧与外侧之间的糖的运输。本发明中，包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的功能降低了是指，编码egr44419的基因中具有突变。
[0027]
本发明中，包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的功能的降低，表示编码序列号2所示的氨基酸序列的碱基序列发生突变，从而该多肽的功能降低、或功能缺损的状态。另外，除了编码序列号2所示的氨基酸序列的碱基序列以外的碱基序列发生突变，引起包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的表达量降低或表达消失的情况，也包括在包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的功能的降低中。碱基序列的突变由碱基的替换、缺失、插入、重复等引起。
[0028]
作为编码包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的基因的具体例，可列举序列号1所示的碱基序列。
[0029]
作为使包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的功能降低的方法，可列举糖(及其他)转运蛋白结构域的全部缺损、糖(及其他)转运蛋白结构域的一部分缺损、糖(及其他)转运蛋白结构域的立体结构的变化、或导入使包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽全部缺损那样的突变的方法。另外，通过导入使包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的表达量的降低或表达消失的突变也能够使该多肽的功能降低。
[0030]
糖(及其他)转运蛋白结构域的缺损是指该结构域全部消失、一部分消失、全部变成不同的氨基酸、一部分变成不同的氨基酸、或这些的组合。更具体地，是指在序列号2所示的氨基酸序列中，与上述所示的糖(及其他)转运蛋白结构域的氨基酸序列的序列同一性变为80％以下，优选为50％以下，进一步优选为20％以下，进一步优选为10％以下，进一步优选为5％以下，进一步优选为3％以下，进一步优选为1％以下，最优选为0％。
[0031]
本发明中，作为通过位于糖(及其他)转运蛋白结构域内的氨基酸序列中发生缺失、替换、或添加等突变从而包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的功能降低的具体例，可列举在序列号1所示的碱基序列中第1415位插入11个碱基的移码突变。推测通过该突变，从而在序列号2所示的氨基酸序列的419位翻译终止，由此构成糖(及其他)转运蛋白结构域的氨基酸序列变短，本来的功能降低。
[0032]
糖(及其他)转运蛋白结构域的全部缺损、糖(及其他)转运蛋白结构域的一部分缺损、包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的全部缺损，可以对编码包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的基因序列通过利用碱基的缺失、插入、替换等实现的移码、终止密码子突变来进行。
[0033]
另外，包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的表达量的降低或表达的消失，可以通过编码序列号2所示的氨基酸序列的基因的启动子、终止子区域的突变来进行。一般地，启动子和终止子区域相当于参与转录的基因的前后数百碱基的区域，作为包含参与包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的转录的启动子和终止子的碱基序列的具体例，可列举序列号7所示的碱基序列。
[0034]
上述基因的突变导入可以使用对于本领域技术人员来说公知的利用诱变剂或紫外线照射等的突变处理、使用选择标志物的同源重组等基因重组、或者利用转座子的突变
等现有的基因突变方法。
[0035]
本发明的木霉属丝状菌的突变株与包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的功能未降低的木霉属丝状菌相比蛋白质的制造能力提高。如果培养本发明的木霉属丝状菌的突变株，则与包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的功能未降低的木霉属丝状菌的培养液相比，蛋白浓度增加。另外，在蛋白质是酶的情况下，酶的比活性增加。这里，蛋白质浓度的增加率、酶的比活性的增加率只要增加就不特别限定，优选为20％以上。
[0036]
本发明的木霉属丝状菌的突变株除了包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的功能降低以外，还可以具有蛋白质制造量提高的基因突变。具体地，可列举序列号8所示的多肽的功能降低的基因突变。包含序列号8所示的氨基酸序列的多肽是里氏木霉所具有的多肽，在national center for biotechnology information(ncbi，美国国家生物信息中心)中，也作为里氏木霉(trichoderma reesei)qm6a株所具有的预测蛋白(predicted protein)(egr50654)登记。包含序列号8所示的氨基酸序列的多肽是功能未知的多肽，但根据national center for biotechnology information的censerved domain architecture retrieval tool(保守结构域功能区检索工具)，公开了从n末端侧起第95位～第277位的氨基酸残基具有“middle domain of eukaryotic initiation factor 4g结构域(真核起始因子4g的中间结构域)”(以后记载为mif4g结构域)，从n末端侧起第380位～第485位的氨基酸残基具有ma-3结构域。已知mif4g和ma-3这两个结构域具有与dna或rna结合的功能(biochem.44,12265-12272(2005)，mol.cell.biol.1,147-156(2007))。根据这些记载推定包含序列号8所示的氨基酸序列的多肽至少具有与dna和/或rna结合的功能。
[0037]
作为编码包含序列号8所示的氨基酸序列的多肽的基因的具体例，可列举序列号9所示的碱基序列。作为egr50654的功能降低的基因突变，可列举egr50654所具有的mif4g结构域和/或ma-3结构域的全部缺损、mif4g结构域和/或ma-3结构域的一部分缺损、mif4g结构域与ma-3结构域的立体构型关系变化的基因突变。进而，通过导入使包含序列号8所示的氨基酸序列的多肽的表达量降低、消失的突变也能够使该多肽的功能降低。作为包含序列号8所示的氨基酸序列的多肽的功能缺损的具体例，可列举在序列号9所示的碱基序列中第1039位至第1044位的任一碱基缺失的突变。
[0038]
另外，本发明涉及蛋白质的制造方法，包括培养所述包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的功能降低了的木霉属丝状菌的突变株的工序。
[0039]
本发明中制造的蛋白质不特别限制，能够有效地制造被分泌到菌体外的蛋白质，其中优选为酶，更优选为纤维素酶、淀粉酶、转化酶、几丁质酶、果胶酶等糖化酶，特别优选为纤维素酶。
[0040]
本发明中制造的纤维素酶包含各种水解酶，包含具有对木聚糖、纤维素、半纤维素的分解活性的酶等。作为具体例，可列举通过水解纤维素链来制造纤维二糖的纤维二糖水解酶(ec 3.2.1.91)、从纤维素链的中央部分开始水解的内切葡聚糖酶(ec 3.2.1.4)、水解纤维寡糖和纤维二糖的β-葡糖苷酶(ec 3.2.1.21)、以作用于半纤维素特别是木聚糖为特征的木聚糖酶(ec 3.2.1.8)、水解木寡糖的β-木糖苷酶(ec 3.2.1.37)等。如前所述，用于确认本发明的木霉属丝状菌的突变株的蛋白质制造能力的提高的纤维素酶的比活性的提高的确认，通过这些水解酶的比活性的任一者提高来确认。本发明中制造的纤维素酶中，这些酶中特别是β-葡糖苷酶活性提高。
[0041]
β-葡糖苷酶比活性通过以下方法测定。首先，在含有1mmp-硝基苯基-β-吡喃葡萄糖苷(
シグマアルドリッチジャパン
合同会社制)的50mm醋酸缓冲液90μl中添加酶稀释液10μl，在30℃使其反应10分钟。接着加入2m碳酸钠10μl充分混合使反应停止，测定405nm的吸光度的增加。最后以每1分钟游离1μmol的p-硝基苯酚的活性作为1u，以此除以蛋白质的量，从而计算出比活性。
[0042]
β-木糖苷酶比活性通过以下方法测定。首先，在含有1mmp-硝基苯基-β-吡喃木糖苷(
シグマアルドリッチジャパン
合同会社制)的50mm醋酸缓冲液90μl中添加酶稀释液10μl，在30℃使其反应30分钟。接着，加入2m碳酸钠10μl充分混合使反应停止，测定405nm的吸光度的增加。最后以每1分钟游离1μmol的p-硝基苯酚的活性作为1u，计算出比活性。
[0043]
纤维二糖水解酶比活性通过以下的方法测定。首先，在含有1mmp-硝基苯基-β-吡喃乳糖苷(
シグマアルドリッチジャパン
合同会社制)的50mm醋酸缓冲液90μl中添加酶稀释液10μl，在30℃使其反应60分钟。接着然后，加入2m碳酸钠10μl充分混合使反应停止，测定405nm的吸光度的增加。最后，以每1分钟游离1μmol的p-硝基苯酚的活性作为1u，以此除以蛋白质的量，从而计算出比活性。
[0044]
培养工序的培养基组成只要形成里氏木霉能够制造蛋白质那样的培养基组成就不特别限制，可以采用木霉属细菌的周知的培养基组成。作为氮源，可使用例如，多聚胨、肉汁、csl、大豆粕等。此外，该培养基中可以添加用于制造蛋白质的诱导物质。
[0045]
在通过本发明制造纤维素酶的情况下，可以用在培养基中包含选自由乳糖、纤维素和木聚糖组成的组中的至少1种或2种以上的诱导剂的培养基进行培养。另外，纤维素、木聚糖可以添加包含纤维素、木聚糖的生物质作为诱导物质。作为含有纤维素、木聚糖的生物质的具体例，可以使用种子植物、蕨类植物、苔藓植物、藻类、水草等植物、以及废建材等。种子植物分类为裸子植物和被子植物，任一种都优选使用。被子植物进一步分类为单子叶植物和双子叶植物，作为单子叶植物的具体例，可列举甘蔗渣、柳枝稷、象草、蔗茅、玉米秸(玉米的茎叶)、玉米棒(玉米的芯)、稻秸、麦秸等，作为双子叶植物的具体例，优选使用甜菜浆、桉树、栎树、白桦等。
[0046]
另外，包含纤维素、木聚糖的生物质可以使用进行了前处理的。前处理方法不特别限定，可以使用例如，酸处理、硫酸处理、稀硫酸处理、碱处理、水热处理、亚临界处理、微粉碎处理、蒸煮处理等公知的手法。作为进行了这样的前处理的包含纤维素、木聚糖的生物质，可以使用浆。
[0047]
此外，非专利文献2中记载，在培养使里氏木霉的糖转运蛋白缺损了的突变株时，如果使用乳糖作为诱导剂，则纤维素酶的生产量降低，但本发明的木霉属丝状菌的突变株在以乳糖作为诱导剂进行培养的情况下，蛋白质的生产量提高，纤维素酶的各种比活性也提高。
[0048]
本发明的木霉属丝状菌的突变体的培养方法不特别限定，可以通过例如使用离心管、烧瓶、罐式发酵罐、罐等的液体培养、使用平板等的固体培养等进行培养。里氏木霉优选在需氧条件下培养，在这些培养方法中，特别优选在罐式发酵罐、罐内一边进行通气、搅拌一边培养的深层培养。通气量优选为0.1vvm～2.0vvm左右，更优选为0.3vvm～1.5vvm，特别优选为0.5vvm～1.0vvm。培养温度优选为25℃～35℃左右，更优选为25℃～31℃。培养中的ph条件优选为ph3.0～7.0，更优选为ph4.0～6.0。培养时间进行到在能生产蛋白质的条件
下回收的量的蛋白质积累。通常为24小时～240小时左右，更优选为36小时～192小时。
[0049]
对培养木霉属丝状菌的突变体而得的培养液所包含的蛋白质进行回收的方法不特别限定，可以从培养液中除去木霉属丝状菌的菌体，回收蛋白质。作为菌体的除去方法，可列举离心分离法、膜分离法、压滤法等为例。
[0050]
另外，在不从培养木霉属丝状菌的突变体而得的培养液除去菌体而制成蛋白质的溶解液利用的情况下，优选进行处理使得木霉属丝状菌的菌体在培养液中不能生长。作为进行处理使得菌体不能生长的方法，可列举热处理、药剂处理、酸/碱处理、uv处理等。
[0051]
在蛋白质是酶的情况下，可以将如上所述除去菌体或进行处理使得菌体不生长而得的培养液直接作为酶液利用。
[0052]
培养本发明的包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的功能降低了的木霉属丝状菌的突变株而得的纤维素酶，与培养该多肽的功能未降低的木霉属丝状菌而得的纤维素酶相比，纤维素酶的各种比活性高，特别是β-葡糖苷酶的比活性高，因而能够有效地分解含纤维素的生物质，获得葡萄糖浓度高的糖化液，能够获得更多的糖。此外，将含纤维素的生物质糖化、制造糖的方法不特别限定。糖化反应可以以分批式进行，也可以以连续式进行。
[0053]
糖化反应的条件不特别限定，但糖化反应的温度优选为25～60℃的范围，特别更优选为30～55℃的范围。糖化反应的时间优选为2小时～200小时的范围。糖化反应的ph优选为ph3.0～7.0的范围，进一步优选ph4.0～6.0的范围。在木霉属来源的纤维素酶的情况下，其反应最适ph为5.0。进而，由于在水解的过程中发生ph的变化，因此优选在反应液中添加缓冲液，或者使用酸、碱一边保持一定ph一边实施。
[0054]
另外，可以从含纤维素的生物质的糖化所得的糖化液中分离回收所使用的酶组合物。分离回收酶组合物的方法不特别限定，可以将糖化液用超滤膜等过滤，在非透过侧回收。也可以根据需要作为过滤的前工序，预先从糖化液中除去固体成分。回收的纤维素酶可以再次用于糖化反应。
[0055]
实施例
[0056]
以下列举实施例具体说明本发明。
[0057]
＜参考例1＞蛋白质浓度测定方法
[0058]
使用蛋白质浓度测定试剂(quick start bradford
プロテインアッセイ
、bio-rad社制)。在恢复室温的蛋白质浓度测定试剂250μl中添加稀释了的丝状菌的培养液5μl，用酶标仪测定室温静置5分钟后的595nm的吸光度。作为标准品使用bsa，根据标准曲线计算出蛋白质浓度。
[0059]
＜参考例2＞纤维素酶的比活性的测定方法
[0060]
(β-葡糖苷酶比活性测定方法)
[0061]
在含有1mmp-硝基苯基-β-吡喃葡萄糖苷(
シグマアルドリッチジャパン
合同会社制)的50mm醋酸缓冲液90μl中添加酶稀释液10μl，在30℃使其反应10分钟。然后加入2m碳酸钠10μl充分混合使反应停止，测定405nm的吸光度的增加。将每1分钟游离1μmol的p-硝基苯酚的活性定义为1u，以此除以蛋白质的量，从而计算出比活性。
[0062]
(β-木糖苷酶比活性测定方法)
[0063]
在含有1mmp-硝基苯基-β-吡喃木糖苷(
シグマアルドリッチジャパン
合同会社制)的50mm醋酸缓冲液90μl中添加酶稀释液10μl，在30℃使其反应30分钟。然后，加入2m碳酸钠
10μl充分混合使反应停止，测定405nm的吸光度的增加。将每1分钟游离1μmol的p-硝基苯酚的活性定义为1u，以此除以蛋白质的量，从而计算出比活性。
[0064]
(纤维二糖水解酶比活性测定方法)
[0065]
在含有1mmp-硝基苯基-β-吡喃乳糖苷(
シグマアルドリッチジャパン
合同会社制)的50mm醋酸缓冲液90μl中添加酶稀释液10μl，在30℃使其反应60分钟。然后，加入2m碳酸钠10μl充分混合使反应停止，测定405nm的吸光度的增加。将每1分钟游离1μmol的p-硝基苯酚的活性定义为1u，以此除以蛋白质的量，从而计算出比活性。
[0066]
＜参考例3＞含纤维素的生物质的糖化试验
[0067]
作为成为糖化对象的生物质，使用木材原料粉末纤维素arbocel(注册商标)b800(
レッテンマイヤー
社制)或粉末化成平均粒径100μm的甘蔗渣。作为酶液，采集里氏木霉或里氏木霉的突变株的培养液1ml进行离心分离，回收除去菌体后的上清，进而用0.22μm的过滤器进行过滤，使用过滤而得的滤液。此外，木材原料粉末纤维素arbocel(注册商标)b800(
レッテンマイヤー
社制)以后有时记载为arbocel b800。
[0068]
(糖化反应)
[0069]
糖化反应如下进行。在2ml管中加入arbocel(注册商标)b800或粉末化成平均粒径100μm的甘蔗渣、和终浓度0.1m的醋酸钠缓冲液(ph5.2)，加入纯水使得固体成分浓度在反应开始时在使用arbocel(注册商标)b800时为8重量％、在使用甘蔗渣时为10重量％。进而，添加酶液，使用加热模块转子在50℃的反应条件下开始反应。将24小时糖化反应后的样品在10000
×
g的条件下进行10分钟离心分离，分取上清，添加上清的体积的10分之1量的1n氢氧化钠水溶液，使糖化反应停止。将反应停止后的糖化液中的糖浓度进行下述所示的利用uplc的糖分析。糖化反应中使用的酶液，根据培养液的蛋白质浓度、和比活性，以符合各实施例或比较例的条件的方式计算出添加量而使用。
[0070]
(糖浓度的测定)
[0071]
葡萄糖、木糖、纤维二糖使用acquity(注册商标)uplc系统(waters)在以下条件进行定量分析。
[0072]
以用葡萄糖、木糖、纤维二糖的标准品制作的标准曲线为基础，进行定量分析。在纤维二糖为低于1g/l的值的情况下，作为检测限以下。
[0073]
柱：aquity(注册商标)uplc beh amide 1.7μm2.1
×
100mm column
[0074]
分离法：hilic
[0075]
移动相：制成移动相a：80％乙腈、0.2％tea水溶液，移动相b：30％乙腈、0.2％tea水溶液，按照下述梯度。梯度制成达到与下述时间对应的混合比的线性梯度。
[0076]
开始条件：(a99.90％、b0.10％)、开始2分后：(a96.70％、b3.30％)、开始3.5分后：(a95.00％、b5.00％)、开始3.55分后：(a99.90％、b0.10％)、开始6分后：(a99.90％、b0.10％)。
[0077]
检测方法：elsd(蒸发光散射检测器)
[0078]
流速：0.3ml/min
[0079]
温度：55℃。
[0080]
＜实施例1＞包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的功能降低了的里氏木霉qm9414突变株i的制作
[0081]
包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的功能降低了的里氏木霉的突变株如下制作。作为包含编码包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的功能降低了的包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的基因的dna片段，制作了包含序列号3所示的基因序列的dna片段，将该dna片段转化到里氏木霉qm9414株中，从而制作。通过该方法，得到了具有在序列号1中在第1415位插入11个碱基、在序列号2中在第419位翻译终止的多肽的里氏木霉的突变株。作为用于dna片段导入的选择标志物，使用乙酰胺和能够分解乙酰胺的乙酰胺酶(amds)基因(amds)。为了在包含amds的dna序列的上游和下游导入包含上述含序列号3所示的碱基序列的dna片段，以添加与里氏木霉qm9414株的基因序列同源的部分的方式制作突变导入用质粒。
[0082]
具体地，以将序列号4所示的合成的dna片段用限制性酶aflii与noti处理而得的dna片段作为上游dna片段。另外，使用按照常规方法从里氏木霉qm9414株提取出的基因组dna、和序列号5和6所示的寡聚dna进行pcr，以将所得的扩增片段用限制性酶mlui与swai处理而得的dna片段作为下游dna片段，将上游和下游dna片段分别使用aflii与noti、mlui与swai的限制性酶导入到插入有amds的质粒中，构建突变导入用质粒。然后，将突变导入用质粒用限制性酶paci与asci处理，用序列号3所示的得到的dna片段转化里氏木霉qm9414株(nbrc#31329)。分子生物学的手法如molecular cloning，laboratory manual，1st，2nd，3rd(1989)记载的那样进行。另外，转化使用作为标准手法的原生质体-peg法，具体如gene，61，165-176(1987)所记载的那样进行。将所得的里氏木霉突变株作为qm9414突变株i，在以下的实验中使用。
[0083]
＜实施例2＞使用qm9414突变株i的蛋白质的制造试验
[0084]
(烧瓶培养)
[0085]
将实施例1中制作的qm9414突变株i的孢子用生理盐水稀释为1.0
×
10
7
/ml，将该稀释孢子溶液0.1ml接种到表1或表2所示的加入到50ml带挡板的烧瓶中的10ml的烧瓶培养基中，利用振荡培养机以28℃、120rpm的条件进行120小时培养。培养液中所含的蛋白质浓度通过参考例1所述的方法测定，纤维素酶的各种比活性通过参考例2所述的方法测定。将用表1的培养基培养时的结果示于表3，将用表2的培养基培养时的结果示于表4。
[0086]
表1
[0087][0088]
*5
×マルデルス
溶液包含7g/l(nh
4
)
2
so
4
、10g/l kh
2
po
4
、2g/l cacl
2
·
2h
2
o、1.5g/
l mgso
4
·
7h
2
o。
[0089]
**10
×
酒石酸铵溶液包含92g/l酒石酸铵。
[0090]
*＊*微量元素溶液包含0.3g/l h
3
bo
3
、1.3g/l(nh
4
)
6
mo
7
o
24
·
4h
2
o、5g/l fecl
3
·
6h
2
o、2g/l cuso
4
·
5h
2
o、0.4g/l mncl
2
·
4h
2
o、10g/l zncl
2
。
[0091]
表2
[0092][0093]
(培养液的采集)
[0094]
在培养开始120小时之后采集1ml培养液。将培养液在15000
×
g、4℃的条件下进行10分钟离心分离，获得上清。将该上清用0.22μm的过滤器过滤，以其滤液作为纤维素酶溶液，在以下实验中使用。
[0095]
(蛋白质浓度和纤维素酶的各种比活性的测定)
[0096]
使用参考例1中记载的手法，测定培养开始第120小时的培养液中的蛋白质浓度，接着用参考例2中记载的方法测定纤维素酶的比活性。结果示于表3和表4。
[0097]
＜实施例3＞包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的功能降低了的里氏木霉qm9414突变株ii的制作
[0098]
包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的功能降低了的里氏木霉的突变株如下制作：制作包含序列号10所示的基因序列的dna片段，将该dna片段转化到里氏木霉qm9414株中。通过该方法，得到了在序列号1中在第435位与第436位之间插入了amds、序列号2的功能降低了的里氏木霉的突变株。为了在包含amds的dna序列的上游和下游导入包含上述序列号10所示的碱基序列的dna片段，以添加与里氏木霉qm9414株的基因序列同源的部分的方式制作突变导入用质粒。
[0099]
具体地，使用按照常规方法从里氏木霉qm9414株提取出的基因组dna、和序列号11和12所示的寡聚dna进行pcr，以将得到的扩增片段用限制性酶aflii与noti处理而得的dna片段作为上游片段。另外，使用基因组dna、和序列号13和14所示的寡聚dna进行pcr，以将所得的扩增片段用限制性酶mlui与sphi处理而得的dna片段作为下游片段，将上游和下游dna片段分别使用aflii与noti、mlui与sphi的限制性酶导入到插入有amds的质粒中，构建突变导入用质粒。然后，将突变导入用质粒用限制性酶aflii与sphi处理，用序列号10所示的得到的dna如实施例1所记载那样对里氏木霉qm9414株进行转化。以所得的里氏木霉突变株作为qm9414突变株ii，在以下的实验中使用。
[0100]
＜实施例4＞使用qm9414突变株ii的蛋白质的制造试验
[0101]
除了代替实施例1中制作的qm9414突变株i使用qm9414突变株ii以外，通过与实施例2同样的操作、条件进行培养，测定培养液中所包含的蛋白质浓度、和纤维素酶的各种比活性。结果示于表3和表4。
[0102]
＜比较例1＞使用里氏木霉qm9414株的蛋白质的制造试验
[0103]
除了代替实施例1中制作的qm9414突变株i使用里氏木霉qm9414株以外，通过与实施例2同样的操作、条件进行培养，通过与实施例2同样的方法测定培养液中所含的蛋白质浓度和纤维素酶的各种比活性。将用表1的培养基培养时的结果示于表3，将用表2的培养基培养时的结果示于表4。
[0104]
表3
[0105][0106]
表4
[0107][0108]
根据实施例2、实施例4和比较例1的结果，在使用表1所示的培养基的培养中，在以培养里氏木霉qm9414株而得的培养液中所含的蛋白质浓度作为1的情况下，qm9414突变株i的培养液中所含的蛋白质浓度的相对值为1.5、qm9414突变株ii的培养液中所含的蛋白质浓度的相对值为1.3。由这些结果可知，通过培养使包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的功能降低了的里氏木霉，从而与不降低该多肽的功能的情况相比，能够提高蛋白质的制造量。
[0109]
进而，对于实施例2、实施例4和比较例1中得到的培养液，通过参考例2所述的方法
测定了纤维素酶的比活性。其结果是，在以培养里氏木霉qm9414株而得的培养液的各种比活性作为1的情况下，β-葡糖苷酶比活性为qm9414突变株i：1.9、qm9414突变株ii：1.7，β-木糖苷酶比活性为qm9414突变株i：1.3、qm9414突变株ii：1.9，纤维二糖水解酶比活性为qm9414突变株i：1.3、qm9414突变株ii：1.1。由这些结果可知，培养序列号2所示的氨基酸序列所示的多肽的功能降低了的里氏木霉突变株而得的纤维素酶，与不使该多肽的功能降低的情况相比，不仅所生产的蛋白质的量提高，而且得到了纤维素酶的各种比活性也提高这样的预料外的效果。
[0110]
另外，在利用表2所示的使用了乳糖的培养基的培养中，在以培养qm9414株而得的培养液中所含的蛋白质浓度作为1的情况下，qm9414突变株i的培养液中所含的蛋白质浓度的相对值为1.7、qm9414突变株ii的培养液中所含的蛋白质浓度的相对值为1.4。由这些结果可知，通过培养使包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的功能降低了的里氏木霉，从而与不使该多肽的功能降低的情况相比，能够提高蛋白质的制造量。
[0111]
进而，分别对于得到的培养液，通过参考例2所述的方法测定了纤维素酶的比活性。其结果是，在以培养qm9414株的培养液的各种比活性作为1的情况下，β-葡糖苷酶比活性为qm9414突变株i：4.3、qm9414突变株ii：1.6，β-木糖苷酶比活性为qm9414突变株i：2.5、qm9414突变株ii：1.2，纤维二糖水解酶比活性为qm9414突变株i：3.5、qm9414突变株ii：1.1。由这些结果可知，培养序列号2所示的氨基酸序列所示的多肽的功能降低了的里氏木霉突变株而得的纤维素酶，与不使该多肽的功能降低的情况相比，不仅所生产的蛋白质的量提高，而且得到了纤维素酶的各种比活性也提高这样的预料外的效果。另外，由这些结果可知，如果将包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的功能降低了的qm9414突变株i用添加了乳糖的培养基进行培养，则与用添加了纤维素的培养基进行培养的情况相比，纤维素酶的各种比活性进一步提高。
[0112]
＜实施例5＞使用qm9414突变株i的纤维素酶的糖化反应试验
[0113]
使用实施例2中得到的qm9414突变株i的使用表1所示的培养基的从培养开始第120小时的培养液，按照表5和参考例3所记载的操作、条件，进行含纤维素的生物质的糖化反应试验。作为含纤维素的生物质，使用arbocel(注册商标)b800或粉末甘蔗渣。结果示于表6。
[0114]
表5
[0115][0116]
表6
[0117][0118]
＜实施例6＞使用qm9414突变株ii的纤维素酶的糖化反应试验1
[0119]
使用实施例4中得到的qm9414突变株ii的培养液中用表1所记载的培养基培养时从培养开始第120小时的培养液，按照参考例3所记载的操作、条件进行含纤维素的生物质的糖化反应试验。arbocel(注册商标)b800的糖化反应的反应条件示于表7，粉末甘蔗渣的糖化反应的反应条件示于表8。结果示于表9。
[0120]
表7
[0121][0122]
表8
[0123][0124]
表9
[0125][0126]
＜比较例2＞使用里氏木霉qm9414株的纤维素酶的糖化反应试验1
[0127]
除了使用比较例1中得到的里氏木霉qm9414株的培养液中用表1所记载的培养基培养时从培养开始第120小时的培养液以外，通过与实施例5或6同样的操作、条件进行含纤维素的生物质的糖化反应试验。结果示于表6和9。
[0128]
＜实施例7＞使用qm9414突变株ii的纤维素酶的糖化反应试验2
[0129]
使用实施例4中得到的qm9414突变株ii的培养液中用表2所记载的培养基培养时从培养开始第120小时的培养液，按照表6和参考例3所记载的操作、条件进行含纤维素的生物质的糖化反应试验。arbocel(注册商标)b800的糖化反应的反应条件示于表10，粉末甘蔗渣的糖化反应的反应条件示于表11。结果示于表12。
[0130]
表10
[0131][0132]
表11
[0133][0134]
表12
[0135][0136]
＜比较例3＞使用里氏木霉qm9414株的纤维素酶的糖化反应试验2
[0137]
除了使用比较例1中得到的里氏木霉qm9414株的培养液中用表2所记载的培养基培养时从培养开始第120小时的培养液以外，通过与实施例7同样的操作、条件进行含纤维素的生物质的糖化反应试验。结果示于表12。
[0138]
＜总结＞
[0139]
根据实施例5和比较例2的结果，在使用通过表1所记载的培养基的培养得到的培养液的arbocel(注册商标)b800的糖化反应中，使用里氏木霉qm9414株的纤维素酶时的糖化液中所含的葡萄糖浓度为3.3g/l，与此相对，使用qm9414突变株i时为4.8g/l。另外，糖化液中所含的木糖浓度在使用qm9414株时为3.9g/l，与此相对，使用qm9414突变株i时为4.9g/l。
[0140]
另外，在粉末甘蔗渣的糖化反应中，qm9414株中葡萄糖游离量为1.4g/l，与此相对，突变株i中为1.7g/l，木糖游离量qm9414株中为2.3g/l，突变株i中为2.5g/l。
[0141]
根据实施例6和比较例2的结果，在使用通过表1所记载的培养基的培养而得的培养液的arbocel(注册商标)b800的糖化反应中，qm9414株中葡萄糖游离量为13g/l，与此相对，qm9414突变株ii为14.3g/l。木糖游离量qm9414株中为8.5g/l，与此相对，突变株ii中为9.1g/l。另外，在粉末甘蔗渣的糖化反应中，qm9414株中葡萄糖游离量为6.1g/l，与此相对，突变株ii中为6.5g/l。木糖游离量qm9414株与突变株ii的两者均为4.1g/l。
[0142]
根据实施例7和比较例3的结果，在使用通过表2所记载的培养基的培养而得培养液的arbocel(注册商标)b800的糖化反应中，qm9414株中葡萄糖浓度为5.9g/l，与此相对，突变株ii为7.2g/l。木糖浓度qm9414株中为3.4g/l，与此相对，突变株ii中为4.5g/l。另外，在粉末甘蔗渣的糖化反应中，qm9414株中葡萄糖浓度为2.9g/l，与此相对，突变株ii中为3.9g/l。木糖浓度qm9414株中为2.5g/l，与此相对，突变株ii中为3.0g/l。由这些结果可知，由包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽的功能降低了的木霉属丝状菌的突变体生产的纤
维素酶，能够制造比由qm9414株生产的纤维素酶更多的糖。

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