一种天然黑色素的提取方法与流程

本发明属于微生物领域；尤其涉及一种天然黑色素的提取方法。

背景技术：

黑色素是在酚类物质的氧化和聚合过程中产生的一类黑色素和棕色的高分子化合物的统称，是生物体为抵抗紫外线和电离辐射等因素的伤害而逐渐进化而来，可以被看成是生物体用来保护自己的一道屏障。相对于合成黑色素而言，天然黑色素副作用小、安全性高，作为食品和日用添加剂，被广泛应用于饮料、糖果、酒类等食品的着色和化妆品行业，黑色素无论作为食用、药用或工业应用都有极高的价值，有着广阔的应用前景和发展潜力。

天然黑色素广泛存在自然界，从微生物中提取分离的天然黑色素不仅具有无毒害、产品的稳定性功能好的特点，且生产天然黑色素的微生物资源丰富，生产工艺简易,容易进行提取分离黑色素。

技术实现要素：

本发明的目的是提供了一种天然黑色素的提取方法。本发明采用小麦赤霉菌，通过反复碱溶酸沉的方法提取其子囊壳中的黑色素。最后经过盐酸水解、有机溶剂洗涤等方法进行纯化。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及天然黑色素的提取方法，包括如下步骤：

步骤1，小麦赤霉菌的培养；

步骤2，小麦赤霉菌黑色素提取；

步骤3，黑色素提取的单因素优化；

步骤4，小麦赤霉菌黑色素的纯化。

优选地，所述小麦赤霉菌的培养具体方法如下：

步骤一，土豆培养基的配置；

步骤二，高压灭菌锅对土豆培养基和平板进行灭菌；

步骤三，小麦赤霉菌的接种；

步骤四，观察小麦赤霉菌的生长状况。

优选地，所述培养基的配制的具体方法：100g去皮土豆，水浴30min煮烂，然后将土豆液进行过滤，加蒸馏水定容至500ml。

优选地，所述高压灭菌锅对土豆培养基和平板进行灭菌的具体方法：分别将5g葡萄糖和7g的琼脂条分别装至两个500ml的锥形瓶，用报纸包好20个平板，利用高压灭菌锅对土豆培养基和平板进行灭菌。

优选地，所述小麦赤霉菌的接种的具体方法：将灭完菌的土豆培养基在超净台进行倒平板，等平板冷却一段时间再进行接种；对真菌接种台进行酒精擦拭，然后在酒精灯旁接种小麦赤霉菌至平板上。

优选地，所述观察小麦赤霉菌的生长状况具体为：接菌后用保鲜膜密封培养皿，将其放置在28℃的恒温培养箱里面培养一周，并观察小麦赤霉菌的生长状况，待红色菌丝铺满平板则停止培养。

优选地，所述小麦赤霉菌黑色素提取包括如下步骤：依次进行碱溶液提取，酸液沉降，再次碱溶解提取，酸液沉降。

优选地，所述小麦赤霉菌黑色素提取的具体步骤：

将干燥好的小麦赤霉菌进行第一次的碱溶酸沉，以1:50的料液比进行溶解小麦赤霉菌，滴加2.0mol/l的naoh，静置4h，取上清液进行抽滤；

加入6mol/l的hcl酸液对样液进行ph调节，使ph＝2.2，再静置2h，观察是否沉降，若无沉降出现，需继续静置，若出现沉降，则以8000r/min离心11min；

离心后将第一次提取出的黑色素挖出，进行干燥得粗提物；

对粗提物进行第二次碱溶酸沉，按1:30的料液比加入2.0mol/l的naoh，并使用超声辅助溶解；

再次加入6mol/l的hcl进行酸沉，以8000r/min离心5min，去掉上清液，得到最终的粗提物，60℃烘干，4℃保存。

优选地，所述黑色素提取的单因素优化的具体步骤：

料液比是1:45(m/v)，氢氧化钠浓度2.0mol/l，ph值为1.5，超声提取时间30min，提取率为1.67％。

黑色素提取单因素提取工艺条件优化：在提取实验过程中，以小麦赤霉菌黑色素的提取量为指标，通过控制超声时间、离心转速、料液比、naoh浓度进行单因素实验，得到最优组合，获得小麦赤霉菌的最高提取量。

料液比的选择：固定其他条件不变，选择料液比为1:15、1:30、1:45、1:60、1:75(g/ml)，研究料液比对小麦赤霉菌黑色素提取量的影响；

超声时间的选择：固定其他条件不变，选择超声时间为10min、20min、30min、40min、50min，研究超声时间对小麦赤霉菌黑色素提取量的影响；

氢氧化钠浓度的选择：固定其他条件不变，选择氢氧化钠浓度为1.0mol/l、1.5mol/l、2.0mol/l、2.5mol/l、3.0mol/l，研究氢氧化钠浓度对小麦赤霉菌黑色素提取量的影响；

酸沉ph的选择：固定其他条件不变，选择酸沉ph为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0，研究酸沉对小麦赤霉菌黑色素提取量的影响；

最终确定最优提取工艺条件：料液比是1:45(m/v)，氢氧化钠浓度2.0mol/l，ph值为1.5，超声提取时间30min，提取率为1.67％。

优选地，所述小麦赤霉菌黑色素的纯化包括如下步骤：将提取出的小麦赤霉菌中的黑色素依次进行酸沉，醇洗，碱溶，重复上述步骤，至最后一次酸沉上清液为清亮色，再利用蒸馏水进行水洗，最后烘干得成品。

所述小麦赤霉菌黑色素的纯化的具体步骤如下：

对粗提的小麦赤霉菌黑色素进行纯化，首先按1:10的料液比加入6mol/l的hcl，并进行100℃热水浴2h，离心(8000r/min，5min)；利用乙醇洗数次，至上清液为清亮色，反复碱溶酸沉，至最后一次酸沉上清液为清亮色；再利用蒸馏水进行水洗(出现2次水溶性黑色素为止)，70℃烘干

本发明具有以下优点：

本发明所涉及一种小麦赤霉菌黑色素的提取方法，包括小麦赤霉菌培养→小麦赤霉菌黑色素提取→黑色素提取的单因素优化→小麦赤霉菌黑色素的纯化。本发明方法采用反复碱溶酸沉的方法提取小麦赤霉菌子囊壳中天然存在的黑色素并经过盐酸水解、有机溶剂洗涤等方法进行纯化。采用本发明的方法提取天然黑色素生产工艺简易,容易进行提取分离，纯化的黑色素也具有较高的稳定性和金属螯合性，且抗辐射，较低的细胞毒性。

附图说明

图1为小麦赤霉菌黑色素的紫外-可见光谱图；

图2为料液比对小麦赤霉菌黑色素提取量的影响图；

图3为超声时间对小麦赤霉菌黑色素提取量的影响图；

图4为氢氧化钠浓度对小麦赤霉菌黑色素提取量的影响图；

图5为酸沉ph对小麦赤霉菌黑色素提取量的影响图；

图6为ph对小麦赤霉菌黑色素稳定性的影响图；

图7为光照对小麦赤霉菌黑色素稳定性的影响图；

图8为温度对小麦赤霉菌黑色素稳定性的影响图；

图9为小麦赤霉菌黑色素铜离子螯合物的紫外-可见光谱图；

图10为小麦赤霉菌黑色素锌离子螯合物的紫外-可见光谱图；

图11为小麦赤霉菌黑色素铁离子螯合物的紫外-可见光谱图；

图12为小麦赤霉菌黑色素对不同菌龄试验菌株的光保护作用图；

图13为不同浓度的小麦赤霉菌黑色素对试验菌株的光保护作用图；

图14为小麦赤霉菌黑色素对不同辐射时间大肠杆菌的光保护作用图；

图15为小麦赤霉菌黑色素对不同辐射时间金黄葡萄球菌的光保护作用图；

图16为小麦赤霉菌黑色素的细胞毒性图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。应当指出的是，以下的实施实例只是对本发明的进一步说明，但本发明的保护范围并不限于以下实施例。

实施例

本实施例涉及一种天然黑色素的提取方法，包括如下步骤：

步骤1，小麦赤霉菌的培养；

步骤2，小麦赤霉菌黑色素提取；

步骤3，黑色素提取的单因素优化；

步骤4，小麦赤霉菌黑色素的纯化。

具体步骤如下：

一、材料和仪器

主要材料：小麦赤霉菌；氢氧化钠、浓盐酸(均为国产分析纯试剂)；牛肉膏、蛋白胨等。

主要仪器：sb-5200dtdn超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；tdl-5-a高速离心机(上海安亭科学仪器厂)；uv-6000pc紫外分光光度计、perkinelmerspectrumtwo红外光谱分析仪(上海元析仪器有限公司)；shz-82恒温振荡器(常州智博瑞仪器制造有限公司)；shp生化培养箱(北京中兴伟业仪器有限公司)等。

具体试验操作及方法

1、黑色素表征分析

黑色素由于高度的共轭效应差异可产生光谱吸收的差异性，但黑色素的紫外-可见光谱图具有相同的特征：在紫外波长下吸收值最大，随着波长的增加，其吸收值逐渐下降,且黑色素溶液光密度对数值与波长的线性曲线斜率一般在-0.0015和-0.0030之间，可作为判断黑色素的特征参数。

如图1所示，小麦赤霉菌黑色素的紫外-可见光谱；可以看出小麦赤霉菌黑色素在224nm处具有最大的吸收峰，而其吸光度值在224nm～800nm之间逐渐减少,将小麦赤霉菌黑色素的吸光度对数值与波长曲线进行线性拟合，得到其曲线斜率为-0.00259，符合黑色素的特征参数。

2、小麦赤霉菌黑色素提取的单因素实验设计

(1)料液比的选择：固定其他条件不变，选择料液比为1:15、1:30、1:45、1:60、1:75(g/ml)，研究料液比对小麦赤霉菌黑色素提取量的影响。

如图2所示，随着料液比从1:15增加到1:45，小麦赤霉菌黑色素的提取量逐渐增大，这可能是因为料液比的增加，使干燥的小麦赤霉菌粉与碱溶液的混合效果增加，物质的扩散速度加快，提取量由0.179g增加到0.252g。但当料液比从1:45增加到1:75时，提取量基本保持在0.256g左右，因此，提取小麦赤霉菌黑色素时，应选用料液比1:45来进行提取小麦赤霉菌黑色素。

(2)超声时间的选择：固定其他条件不变，选择超声时间为10min、20min、30min、40min、50min，研究超声时间对小麦赤霉菌黑色素提取量的影响。

如图3所示，可以看出在超声时间10min～30min范围内，小麦赤霉菌黑色素的提取量随超声时间的延长而增加，增长幅度变化大，从0.137g增加到了0.189g，这是由于超声辅助小麦赤霉菌黑色素溶解，随着超声时间的延长，小麦赤霉菌黑色素溶解速度加快，导致小麦赤霉菌黑色素提取量有所增加；而在超声时间30min-50min范围内，小麦赤霉菌黑色素的提取量的增长幅度基本趋于平缓，基本保持在0.191g左右，因此提取小麦赤霉菌黑色素应该超声30min，使得提取效果达到最佳。

(3)氢氧化钠浓度的选择：固定其他条件不变，选择氢氧化钠浓度为1.0mol/l、1.5mol/l、2.0mol/l、2.5mol/l、3.0mol/l，研究氢氧化钠浓度对小麦赤霉菌黑色素提取量的影响。

如图4所示，随着氢氧化钠浓度的增加，小麦赤霉菌黑色素的提取量也随着增加，当氢氧化钠浓度从1.0mol/l增至2.0mol/l时，小麦赤霉菌黑色素的提取量也从0.154g增至0.207g，其增长趋势达到最快；而当继续增加氢氧化钠浓度到3.0mol/l时，提取量增幅变缓。因此，从成本考虑，氢氧化钠浓度选择2.0mol/l时提取效果最好。

(4)酸沉ph的选择：固定其他条件不变，选择酸沉ph为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0，研究酸沉对小麦赤霉菌黑色素提取量的影响。

如图5所示，可以看出酸沉ph值从1.0增加至1.5时，小麦赤霉菌黑色素的提取量由0.204g增加到0.227g，而当ph值从1.0增加到3.0时，小麦赤霉菌黑色素的提取量随着ph的增加而逐渐减少，因此从小麦赤霉菌黑色素的成本和效果来看，选用酸沉ph值为1.5提取黑色素效果最佳。

3、小麦赤霉菌黑色素的性质测定

(1)小麦赤霉菌黑色素溶解性的测定结果与分析：取提纯的小麦赤霉菌黑色素13份，在13个10ml的摇瓶中分别加入称量好的0.001g小麦赤霉菌黑色素，接着分别使用移液枪滴加碱溶液(ph＝8.0)、二甲基亚砜、蒸馏水、乙酸乙酯、甲醇、甲苯、氯仿、无水乙醇、乙酸、石油醚、丙酮、异戊醇、酸溶液(ph＝3.0)5ml到10ml摇瓶中，摇匀静置一段时间，观察混合溶液的颜色。通过以不加黑色素的溶液作为空白对照，在od400下测吸光度，将吸光度值和溶液的颜色进行比较小麦赤霉菌黑色素在不同溶剂中的溶解性。

不同溶剂的黑色素的光密度值及颜色，如表1所示，小麦赤霉菌黑色素溶于碱性水溶液中，其颜色为棕褐色，难溶于水及普通有机溶剂中(如甲苯、氯仿、乙酸乙酯、乙醇、甲醇、乙酸、石油醚、丙酮、异戊醇等)，但微溶于二甲基亚砜；在ph值小于3的酸性水溶液中，黑色素以不溶解性的固体沉淀物存在。

表1

(2)ph对小麦赤霉菌黑色素稳定性的影响：分别量取5ml于小麦赤霉菌黑色素稀液置于12支试管中，用冰醋酸和氢氧化钠调节ph，使得12支试管的ph分别是1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0，在相同环境下放置1h，然后于540nm测定溶液的吸光度，记录并进行比较，讨论ph值对黑色素稳定性的影响。

如图6所示，小麦赤霉菌黑色素在不同ph条件下光密度值不同，且随着ph的增大，小麦赤霉菌黑色素在540nm处的光密度值也随着不断升高。当溶液的ph值小于4.0时，小麦赤霉菌黑色素的光密度值很低且变化不是很大；当ph从4.0增至5.0时，小麦赤霉菌黑色素的光密度值变化很大，这是由于小麦赤霉菌黑色素溶解度快速增加；而当ph大于5.0时，随着小麦赤霉菌黑色素的溶解速度缓慢增加，其光密度值也缓慢增大，溶液颜色也逐渐加深。由此可以得出ph对小麦赤霉菌黑色素稳定性的影响为：小麦赤霉菌黑色素溶于碱沉于酸。

(3)光照对黑色素稳定性的影响：量取5ml小麦赤霉菌黑色素稀液置于1支试管中，于自然光条件下放置在0、24、48、72h后于540nm测定溶液的吸光度，记录并进行比较，讨论光照对黑色素稳定性的影响。

如图7所示，可以发现在光照时间0h增加到72h范围内，小麦赤霉菌黑色素的光密度值变化很小，od540基本保持在0.897左右，这说明小麦赤霉菌黑色素的耐光性好，光照对小麦赤霉菌黑色素稳定性的影响小。

(4)温度对黑色素稳定性的影响：分别量取小麦赤霉菌黑色素稀释液5ml分别放于准备好的6支试管中。将所有试管放进恒温水浴锅中水浴温度分别设为0、20、40、60、80、100℃在保温时间为30、60、90min后，于540nm测定溶液的吸光度，记录并进行比较，讨论温度对黑色素稳定性的影响。

如图8所示，可以发现在0至100℃范围内小麦赤霉菌黑色素的光密度值变化很小，od540保持在0.900左右，这说明小麦赤霉菌黑色素的耐热性好，温度对小麦赤霉菌黑色素稳定性的影响小。

(5)小麦赤霉菌黑色素的金属螯合性测定：取1ml的40mg/ml小麦赤霉菌黑色素溶液，分别加入4ml的10mg/mlfecl3溶液、cuso4溶液和zncl2溶液，调其ph至7.4(模拟生理条件)，进行避光反应3h，用紫外分光光度计在200～800nm条件下进行扫描，即得小麦赤霉菌黑色素金属离子鳌合物的紫外可见光谱图，由此可以判断在生理条件下，小麦赤霉菌黑色素是否与fe³⁺、cu²⁺和zn²⁺整合。

如图9、图10、图11所示，小麦赤霉菌黑色素与三种金属离子混合溶液的紫外-可见光谱图可以看出小麦赤霉菌黑色素具有金属离子螯合性，且依据小麦赤霉菌黑色素金属离子螯合物的吸收峰位置的变化幅度可初步判断小麦赤霉菌黑色素与fe³⁺离子螯合性最强，与cu²⁺离子的螯合性较弱，与zn²⁺离子的螯合性最弱。

(6)小麦赤霉菌黑色素的抗辐射性测定：天然黑色素剂具有良好的抗辐射功能，可以应用为紫外吸收剂。对于培养不同时间的革兰氏阴性大肠杆菌及革兰氏阳性金黄色葡萄球菌进行小麦赤霉菌黑色素的抗辐射性实验，结果如图12所示；按照实验方法进行抗辐射实验，加入不同浓度的小麦赤霉菌黑色素对两种试验菌株有保护作用，结果如图13所示；大肠杆菌、金黄葡萄球菌抗辐射实验结果如图14和图15所示，可以发现随着紫外辐射时间的延长，试验菌株的存活率也逐渐降低，同时比较大肠杆菌和金黄色葡萄球菌株对照组发现在相同的紫外辐射时间下，实验组两种试验菌株存活率显然上升，对照组两种菌株则比实验组低，在30min时对照组几乎没有存活菌株，而实验组对数值在0.5左右。故照射紫外照射大肠杆菌和金黄色葡萄球菌时，小麦赤霉菌黑色素对其起抗辐射的保护作用。综上所述，小麦赤霉菌黑色素具有良好的抗辐射性。

(7)小麦赤霉菌黑色素细胞毒性的测定：首先在96孔板培养板中加入200μl104个细胞悬液，将培养板放置于37℃、5％的co2培养箱中进行培养24h，小心将培养液吸去，然后向培养板加入200μl的小麦赤霉菌黑色素与培养液的混合液，使得培养浓度为25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml，紧接着吸培养液，继续放置37℃的培养箱培养2d，每个孔加入20μg/ml的5mg/mlmtt溶液和180μl的培养液，放置在培养箱进行培育4h后，小心将mtt溶液吸掉，不要吸沉淀。然后每个孔滴加二甲基亚砜溶液220μl，继续将其培育20min，则可将孔板取出，利用酶标仪测定溶液在od490处的吸光度值。

计算公式为:细胞存活率＝(实验组均值-空白组均值)/(对照组均值-空白组均值)

小麦赤霉菌黑色素的细胞毒性的实验结果如图16所示，在25～400μg/ml之间，肺癌细胞的存活率高达90.47％，且对肺癌细胞的增殖无明显抑制作用，由此可以说明小麦赤霉菌黑色具有较低的细胞毒性，其生物安全性高。

4、结论分析

本发明通过碱溶酸沉-超声辅助提取法从小麦赤霉菌中提取天然黑色素，利用单因素实验进行提取工艺条件的优化：料液比是1:45(m/v)，氢氧化钠浓度2.0mol/l，ph值为1.5，超声提取时间30min，提取率为1.67％。通过盐酸水解、无水乙醇多次洗涤、反复碱溶酸沉以及用蒸馏水水洗多次等方法进行纯化小麦赤霉菌黑色素，并且使用紫外-可见光谱进行鉴定和分析小麦赤霉菌黑色素的特征参数。小麦赤霉菌黑色素的性质测定结果表明：其溶解于碱溶液和二甲基亚砜，不溶于蒸馏水、甲苯、无水乙醇等有机溶剂；通过研究ph、光照、温度对小麦赤霉菌黑色素稳定性的影响发现，小麦赤霉菌黑色素具有较高的稳定性；利用硫酸铜、氯化锌和三氯化铁与小麦赤霉菌黑色素反应，通过紫外-可见光谱图表明其溶液吸收峰发生变化，故小麦赤霉菌黑色素具有金属螯合性；革兰氏阴性大肠杆菌和革兰氏阳性金黄葡萄球菌两种菌株在小麦赤霉菌黑色素浓度达到0.009g/10ml时菌存活数最多，表明小麦赤霉菌黑色素具有良好的抗辐射；小麦赤霉菌黑色素具有较低细胞毒性。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质。

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