一种酪氨酸稀土发光探针及其制备方法和应用与流程

[0001]
本发明属于催化、发光检测技术领域，具体涉及一种酪氨酸稀土发光探针及其制备方法和应用。


背景技术：

[0002]
酪氨酸(tyr)是与脑信号传导、激素产生等过程相关的重要氨基酸，是生物体内多种分子的合成原料。酪氨酸在食品、医药、医学等领域应用广泛。在医学方面，人体中酪氨酸浓度的异常会产生酪氨酸血症，肝脏，神经精神、饮食障碍等代谢紊乱的疾病。在食品加工中，酪氨酸是食品重要的风味物质，检测酪氨酸的含量对控制食品风味、产品质量意义重大。酪氨酸的定量检测在临床某些疾病的辅助诊疗、食品、药品安全等方面具有重要意义。
[0003]
国内外报道的酪氨酸测定方法有高效液相色谱、电化学、酶降解等方法。中国专利公布号cn 101762665 a，2009年，李梅等，一种测定麦汁、发酵液和啤酒中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的方法，公开了一种用高效液相色谱测定酪氨酸的方法；中国专利公布号cn 107643349a，2018年，秦俊莲等，一种食品中酪氨酸的检测方法，公开了一种高效液相色谱测定酪氨酸的方法；中国专利cn 107091898a，2017年，刘腾飞等，一种茶叶鲜样中游离氨基酸含量的快速分析方法，公开了一种用荧光检测器、c18色谱柱的高效液相色谱测定酪氨酸的方法；中国专利公布号cn 106290539 a，2017年，黄珊等，检测溶液中酪氨酸浓度的方法，公开了一种用差分脉冲伏安法检测酪氨酸的方法；中国专利公布号cn 107153088 a，2017年，李俊华等，一种用于检测酪氨酸的电化学传感器及其制备方法和应用，公开了一种用化学修饰电极的电化学检测酪氨酸的方法。中国专利公布号cn 109001177 a，2018年，陆德婵等，一种尿液中酪氨酸的检测方法，公开了一种用表面增强拉曼光谱测定酪氨酸的方法。刘俊俊等报道了一种用阴离子交换色谱－荧光检测法测定人体血清中酪氨酸的方法(分析科学学报，20165，32，173-177)；王全林等报道了一种血红蛋白催化荧光法测定酪氨酸的方法(分析试验室，2004，23，46-49)；蔡维平等报道了一种现场光化学荧光法测定酪氨酸(分析化学，2000，28，1535-1537)。李艳廷等报道了一种氧化钛纳米晶溶胶作为共振光散射探针检测酪氨酸的方法(四川大学学报(自然科学版)，2008，45，110-114)。色谱法需要贵重设备且测定时间长，电化学方法要制备修饰电极、易受到干扰物质的影响，因此，有必要开发简便、快速、灵敏的酪氨酸测定方法。


技术实现要素：

[0004]
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种酪氨酸稀土发光探针，该探针能在水溶液中快速灵敏地测定酪氨酸浓度。
[0005]
本发明提供所述酪氨酸稀土发光探针的制备方法和应用。
[0006]
技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种酪氨酸稀土发光探针，所述探针是由稀土铽离子、4，5-咪唑二羧酸(imdc)、以及高铁血红素(hemin)或fe
3
o
4
纳米粒子通过溶解热反应形成的纳米材料。
[0007]
其中，所述酪氨酸稀土发光探针的分子式为(4，5-咪唑二羧酸)
2
(铽离子)(高铁血红素)
0.05-0.1
或(4，5-咪唑二羧酸)
2
(铽离子)(fe
3
o
4
)
1-3
的的多孔网络状结构或球形纳米粒子。
[0008]
本发明所述酪氨酸稀土发光探针具有催化发光功能，通过催化氧化酪氨酸的反应敏化铽离子的发光原理实现检测酪氨酸分子。
[0009]
本发明所述的酪氨酸稀土发光探针的制备方法，包括如下步骤：
[0010]
向4，5-咪唑二羧酸的n,n-二甲基甲酰胺(dmf)溶液中依次加入硝酸铽水溶液、高铁血红素的n,n-二甲基甲酰胺溶液，持续搅拌后转移至高温反应釜，加热反应，冷却至室温，离心收集褐色沉淀，沉淀洗涤干燥后备用；
[0011]
或者在乙醇中加入fe
3
o
4
纳米粒子，超声分散后，立即加到tb(no
3
)
3
水溶液与4，5-咪唑二羧酸的n,n-二甲基甲酰胺溶液混合形成的混合液中，搅拌后，将混合物密封在四氟乙烯内衬的高压釜中，加热反应，冷却到室温。离心分离沉淀，沉淀洗涤干燥后备用。
[0012]
其中，所述4，5-咪唑二羧酸、铽离子与高铁血红素的摩尔比为2：1：0.05-0.1；所述4，5-咪唑二羧酸、铽离子与fe
3
o
4
纳米粒子的摩尔比为2：1：1-3。
[0013]
作为优选，所述加热反应于150-200℃反应4-5小时。
[0014]
其中，所述fe
3
o
4
纳米粒子制备包括如下步骤：将fe(no
3
)
3
水溶液加到乙二醇中，搅拌下将乙酸钠滴加到fe(no
3
)
3
溶液中。搅拌混合，转移到内衬四氟乙烯的不锈钢高压釜中，加热反应，冷却至室温后离心分离沉淀，沉淀洗涤干燥后得fe
3
o
4
纳米粒子。
[0015]
本发明的制备方法中若采用高铁血红素，制备的产物经元素分析含有铽离子、高铁血红素和4，5-咪唑二羧酸，分子式为(4，5-咪唑二羧酸)
2
(铽离子)(高铁血红素)
0.05-0.1
。
[0016]
本发明的制备方法中若采用fe
3
o
4
纳米粒子，制备的产物经元素分析含有铽离子、fe
3
o
4
和4，5-咪唑二羧酸，分子式为(4，5-咪唑二羧酸)
2
(铽离子)(fe
3
o
4
)
1-3
。
[0017]
本发明所述的酪氨酸稀土发光探针在检测酪氨酸中的应用。
[0018]
其中，所述检测酪氨酸的过程为：通过将酪氨酸稀土发光探针的悬浮液加入到样品溶液中，充分混合后在紫外灯下观察和比较样品溶液的发光和标准浓度的酪氨酸溶液的发光目测酪氨酸的含量或用荧光分光光度计测定溶液铽离子的发光，根据铽离子荧光强度与酪氨酸浓度的工作曲线测得样品溶液的酪氨酸含量。
[0019]
有益效果：与现有技术相比，本发明的酪氨酸稀土发光探针具有以下优点：
[0020]
1)与已报道的酪氨酸探针或测定方法相比，本发明的酪氨酸发光探针采用了新的测定原理，利用高铁血红素或fe
3
o
4
纳米粒子催化氧化酪氨酸的反应敏化铽离子的发光原理测定酪氨酸分子。
[0021]
2)本发明的酪氨酸发光探针利用稀土离子发光，稀土离子长的荧光寿命允许通过时间分辨荧光技术消除各种非特异性荧光(如背景荧光或干扰荧光)的干扰，能获得高的信噪比，对测定具有很强的背景荧光的样品(如生物样品、食品等)中酪氨酸具有优势。
[0022]
3)本发明的酪氨酸发光探针的制备方法简便、无需复杂的有机合成；灵敏度高、特异性强、测定快速，为检验生物样品、食品、药品中的酪氨酸提供了一种简便、快速的方法。
附图说明
[0023]
图1为酪氨酸稀土发光探针tb-imdc-hemin的透射电镜图；
tb(no
3
)
3
的水溶液形成的混合液。50mg fe
3
o
4
纳米粒子加入到1ml乙醇中，超声分散20分钟后，立即加入到上述dmf的混合液中，构成imdc：tb
3+
：fe
3
o
4
的摩尔比为2：1：2，搅拌20分钟，将混合物密封在四氟乙烯内衬的高压釜中，在150℃下反应5h，冷却到室温。离心分离沉淀，用无水乙醇洗涤沉淀3次，沉淀在60℃下干燥2h得tb-imdc-fe
3
o
4
，图3为制备的酪氨酸稀土发光探针tb-imdc-fe
3
o
4
的扫描电镜图，显示tb-imdc-fe
3
o
4
是球状的纳米粒子。图4是制备的酪氨酸稀土发光探针tb-imdc-fe
3
o
4
的红外光谱图，imdc的c-o反对称伸缩振动峰从1250移动到1384cm-1
、c-o对称伸缩振动峰1055cm-1
消失、c＝o的特征峰从1700移动到1616cm-1
，fe
3
o
4
的fe-o特征峰573cm-1
移动，表明4，5-咪唑二羧酸的羧基与铽离子、铁离子配位相连。
[0044]
实施例4
[0045]
酪氨酸稀土发光探针tb-imdc-fe
3
o
4
的制备
[0046]
向7ml dmf溶液中加入1ml 0.2m 4，5-咪唑二羧酸(imdc)的dmf溶液与1ml 0.1m tb(no
3
)
3
的水溶液形成的混合液。25mg实施例3制备的fe
3
o
4
纳米粒子加入到1ml乙醇中，超声分散20分钟后，立即加入到dmf的混合液中，构成imdc：tb
3+
：fe
3
o
4
的摩尔比为2：1：1，搅拌20分钟，将混合物密封在四氟乙烯内衬的高压釜中，在150℃下反应5h，冷却到室温。离心分离沉淀，用无水乙醇洗涤沉淀3次，沉淀在60℃下干燥2h。制备的酪氨酸稀土发光探针tb-imdc-fe
3
o
4
是类似图3的球形纳米粒子。
[0047]
实施例5
[0048]
酪氨酸稀土发光探针tb-imdc-hemin对酪氨酸的荧光响应
[0049]
在970μl水中，依次加入实施例1制备的10μl tb-imdc-hemin(0.5mg/ml)水溶液和10μl h
2
o
2
(0.1mm)溶液，10μl不同浓度的酪氨酸溶液使得1ml溶液中分别含酪氨酸0，1，50，100，200，300，400和500μm，充分混合后，反应30分钟，分别测定溶液在253nm激发下铽离子545nm的荧光强度，绘出荧光强度与酪氨酸浓度的工作曲线。按照同样的步骤，加入酪氨酸样品，测定荧光强度，根据工作曲线获得酪氨酸的浓度。
[0050]
图5是酪氨酸发光探针tb-imdc-hemin测定酪氨酸溶液的荧光光谱图，从图中看出随着酪氨酸浓度的增加，tb-imdc-hemin的荧光强度不断增强，浓度与荧光强度呈线性关系(图6)，检测限低达0.5μm。
[0051]
酪氨酸稀土发光探针tb-imdc-hemin测定酪氨酸具有良好的选择性，在500μm苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸、甘氨酸、葡萄糖、尿酸、阴离子po
43－
、co
32－
、ac
－
、no
3－
、no
2－
、so
32－
、so
42－
、阳离子co
2+
、ni
2+
、pb
2+
、cd
2+
、hg
2+
、ag
+
分别存在下,按照实施例5的步骤测定酪氨酸不受这些物质的干扰。
[0052]
实施例6
[0053]
酪氨酸稀土发光探针tb-imdc-hemin催化酪氨酸反应
[0054]
20μl浓度为0.1mm的酪氨酸溶液和10μl浓度为10mm的h
2
o
2
溶液分别加到960μl浓度为10mm hepes(n-2-羟乙基哌嗪-n'-2-乙磺酸)(ph 7.0)溶液中，再加入实施例1制备的10μl酪氨酸稀土发光探针tb-imdc-hemin(0.5mg/ml)，充分混合形成悬浮液,测定在276nm波长激发下溶液的荧光光谱。图7是酪氨酸稀土发光探针tb-imdc-hemin、h
2
o
2
和酪氨酸反应不同时间(0至3小时)的荧光光谱图，随着反应的进行，酪氨酸在305nm的荧光峰不断降低，在405nm处出现新的荧光峰且这个荧光峰不断升高，显示酪氨酸被催化氧化生成了产物。图9是辣根过氧化物酶(2.5u/mg)在相同实验条件下的荧光光谱图，随着反应的(0至3小时)进
行，酪氨酸同样在305nm的荧光峰不断降低，在405nm处出现新的荧光峰且这个荧光峰不断升高，显示酪氨酸被催化氧化生成了产物。酪氨酸稀土发光探针tb-imdc-hemin具有辣根过氧化物酶的功能。
[0055]
实施例7
[0056]
酪氨酸稀土发光探针tb-imdc-fe
3
o
4
催化酪氨酸反应
[0057]
20μl浓度为0.2mm的酪氨酸溶液和10μl浓度为10mm的h
2
o
2
溶液分别加到960μl浓度为10mm hepes(ph 7.0)溶液中，再加入实施例3制备的10μl酪氨酸稀土发光探针tb-imdc-fe
3
o
4
(0.5mg/ml)，充分混合形成悬浮液,测定在276nm波长激发下溶液的荧光光谱。图8是酪氨酸稀土发光探针tb-imdc-fe
3
o
4
、h
2
o
2
和酪氨酸反应不同时间(0至3小时)的荧光光谱图，随着反应的进行，酪氨酸在305nm的荧光峰不断降低，在405nm处出现新的荧光峰且这个荧光峰不断升高，显示酪氨酸被催化氧化生成了产物。图9是辣根过氧化物酶(2.5u/mg)在相同实验条件下的荧光光谱图，随着反应的(0至3小时)进行，酪氨酸同样在305nm的荧光峰不断降低，在405nm处出现新的荧光峰且这个荧光峰不断升高，显示酪氨酸被催化氧化生成了产物。酪氨酸稀土发光探针tb-imdc-fe
3
o
4
具有辣根过氧化物酶的功能。
[0058]
实施例8
[0059]
酪氨酸稀土发光探针tb-imdc-hemin测定人血清中酪氨酸
[0060]
人血清离心后的上清液用0.01m hepes缓冲液(ph 7.4)稀释50倍后，加入一定量的酪氨酸溶液制备成分别含1，50，100μm酪氨酸的血清样品。向960μl hepes的缓冲溶液(10mm ph 7.0)中依次分别加入20μl实施例1制备的tb-imdc-hemin悬浮液(0.5mg/ml)和10μl h
2
o
2
(10mm)溶液，加入10μl血清样品，混合溶液孵育30分钟后，在紫外灯下观察和比较样品溶液的发光与标准浓度的酪氨酸溶液的发光目测酪氨酸的含量或在253nm的激发波长下记录溶液的荧光强度。表1是酪氨酸稀土发光探针用加入法测定血清中酪氨酸的结果，结果显示测定复杂样品人血清中酪氨酸具有良好的回收率。
[0061]
表1酪氨酸稀土发光探针测定血清中酪氨酸
[0062][0063]
采用实施例8的步骤，实施例3制备的探针tb-imdc-fe
3
o
4
具有同样的效果。
[0064]
实施例9
[0065]
实施例9与实施例3制备方法相同，不同之处在于：4，5-咪唑二羧酸、铽离子与fe
3
o
4
纳米粒子的摩尔比为2：1：1；在四氟乙烯内衬的高压釜中，在200℃下反应4h。
[0066]
实施例10
[0067]
实施例9与实施例3制备方法相同，不同之处在于：4，5-咪唑二羧酸、铽离子与fe
3
o
4
纳米粒子的摩尔比为2：1：3。

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