治疗杜兴型肌营养不良症和贝克型肌营养不良症的具有改善特性的RNA调节性寡核苷酸的制作方法

代替。同样适用的是“由2
’-
o-甲基rna单体和硫代磷酸酯骨架组成的寡核苷酸”可以被“由硫代磷酸酯骨架连接的2
’-
o-甲基rna单体的寡核苷酸”代替。
[0014]
在本发明的背景中，表述”用作用于治疗杜兴型肌营养不良或贝克型肌营养不良的药物”可被表述”用于杜兴型肌营养不良或贝克型肌营养不良的治疗”取代。
[0015]
优选地，寡核苷酸是具有不超过34个核苷酸的寡核苷酸。所述寡核苷酸可以具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸。也可认为这样的寡核苷酸是具有10至33个核苷酸的寡核苷酸。
[0016]
因此，本发明的寡核苷酸包含2
’-
o-甲基rna单体和硫代磷酸酯骨架并且包含不超过34个核苷酸(即，它包含10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸)。
[0017]
因此，本发明的寡核苷酸由通过硫代磷酸酯骨架连接2
’-
o-甲基rna单体组成并且包含不超过34个核苷酸(即，它包含10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸)。
[0018]
因此，本发明的寡核苷酸包含2
’-
o-甲基rna单体、硫代磷酸酯骨架，包含不超过34个核苷酸(即，它包含10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸)和5-甲基嘧啶和/或2，6-二氨基嘌呤碱基。
[0019]
因此，本发明的寡核苷酸由通过硫代磷酸酯骨架连接的2
’-
o-甲基rna单体组成，并且包含不超过34个核苷酸(即，它包含10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸)和5-甲基嘧啶和/或2，6-二氨基嘌呤碱基。
[0020]
这些寡核苷酸中的每一个用作或可以用作用于治疗杜兴型肌营养不良或贝克型肌营养不良的药物。
[0021]
本发明的寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体组成。这样的寡核苷酸包含通过或由硫代磷酸酯骨架连接的2
’-
o-甲基rna单体，或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成。优选地，这样的寡核苷酸由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成。技术人员已知这样的化学品。遍及申请，包含2
’-
o-甲基rna单体和硫代磷酸酯骨架的寡核苷酸可被包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna的寡核苷酸代替。遍及申请，由通过或由硫代磷酸酯骨架连接的2
’-
o-甲基rna单体组成的寡核苷酸可被由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成的寡核苷酸代替。
[0022]
在本发明的背景下，“骨架”被用于确定两个糖单元或糖单元或部分的修饰的变体之间的连接，如此后稍后限定的(即，核苷间键(核苷间连接，internucleoside linkage))。遍及说明书，可交换地使用单词“骨架”、“核苷间键”和“连接”。因此，具有10个核苷酸的寡核苷酸具有9个骨架，将如本文稍后限定的10个糖单元或糖单元或部分的修饰的变体连接在一起。根据本发明的寡核苷酸的至少一个骨架由硫代磷酸酯部分组成，将如本文稍后限定的两个糖单元或糖单元或部分的修饰的变体连接在一起。因此，由硫代磷酸酯部分取代rna中存在的至少一个磷酸二酯骨架。天然存在的核苷间键或骨架是3
’
至5
’
磷酸二酯键。
[0023]
另外，本发明的寡核苷酸可包含碱基修饰，其增加与靶标链的结合亲和力、增加所述寡核苷酸与它的靶标链的产生的双链体的解链温度(melting temperature)、和/或减少免疫刺激影响、和/或增加生物稳定性、和/或改善生物分布和/或组织内分布、和/或细胞摄取和运输。在更优选的实施方式中，本发明的寡核苷酸包含5-甲基嘧啶和/或2，6-二氨基嘌
呤碱基。5-甲基嘧啶碱基选自5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶和/或胸腺嘧啶，其中胸腺嘧啶与5-甲基尿嘧啶相同。
[0024]
因此，在本发明的修饰的寡核苷酸的背景中，表述“包含5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶和/或2，6-二氨基嘌呤碱基”可以被“包含选自由5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶和2，6-二氨基嘌呤碱基组成的组的碱基修饰”代替。
[0025]
当本发明的寡核苷酸具有两个或更多这样的碱基修饰时，所述碱基修饰可以是相同的，例如，寡核苷酸中的所有的这样的修饰的碱基是5-甲基胞嘧啶，或所述碱基修饰可以是不同的碱基修饰的组合，例如，寡核苷酸可具有一个或更多个5-甲基胞嘧啶和一个或更多个5-甲基尿嘧啶。
[0026]
遍及文件，可以相互交换“胸腺嘧啶”和“5-甲基尿嘧啶”。类推地，2，6-二氨基嘌呤与2-氨基腺嘌呤相同，和遍及文件可以相互交换这些术语。在us 7,745,42的另外的背景中公开了2，6-二氨基嘌呤的应用。
[0027]
如此处确定的术语“碱基修饰”或“修饰的碱基”指的是，现有的碱基(即，嘧啶或嘌呤碱基)的修饰或指的是，碱基的从头合成。与现有的碱基相比，这种从头合成的碱基可适合作“修饰的”。包含5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶和/或2，6-二氨基嘌呤碱基的本发明的寡核苷酸分别地意味着，通过用甲基对嘧啶环的5-位置上的质子的取代，已经修饰了所述寡核苷酸的至少一个胞嘧啶核酸碱基，即，5-取代的胞嘧啶，和/或通过用甲基对嘧啶环的5-位置上的质子的取代，已经修饰了所述寡核苷酸的至少一个尿嘧啶核酸碱基(即，5-甲基尿嘧啶)，和/或通过用氨基对2-位置上的质子的取代，已经修饰了所述寡核苷酸的至少一个腺嘌呤核酸碱基(即，2，6-二氨基嘌呤)。在本发明的背景内，表述“在嘧啶环的位置5中用甲基取代质子”可被表述“用5-甲基嘧啶取代嘧啶”代替，嘧啶仅指尿嘧啶、仅指胞嘧啶或指两者。同样地，在本发明的背景内，表述“在腺嘌呤的位置2中用氨基取代质子”可被表述“用2，6-二氨基嘌呤取代腺嘌呤”代替。如果所述寡核苷酸包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多个胞嘧啶、尿嘧啶和/或腺嘌呤，分别地这样修饰至少一个、2、3、4、5、6、7、8、9或更多个胞嘧啶、尿嘧啶和/或腺嘌呤。优选地，以这样的方式或分别地通过5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶和/或2，6-二氨基嘌呤取代，已经修饰了所有的胞嘧啶、尿嘧啶和/或腺嘌呤。不必说，本发明的这个方面只可使应用于在它们的序列中分别地包含至少一个胞嘧啶、尿嘧啶或腺嘌呤的寡核苷酸。通过参考不包含5-甲基胞嘧啶、不包含5-甲基尿嘧啶和不包含2，6-二氨基嘌呤的它的未修饰的配对物(counterpart)，包含至少一个5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶和/或2，6-二氨基嘌呤的寡核苷酸可被称为修饰的寡核苷酸。未修饰的配对物也可被认为是包含未修饰的胞嘧啶、未修饰的尿嘧啶和未修饰的腺嘌呤的寡核苷酸。由包含seq id no：91、seq id no：93-seq id no：170的或由seq id no：91、seq id no：93-seq id no：170组成的下列碱基或核苷酸序列中的一个表示优选的未修饰的序列。
[0028]
发明人发现，本发明的寡核苷酸中的5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶和/或2，6-二氨基嘌呤的存在对所述寡核苷酸的至少一个参数具有积极的效果。在这个背景中，参数可以包括：如下面解释的，结合亲和力和/或动力学、外显子跳读活性、生物稳定性、(组织内)分布、细胞摄取和/或运输和/或所述寡核苷酸的免疫原性。所述积极的效果可以与包含的碱基修饰的数量或百分数相关。对于外显子跳读活性的参数，发明人发现对于某些寡核苷酸，本身不需要核酸碱基的修饰来获得相对高的外显子跳读水平。这可与在它的剪接过程中，
外显子内的特异性的靶向序列的特异性的任务(和长度)相关。
[0029]
结合亲和力和动力学取决于aon的热力学性质。至少部分地通过所述寡核苷酸的解链温度(tm；例如，对于单链rna，使用基础tm和最近邻的模型，用寡核苷酸性质计算器(http：//www.unc.edu/～cail/biotool/oligo/index.html或http：//eu.idtdna.com/analyzer/applications/oligoanalyzer/)计算的)，和/或寡核苷酸-靶外显子复合体的自由能(使用rna structure版本4.5或rna mfold版本3.5)确定这些。如果tm增加，外显子跳读活性显著地增加，但是当tm太高时，预计aon变成序列特异性较低。可接受的tm和自由能取决于寡核苷酸的序列。因此，难以给出这些参数的每一个的优选的范围。
[0030]
优选地，使用与描述的靶向外显子侧接的dmd基因-特异性引物(aartsma-rus等人，2003)，通过逆转录酶聚合酶链式反应(rt-pcr)，通过分析从aon-处理的肌肉细胞培养物或肌肉组织分离的总rna测量外显子跳读活性。在1-2％琼脂糖凝胶上或用agilent 2100生物分析仪(荷兰，安捷伦科技公司)分析rt-pcr产物。评估表示其中靶外显子被跳读的转录本的较短的转录本片段与总的转录本产物的比率(计算为由aon诱导的外显子跳读的百分数)。也可对较短的片段测序以确定靶向外显子跳读的正确性和特异性。与它的未修饰的配对物相比(即，包含2
’-
o-甲基rna单体、硫代磷酸酯骨架和不包含任何5-甲基嘧啶和任何2，6-二氨基嘌呤碱基的寡核苷酸)，对本发明的修饰的寡核苷酸(即，包含2
’-
o-甲基rna单体、硫代磷酸酯骨架和5-甲基嘧啶和/或2，6-二氨基嘌呤碱基的寡核苷酸))可以检测到外显子跳读的百分数增加。优选地，所述增加是如上述解释的使用rt-pcr评估的可检测的增加。优选地，所述增加是至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％的增加，或至少2、3、4、5、6、7、8、9或10倍更高，或甚至11、12、13、14、15、16、17、18、19、20倍更高或更多。
[0031]
优选地，至少部分地通过改编自yu等人，2002的验证的杂交连接分析确定生物分布和生物稳定性。在一个实施方式中，用特异性捕获寡核苷酸探针孵育血浆或均质化的组织样品。在分离之后，将dig标记的寡核苷酸连接至复合体，并且之后是用抗dig抗体连接的过氧化物酶的检测。使用winnonlin软件包(模型200，版本5.2，pharsight，mountainview，ca)进行非房室(non-compartmental)药代动力学分析。随着时间监测aon(ug)/ml血浆或aon(ug)/mg组织的水平以评估曲线下面积(auc)、最大浓度(c
max
)、至最大浓度的时间(t
max
)、终点半衰期和吸收延迟时间(t
lag
)。在实验部分中公开了这样优选的分析。
[0032]
aon可通过激活toll-样受体(tlr)(包括tlr9和tlr7)刺激先天性免疫应答(krieg等人，1995)。典型地，由于存在于寡脱氧核糖核苷酸(odn)中非甲基化的cg序列的存在，通过模仿细菌dna，其通过tlr9-介导的细胞因子释放激活先天免疫系统，发生tlr9的激活。然而，表明2
’-
o-甲基修饰显著地减少这样的可能的影响。已经描述了tlr7识别rna中的尿嘧啶重复(diebold等人，2006)。
[0033]
tlr9和tlr7的激活导致一组协同的免疫应答，其包括先天免疫(巨噬细胞、树突状细胞(dc)和nk细胞)(krieg等人，1995；krieg，2000)。在这个过程中牵连到几个化学因子和细胞因子，如ip-10、tnfα、il-6、mcp-1和ifnα(wagner，1999；popovic等人，2006)。炎症性细胞因子从血液吸引另外的防御性细胞，如t和b细胞。可通过体外试验研究这些细胞因子的水平。总之，用渐增的aon浓度孵育人全血，在这之后，通过标准的市售elisa试剂盒确定细
胞因子的水平。在试验部分中描述了这样的优选的实验。与用不具有5-甲基胞嘧啶的相应的寡核苷酸处理的细胞相比，在用包含至少一个5-甲基胞嘧啶的寡核苷酸处理的细胞中，在分析中，通过比较相应的细胞因子的浓度，优选地，免疫原性的减少对应于上述提到的至少一种细胞因子的浓度的可检测的减少。
[0034]
因此，通过与由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成的、不具有5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶和2，6-二氨基嘌呤的相应的寡核苷酸(即，所谓的未修饰的寡核苷酸)相比，本发明的优选的寡核苷酸具有改善的参数，如可接受的或减少的免疫原性和/或较好的生物分布和/或可接受的或改善的rna结合动力学和/或热力学性质。也可认为所述未修饰的寡核苷酸是包含未修饰的胞嘧啶、未修饰的尿嘧啶和未修饰的腺嘌呤的寡核苷酸。可用技术人员已知的或优选地此处公开的实验评估这些参数中的每一个。
[0035]
下面限定本发明的寡核苷酸的其他化学成分(chemistries)和修饰。这些另外的化学成分和修饰可存在于对于所述寡核苷酸已经限定的化学成分中，即，存在5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶和/或2，6-氨基嘌呤，以及包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成的寡核苷酸。
[0036]
本发明的优选的寡核苷酸包含rna分子或修饰的rna分子或由rna分子或修饰的rna分子组成。在优选的实施方式中，寡核苷酸是单链的。技术人员将明白，然而，可能的是，单链的寡核苷酸可形成内部双链结构。然而，在本发明的背景中，这种寡核苷酸仍然被称为单链的寡核苷酸。
[0037]
除了上述描述的修饰之外，本发明的寡核苷酸可以包含进一步的修饰如下面描述的不同类型的核酸单体或核苷酸。不同类型的核酸单体可用于形成本发明的寡核苷酸。与以rna为基础的寡核苷酸相比，所述寡核苷酸可具有至少一个骨架和/或糖修饰和/或至少一个碱基修饰。
[0038]
碱基修饰包括天然的嘌呤和嘧啶碱基(例如，腺嘌呤、尿嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶)的修饰的变体，如次黄嘌呤、乳清酸、胍丁胺(agmatine)、赖西丁(lysidine)、2-硫代嘧啶(例如，2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶)、g-形钳(g-clamp)和它的衍生物、5-取代的嘧啶(例如，5-卤代尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、5-氨基甲基尿嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、5-氨甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、supert)、7-脱氮鸟嘌呤(地查枸林，7-deazaguanine)、7-脱氮腺嘌呤、7-氮杂-2，6-二氨基嘌呤、8-氮杂-7-脱氮鸟嘌呤、8-氮杂-7-脱氮腺嘌呤、8-氮杂-7-脱氮-2，6-二氨基嘌呤、super g、super a和n4-乙基胞嘧啶或它的衍生物；n
2-环戊基鸟嘌呤(cpent-g)、n
2-环戊基-2-氨基嘌呤(cpent-ap)和n
2-丙基-2-氨基嘌呤(pr-ap)、假尿嘧啶或它的衍生物；和简并的(退化的，degenerate)或通用的碱基，如2，6-二氟甲苯或缺少的碱基类脱碱基位点(例如，1-脱氧核糖、1，2-二脱氧核糖、1-脱氧-2-o-甲基核糖)；或其中以氮取代环中氧的吡咯烷衍生物(氮杂核糖))。在美国专利us 6,683,173(epoch biosciences)中可以发现super a、super g和super t的衍生物的实例，其全部内容通过引用结合于此。当包含在sirna中时，显示cpent-g、cpent-ap和pr-ap减少免疫刺激影响(peacock h.et al.j.am.chem.soc.2011，133，9200)。
[0039]
假尿嘧啶是尿嘧啶的自然地存在的异构化的变体，具有c-糖苷而不是如在尿嘧啶中的普通的n-糖苷。与含有尿苷的mrna相比，含有假尿苷的合成的mrna可具有改善的安全性曲线(wo 2009127230，其全部内容通过引用结合于此)。
[0040]
在一个实施方式中，本发明的寡核苷酸包含脱碱基位点或脱碱基单体。在本发明的背景内，这样的单体可以被叫做脱碱基位点或脱碱基单体。与包含碱基的相应的单体相比，脱碱基单体或脱碱基位点是缺少核碱基的单体或基础结构(构件，building block)。因此，在本发明内，脱碱基单体是寡核苷酸的基础结构部分但是缺少核碱基。可存在这样的脱碱基单体或可将其连接(键连，link)或附着(attach)或缀合(conjugate)至寡核苷酸的游离端上。
[0041]
在更优选的实施方式中，本发明的寡核苷酸包含1-20个或更多脱碱基单体。因此，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多脱碱基单体可存在于本发明寡核苷酸中。
[0042]
脱碱基单体可以是技术人员已知的和可想象的任何类型的单体，下面描述非限制性的实例：
[0043][0044]
此处，r
1
和r
2
独立地是h、寡核苷酸或其他一个或多个脱碱基位点，条件是r
1
和r
2
不都是h和r
1
和r
2
不都是寡核苷酸。按照以前的说明，可将一个或多个脱碱基单体附着到寡核苷酸的任一末端或两个末端上。应该注意，附着到一个或两个脱碱基位点或脱碱基单体的寡核苷酸可包含少于10个核苷酸。在这个方面中，根据本发明的寡核苷酸可包含至少10个核苷酸，可选地，在一个或两个末端上包含一个或更多个脱碱基位点或脱碱基单体。
[0045]
取决于它的长度，本发明的寡核苷酸可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个碱基修饰。本发明也包含在所述寡核苷酸中引入不只一个不同的碱基修饰。
[0046]
糖修饰包含核糖基部分的修饰的变体，如2
’-
o-修饰的rna如2
’-
o-烷基或2
’-
o-(取代的)烷基，例如，2
’-
o-甲基、2
’-
o-(2-氰乙基)、2
’-
o-(2-甲氧基)乙基(2
’-
moe)、2
’-
o-(2-硫代甲基)乙基、2
’-
o-丁酰基、2
’-
o-炔丙基、2
’-
o-烯丙基、2
’-
o-(3-氨基)丙基、2
’-
o-(3-(二甲基氨基)丙基)、2
’-
o-(2-氨基)乙基、2
’-
o-(2-(二甲基氨基)乙基)；2
’-
脱氧(dna)；2
’-
o-(卤代烷氧基)甲基(arai k.等人bioorg.med.chem.2011，21，6285)，例如，2
’-
o-(2-氯代乙氧基)甲基(mcem)、2
’-
o-(2，2-二氯乙氧基)甲基(dcem)；2
’-
o-烷氧基羰基，例如，2
’-
o-[2-(甲氧基羰基)乙基](moce)、2
’-
o-[2-(n-甲基氨基甲酰)乙基](mce)、2
’-
o-[2-(n，n-二甲基氨基甲酰)乙基](dcme)；2
’-
卤代，例如，2
’-
f、fana(2
’-
f阿拉伯糖基核酸)；碳环糖(carbasugar)、磺胺和硫环糖和氮杂糖修饰；3
’-
o-烷基，例如，3
’-
o-甲基、3
’-
o-丁酰基、3
’-
o-丙炔基；4
’-
羧基，例如，4
’-
羧基胸腺嘧啶(hari等人)；和它们的衍生物。
[0047]
其他糖修饰包括“桥接”或“双环”核酸(bna)，例如，锁核酸(lna)、木-lna(xylo-lna)、α-l-lna、β-d-lna、cet(2
’-
o，4
’-
c约束的乙基)lna、cmoet(2
’-
o，4
’-
c约束的甲氧基乙基)lna、乙烯-桥接的核酸(ena)、三环dna(tcdna、tc-ps-dna，例如，美国专利申请号us 20120149756)；3
’-
s-硫代磷酸酯dna(3
’-
s-phosphorothiolate dna)(例如，org.biol.chem.2013，11，966)；双重地约束的核酸(tri-na，例如，hanessian等人)；未锁核酸(una)；环己烯基核酸(cena)、altriol核酸(ana)、己糖醇核酸(hna)、氟化的hna(f-hna)、吡喃糖基-rna(p-rna)、3
’-
脱氧吡喃糖基-dna(p-dna)；吗啉代(吗啉基，morpholino)(如，例如，在pmo、ppmo、pmoplus、pmo-x中)；和它们的衍生物。取决于它的长度，本发明的寡核苷酸可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个糖修饰。本发明也包含在所述寡核苷酸中引入不只一个不同的糖修饰。在实施方式中，此处限定的寡核苷酸包含lna或它的衍生物或由lna或它的衍生物组成。例如，在wo 2011/097641中描述bna衍生物，其全部内容通过引用结合于此。在更优选的实施方式中，本发明的寡核苷酸是完全地2
’-
o-甲基修饰的。在wo2011150408中描述pmo-x的实例，其全部内容通过引用结合于此。
[0048]
骨架修饰包含rna中存在的磷酸二酯的修饰的变体，如硫代磷酸酯(ps)、手性纯的硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯(ps2)、磷酰基乙酸酯(phosphonoacetate)(pace)、磷酰基乙酰胺(paca)、硫代磷酰基乙酸酯、硫代磷酰基乙酰胺、硫代磷酸酯药物前体、h-膦酸酯、膦酸甲酯、硫代膦酸甲酯、磷酸甲酯、硫代磷酸甲酯、磷酸乙酯、硫代磷酸乙酯、硼代磷酸酯(boranophosphate)、硼代硫代磷酸酯、硼代磷酸甲酯、硼代硫代磷酸甲酯、硼代膦酸甲酯、硼代硫代膦酸甲酯和它们的衍生物。另外的修饰包括亚磷酰胺、氨基磷酸酯、n3
’→
p5
’
氨基磷酸酯、磷酰二胺(phosphordiamidate)、硫代磷酰二胺、氨基磺酸酯、二亚甲基亚砜(dimethylenesulfoxide)、磺酸酯、三唑、乙二酰、氨基甲酸酯、亚甲基亚氨(methyleneimino)(mmi)、3
’-
s-硫代磷酸酯(org.biol.chem.2013，11，966)和硫代乙酰胺基核酸(tana)；和它们的衍生物。取决于它的长度，本发明的寡核苷酸可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32个骨架修饰。本发明也包含在所述寡核苷酸中引入不只一个不同的骨架修饰。
[0049]
在优选的实施方式中，本发明的寡核苷酸包含至少一个硫代磷酸酯修饰。在更优选的实施方式中，本发明的寡核苷酸是完全地硫代磷酸酯修饰的。
[0050]
本发明的其他化学修饰包括肽核酸(肽基础核酸，peptide-base)(pna)、硼簇修饰的pna、以吡咯烷为基础(pyrrolidine-based)的氧基肽核酸(popna)、以乙二醇或丙三醇为基础(glycol-or glycerol-based)的核酸(gna)、以苏糖为基础的核酸(tna)、以非环状苏氨醇为基础的核酸(atna)、以吗啉代为基础的寡核苷酸(pmo、ppmo、pmo-x)、以阳离子吗啉代为基础的寡聚物(pmoplus)、具有整合的碱基和骨架的寡核苷酸(onib)、吡咯烷-酰胺寡核苷酸(pom)；和它们的衍生物。
[0051]
在另一个实施方式中，寡核苷酸包含肽核酸和/或吗啉代磷酰二胺或它的衍生物。
[0052]
在另一个实施方式中，寡核苷酸包含在5
’
末端残基的5
’-
位置上的单硫代磷酸酯部分和/或在3
’
末端残基的3
’-
位置上的单硫代磷酸酯部分。显示这些单硫代磷酸酯基团改善寡核苷酸稳定性(例如，美国专利申请us 20120148664-miragen)。
[0053]
随着核酸模拟技术的出现，产生与它自身的核酸在类型方面具有相似的、优选相同的但是在量方面不一定相似的、优选相同的杂交特性的分子成为可能。当然，这样的功能性等价物也适用于本发明。
[0054]
技术人员将明白，可以不以相同的方式修饰每个糖、碱基和/或骨架。可将几个不同的修饰的糖、碱基和/或骨架组合到本发明的一个单一的寡核苷酸中。
[0055]
本领域的技术人员也将认识到，存在很多寡核苷酸的合成的衍生物。骨架修饰包含rna中存在的磷酸二酯的修饰的变体，如硫代磷酸酯(ps)、手性纯的硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯(ps2)、磷酰基乙酸酯(pace)、磷酰基乙酰胺(paca)、硫代磷酰基乙酸酯、硫代磷酰基乙酰胺、硫代磷酸酯药物前体、h-膦酸酯、膦酸甲酯、硫代膦酸甲酯、磷酸甲酯、硫代磷酸甲酯、磷酸乙酯、硫代磷酸乙酯、硼代磷酸酯、硼代硫代磷酸酯、硼代磷酸甲酯、硼代硫代磷酸甲酯、硼代膦酸甲酯、硼代硫代磷酸甲酯和它们的衍生物。另外的修饰包含亚磷酰胺、氨基磷酸酯、n3
’→
p5
’
氨基磷酸酯、磷酰二胺、硫代磷酰二胺、氨基磺酸酯、二亚甲基亚砜、磺酸酯和硫代乙酰胺基核酸(tana)；和它们的衍生物。
[0056]
优选地，所述寡核苷酸包含rna，因为rna/rna双链体是非常稳定的。优选的是rna寡核苷酸包含为rna提供另外的性质的修饰，例如，对核酸内切酶、核酸外切酶和rna酶h的抵抗，另外的杂交强度、增加的稳定性(例如，在体液中)、增加的或减少的柔韧性、增加的活性、降低的毒性、增加的细胞内运输、组织特异性等。另外，优选地，与本发明的寡核苷酸复合的mrna不易受rna酶h切割的影响。在上文识别了优选的修饰。
[0057]
因此，本发明提供包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成的并且包含5-甲基嘧啶和/或2，6-二氨基嘌呤碱基的寡核苷酸。最优选地，这种寡核苷酸由通过硫代磷酸酯骨架连接的2
’-
o-甲基rna单体组成，并且独立地，分别地由5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶和/或2，6-二氨基嘌呤取代所有的它的胞嘧啶和/或所有的它的尿嘧啶和/或所有的它的腺嘌呤。本发明包含的和此处公开的优选的修饰的和未修饰的寡核苷酸包含或由选自如在表格1中识别的seq id no：14-seq id no：90中的一个的碱基序列或核苷酸序列组成。表述“由选自seq id no：14-seq id no：90的核苷酸或碱基序列表示的寡核苷酸”可被表述“由选自seq id no：14-seq id no：90中的一个的核苷酸或碱基序列表示的寡核苷酸”代替或被表述“由选自seq id no：14-seq id no：90的列表的核苷酸或碱基序列表示的寡核苷酸”代替。同样适用于此处提到的seq id no的其他组。
[0058]
优选的未修饰的寡核苷酸源自seq id no：14-seq id no：90中的一个并且本发明包含的和此处公开的优选的未修饰的寡核苷酸包含选自seq id no：91、seq id no：93-seq id no：170的碱基或核苷酸序列中的一个或由选自seq id no：91、seq id no：93-seq id no：170的碱基或核苷酸序列中的一个组成。
[0059]
优选地，修饰的寡核苷酸源自seq id no：14-seq id no：90中的一个并且本发明包含的和此处公开的修饰的寡核苷酸包含选自seq id no：92、seq id no：171-seq id no：213、seq id no：215的碱基或核苷酸序列中的一个或由选自seq id no：92、seq id no：
171-seq id no：213、seq id no：215的碱基或核苷酸序列中的一个组成。
[0060]
请注意，存在于序列表中的两个seq id no是相同的：seq id no：91与seq id no：132相同。seq id no：92与seq id no：199相同。
[0061]
在表1-表3中和在序列表中公开表示这些寡核苷酸中的每一个的序列。稍后在说明书中，更详细地描述最优选的寡核苷酸。
[0062]
因此，本发明的寡核苷酸可具有：
[0063]
用5-甲基胞嘧啶代替的至少一个并且优选地所有的胞嘧啶，
[0064]
用5-甲基胞嘧啶代替的至少一个和优选地所有的胞嘧啶和用5-甲基尿嘧啶代替的至少一个和优选地所有的尿嘧啶，
[0065]
用5-甲基胞嘧啶代替的至少一个和优选地所有的胞嘧啶和用2，6-二氨基嘌呤代替的至少一个和优选地所有的腺嘌呤，
[0066]
用5-甲基胞嘧啶代替的至少一个和优选地所有的胞嘧啶和用5-甲基尿嘧啶代替的至少一个和优选地所有的尿嘧啶以及用2，6-二氨基嘌呤代替的至少一个和优选地所有的腺嘌呤，
[0067]
用5-甲基尿嘧啶代替的至少一个和优选地所有的尿嘧啶，
[0068]
用5-甲基尿嘧啶代替的至少一个和优选地所有的尿嘧啶和用2，6-二氨基嘌呤代替的至少一个和优选地所有的腺嘌呤，或
[0069]
用2，6-二氨基嘌呤代替的至少一个和优选地所有的腺嘌呤。
[0070]
然而，寡核苷酸也可具有至少一个或至少两个或至少一半或所有的用5-甲基胞嘧啶代替的它的胞嘧啶。如果优选地基于seq id no：14-seq id no：90的本发明的未修饰的寡核苷酸具有x个胞嘧啶，x是范围为1至33的整数，则本发明的相应的修饰的寡核苷酸可具有1、2、3、...(x-2)、(x-1)、x个5-甲基胞嘧啶。如果在这样的未修饰的寡核苷酸中x是3，则相应的修饰的寡核苷酸中的5-甲基胞嘧啶的数目是1、2或3。
[0071]
如果在这样的未修饰的寡核苷酸中x是4，则相应的修饰的寡核苷酸中的5-甲基胞嘧啶的数目是1、2、3或4。
[0072]
如果在这样的未修饰的寡核苷酸中x是5，则相应的修饰的寡核苷酸中的5-甲基胞嘧啶的数目是1、2、3、4或5。
[0073]
如果在这样的未修饰的寡核苷酸中x是6，则相应的修饰的寡核苷酸中的5-甲基胞嘧啶的数目是1、2、3、4、5或6。
[0074]
如果在这样的未修饰的寡核苷酸中x是7，则相应的修饰的寡核苷酸中的5-甲基胞嘧啶的数目是1、2、3、4、5、6或7。
[0075]
如果在这样的未修饰的寡核苷酸中x是8，则相应的修饰的寡核苷酸中的5-甲基胞嘧啶的数目是1、2、3、4、5、6、7或8。
[0076]
同样适用于用5-甲基尿嘧啶代替的尿嘧啶和用2，6-二氨基嘌呤代替的腺嘌呤。
[0077]
优选地，本发明的寡核苷酸用作用于dmd的药物，更优选地，所述寡核苷酸用于治疗性rna调节。因此，寡核苷酸是反义寡核苷酸(aon)。反义寡核苷酸是与源自个体的dna的编码正义(有义)链的dmd或肌养蛋白前体mrna的特异序列反向互补的寡核苷酸。这种寡核苷酸结合至和/或靶向和/或杂交和/或能够结合至和/或能够靶向和/或能够杂交所述前体mrna的所述序列。针对dmd的rna调节的目标是跳读dmd或肌养蛋白前体mrna中的一个或更
多个特异性外显子以便修复转录本的开放阅读框和诱导较短但是(更具)功能的肌养蛋白蛋白质的表达，具有能够干扰疾病的进程的最终目的。
[0078]
因此，在优选的实施方式中，本发明的寡核苷酸用于诱导细胞、器官、组织和/或个体中的dmd或肌养蛋白前体mrna的外显子跳读。外显子跳读产生不含有被跳读的外显子的成熟dmd或肌养蛋白mrna，并因此，当为氨基酸编码所述外显子时，可产生表达较短的蛋白质产物。优选地，通过将aon结合至包含剪接调控因子、剪接位点和/或内含子分支点序列的特异性外显子-内部序列来诱导外显子的跳读。
[0079]
如此处限定的，优选地，dmd前体mrna意味着编码肌养蛋白蛋白质的dmd基因的前体mrna。当与未受影响的人的野生型dmd前体mrna相比时，突变的dmd前体mrna对应于具有突变的bmd或dmd患者的前体mrna，产生(减少的水平的)异常的蛋白质(bmd)，或缺少功能性肌养蛋白(dmd)。dmd前体mrna也被称为肌养蛋白前体mrna。dmd基因也可被称为肌养蛋白基因。遍及申请可交换地使用肌养蛋白和dmd。
[0080]
优选地，患者意在意味着具有如本文稍后限定的dmd或bmd的患者或由于他的或她的遗传背景对发展dmd或bmd敏感的患者。在dmd患者的情况中，优选地，使用的寡核苷酸将纠正如存在于所述患者的dmd基因中的一个突变并产生将看起来像bmd蛋白质的蛋白质：优选地，所述蛋白质将是功能性的或半功能性的肌养蛋白，如本文稍后限定的。在bmd患者的情况中，优选地，如使用的寡核苷酸将纠正如存在于所述患者的bmd基因中的一个突变并产生比最初存在于所述bmd患者的肌养蛋白更具功能的肌养蛋白。
[0081]
如此处限定的，优选地，功能性肌养蛋白是对应于具有如在seq id no：1中确定的氨基酸序列的蛋白质的野生型肌养蛋白。如此处限定的，优选地，半功能性肌养蛋白是bmd样肌养蛋白，其对应于具有在它的n-末端部分中的起作用的结合结构域(在n末端第一个240个氨基酸)、富含半胱氨酸结构域(氨基酸3361直到3685)和c末端结构域(在c末端上的最后的325个氨基酸)的蛋白质，如技术人员已知的，这些结构域中的每一个存在于野生型肌养蛋白中。此处指示的氨基酸对应于由seq id no：1表示的野生型肌养蛋白的氨基酸。换句话说，功能性或半功能性肌养蛋白是至少表现某种程度上的野生型肌养蛋白的活性的肌养蛋白。优选地，“至少某种程度”意味着野生型功能性肌养蛋白的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的相应的活性。在这个背景下，优选地，功能性肌养蛋白的活性结合至肌动蛋白并结合至肌养蛋白-相关的糖蛋白复合体(dgc或dapc)(ehmsen j等人，2002)。
[0082]
如技术人员已知的，在处理前和/或处理后，从来自怀疑是营养不良的肌肉的对照(非dmd)活组织检查，可通过使用总蛋白提取物的免疫共沉淀或使用与复合体的不同成员起反应的多种抗体的横截面的免疫荧光分析，使肌养蛋白与肌动蛋白以及与dgc或dapc复合体的结合可视化。
[0083]
典型地，患有杜兴型肌营养不良的个体或患者在编码肌养蛋白基因(dmd或肌养蛋白基因)中具有突变，其在阻止完整蛋白质的合成，即，过早的(premature)终止密码子阻止了c-末端的合成。在贝克型肌营养不良中，与野生型相比，肌养蛋白基因也包含突变，但是典型地，突变没有产生过早的终止密码子和典型地，合成了c-末端。结果，合成了具有在类型上至少与野生型蛋白质相同的活性的功能性或半功能性肌养蛋白，尽管在活性的量上不一定相同。典型地，bmd患者的基因组编码肌养蛋白蛋白质，其包含n末端部分(在n末端上的
第一个240个氨基酸)、富含半胱氨酸结构域(氨基酸3361直到3685)和c-末端结构域(c-末端上的最后325个氨基酸)，但是在多数情况中，它的中心杆状结构域(rod shaped domain)比野生型肌养蛋白的那个短(monaco等人，1988)。典型地，用于dmd的治疗的反义寡核苷酸-诱导的外显子跳读涉及通过跳读外显子(优选地，在中央杆状结构域形状的结构域中)克服前体-mrna中的过早的终止，以纠正开放阅读框和允许合成包含c-末端的剩余的肌养蛋白蛋白质，即使(albeit that)由于更小的杆状结构域蛋白质略小。在优选的实施方式中，具有dmd并且通过如此处限定的寡核苷酸治疗的个体将提供至少表现某些程度的野生型肌养蛋白质的活性的肌养蛋白。更优选地，如果所述个体是杜兴型肌营养不良患者或被怀疑是杜兴型肌营养不良患者，功能性或半功能性肌养蛋白是具有bmd的个体的肌养蛋白：典型地，所述肌养蛋白能够与肌动蛋白和dgc或dapc相互作用，但是它的中心杆状结构域可以比野生型肌养蛋白的那个短(monaco等人，1988)。野生型肌养蛋白的中心杆状结构域包含24个血影蛋白样重复。例如，如本文所提供的肌养蛋白的中心杆状结构域可包含5至23、10至22或12至18个血影蛋白样重复，只要它可结合至肌动蛋白和dgc。
[0084]
可以通过下列分析中中任一项评估使用本发明的寡核苷酸使个体中的杜兴型肌营养不良或贝克型肌营养不良的一个或更多个症状减轻：步行损失的时间的延长、肌肉强度的改善、举起重量的能力的改善、从地面起立需要的时间的改善、九米步行时间的改善、四楼梯攀爬需要的时间的改善、腿功能等级的改善、肺功能的改善、心脏功能的改善、生活品质的改善。技术人员已知这些分析中的每一个。作为实例，manzur et al(2008)的出版物给出这些实验中的每一个的广泛性解释。对于这些实验中的每一个，只要发现实验中测量的参数的可检测的改善或延长，优选地，它就将意味着，使用本发明的寡核苷酸减轻了个体的杜兴型肌营养不良或贝克型肌营养不良的一个或更多个症状。优选地，可检测的改善或延长是如在hodgetts等人(2006)中描述的统计学上显著的改善或延长。可替代地，可通过测量肌肉纤维功能、完整性和/或存活的改善评估杜兴型肌营养不良或贝克型肌营养不良的一个或更多个症状的减轻。在优选的方法中，减轻dmd或bmd患者的一个或更多个症状和/或改善来自dmd或bmd患者的一个或更多个肌细胞的一个或更多个特征。可在细胞、组织水平或在患者自身上评估这些症状或特征。
[0085]
可在来自患者的肌原性细胞或肌肉细胞上通过下列分析中中任一项评估来自患者的肌肉细胞的一个或更多个特征的减轻：减少的由肌肉细胞摄取的钙、减少的胶原合成、改变的形态学、改变的脂质生物合成、减少的氧化应激和/或改善的肌肉纤维功能、完整性和/或存活。通常使用肌肉活组织检查的横截面的免疫荧光和/或组织化学分析评估这些参数。
[0086]
可以使用至少一个下列分析评估肌肉纤维功能、完整性和/或存活的改善：血液中的肌酸激酶的可检测的减少、怀疑是营养不良的肌肉的活组织检查横截面中的肌肉纤维的坏死的可检测的减少和/或怀疑是营养不良的肌肉的活组织检查横截面中的肌肉纤维的直径的均匀性的可检测的增加。技术人员已知这些分析中的每一个。
[0087]
如在hodgetts等人(2006)中描述的，可以检测血液中的肌酸激酶。肌酸激酶的可检测的减少可以意味着，与在治疗之前的相同的dmd或bmd患者中的肌酸激酶的浓度相比，5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的减少。
[0088]
优选地，在肌肉活组织检查中评估肌肉纤维的坏死的可检测的减少，更优选地，如
hodgetts等人(2006)描述的，使用活组织检查横截面。坏死的可检测的减少可以是5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的面积的减少，其中使用活组织检查横截面确定坏死。通过与在处理之前的相同的dmd或bmd患者中相同评估的坏死相比较测量减少。
[0089]
优选地，在肌肉活组织检查横截面中评估肌肉纤维的直径的均匀性的可检测的增加，更优选地，如hodgetts等人(2006)描述的。通过与在处理之前的相同的dmd或bmd患者的肌肉纤维的直径均匀性相比较测量增加。
[0090]
优选地，本发明的寡核苷酸为所述个体提供功能性或半功能性肌养蛋白蛋白质(典型地，在dmd的情况中)，并且能够至少部分地减少所述个体中的异常的肌养蛋白蛋白质的产生(典型地，在bmd的情况中)。
[0091]
异常肌养蛋白mrna或异常肌养蛋白质的产生的减少，优选地，意味着异常肌养蛋白mrna或异常肌养蛋白质的最初量的90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％或更少，仍然是通过rt pcr(mrna)或免疫荧光或蛋白质印记分析(蛋白质)可检测的。异常肌养蛋白mrna或蛋白质此处也被称为较低功能性(与如此处早前限定的野生型功能性肌养蛋白相比)或非功能性肌养蛋白mrna或蛋白质。优选地，非功能性肌养蛋白蛋白质是不能结合肌动蛋白和/或dgc蛋白质复合体的成员的肌养蛋白蛋白质。典型地，非功能性肌养蛋白蛋白质或肌养蛋白mrna不具有或不编码具有蛋白质的完整的c-末端的肌养蛋白蛋白质。对于异常的肌养蛋白mrna或蛋白质，可以完成功能性或半功能性肌养蛋白mrna或蛋白质的检测。
[0092]
一旦dmd患者拥有功能性或半功能性肌养蛋白蛋白质，消除dmd的至少部分的原因。因此，那么可预期的是至少部分地减轻dmd的症状。增强的跳读频率也增加dmd或bmd个体的肌肉细胞中产生的功能性或半功能性肌养蛋白蛋白质的水平。
[0093]
外显子含有一个或更多个包含剪接调控元件的特异性序列，显示其是用于反义寡核苷酸的有效的靶(aartsma-rus et al，2010)。因此，一个实施方式提供寡核苷酸，用于向所述个体提供功能性或半功能性肌养蛋白蛋白质，其中所述寡核苷酸包含特异性地结合、靶向和/或杂交于和/或阻断肌养蛋白前体mrna中的这些剪接调控元件的序列。这样的寡核苷酸也能够结合和/或靶向和/或与肌养蛋白前体mrna中的这些剪接调控元件杂交和/或阻断所述调控元件。另外，当由剪接体复合体识别两个剪接位点时，因为外显子只能被包含在合成的mrna内，所以剪接位点是用于本发明的寡核苷酸的另外的靶标。因此，一个实施方式提供用于向所述个体提供功能性或半功能性肌养蛋白蛋白质的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含特异性地结合和/或靶向和/或杂交于和/或阻断肌养蛋白前体mrna的外显子的一个或两个剪接位点的序列。这样的寡核苷酸也能够结合和/或靶向、与肌养蛋白前体mrna的外显子的这些剪接位点中的一个或两个杂交和/或阻断所述位点。通常，外显子的剪接位点包含存在于所述外显子中的1、2、3或更多的核苷酸和存在于邻近的或相邻的内含子中的1、2、3或更多核苷酸。在一个实施方式中，使用单独地结合至和/或靶向和/或杂交于肌养蛋白前体mrna的内含子区域的寡核苷酸。这样的寡核苷酸能够结合和/或能够靶向和/或能够杂交于所述内含子区域。然而，这不是一定的：也可能使用靶向和/或结合和/或杂交于和/或能够靶向和/或能够结合和/或能够杂交于内含子特异性序列以及外显子特异性序列的寡核苷酸。当然，寡核苷酸不一定结合至和/或靶向和/或杂交于肌养蛋白外显子或内含子的整
个序列。这样的寡核苷酸也不一定能够结合至和/或能够靶向和/或能够杂交于肌养蛋白外显子或内含子的整个序列。优选特异性地结合、靶向和/或杂交于和/或特异性地能够结合和/或能够靶向和/或能够杂交于所述外显子或内含子的部分的寡核苷酸。使用寡核苷酸，优选地，所述寡核苷酸反向互补于，和/或结合至，和/或靶向和/或杂交于和/或能够结合至和/或能够靶向和/或能够杂交于肌养蛋白外显子和/或内含子的至少部分，所述部分具有至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸。
[0094]
经由涉及内含子分支点(branch point)和邻近的内含子的剪接位点的两个连续的酯基转移反应发生肌养蛋白前体-mrna的剪接。因此，寡核苷酸用于外显子跳读，其中所述寡核苷酸包含结合至和/或靶向和/或杂交于、或能够结合至和/或能够靶向和/或能够杂交于这样的分支点和/或剪接位点的序列。优选地，所述剪接位点和/或分支点存在于肌养蛋白前体mrna中。
[0095]
因为剪接位点含有共有序列，包含具有结合至和/或能够结合至和/或能够靶向和/或能够杂交和/或结合至和/或靶向和/或杂交于剪接位点的能力的序列的寡核苷酸部分或它的功能等价物的应用包含偶然地杂交的风险。所述寡核苷酸与其他剪接位点而不是要跳读的外显子的位点的杂交可容易地干扰剪接过程的准确性。为了克服与寡核苷酸的应用相关的这些和其他潜在的问题，其中所述寡核苷酸结合和/或杂交和/或靶向和/或能够结合至和/或能够靶向和/或能够杂交剪接位点，最优选的实施方式提供用于为所述个体提供功能性或半功能性肌养蛋白蛋白质的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸和它的功能等价物，结合至和/或杂交于和/或靶向和/或能够结合至和/或能够杂交和/或能够靶向肌养蛋白前体mrna外显子的特异性部分。外显子含有编码序列，典型地，其是比非编码内含子序列更加特异性的。优选地，结合至和/或与肌养蛋白前体mrna外显子的特异性部分杂交和/或靶向和/或能够结合至和/或能够杂交于和/或能够靶向所述特异性部分的所述寡核苷酸能够特异性地阻断、干扰和/或抑制所述肌养蛋白前体mrna中的预期的一个或多个外显子的剪接调控序列和/或结构。干扰这样的剪接调控序列和/或结构具有这样的元件位于外显子内的优势。因此，限制了序列相关的脱靶影响的风险。通过提供用于要跳读的外显子的内部的寡核苷酸，有可能从剪接装置(splicing apparatus)掩蔽外显子。因此，剪接装置识别要跳读的外显子的失败导致外显子从最终的mrna的排除。这个实施方式不直接地干扰剪接机制的酶促过程(外显子的加入)。人们认为，这允许更加特异性和/或可靠的方法。也发现，具有结合至和/或能够结合至和/或能够靶向和/或能够杂交和/或结合至和/或杂交于和/或靶向所述外的显子任何点的能力的寡核苷酸可以诱导所述外显子的跳读。
[0096]
在本发明的背景内，本发明的寡核苷酸可以包含寡核苷酸的功能等价物或等价物。优选地，寡核苷酸的功能等价物或等价物意味着其中已经取代一个或更多个核苷酸和其中保留至少某种程度的所述功能等价物或等价物的活性的此处限定的寡核苷酸。优选地，包含寡核苷酸的功能等价物或等价物的所述寡核苷酸的活性提供功能性或半功能性肌养蛋白蛋白质。因此，优选地，通过使功能或半功能性肌养蛋白蛋白质的量量化来评估包含寡核苷酸的功能等价物或等价物的所述寡核苷酸的所述活性。此处，优选地，将功能性或半功能性肌养蛋白限定为能够结合肌动蛋白和dgc(或dapc)蛋白质复合体的成员的肌养蛋白。优选地，通过rt-pcr和测序(在rna水平上；用于特异性外显子跳读的检测)，或通过免疫
荧光和蛋白质印记分析(在蛋白质水平上：用于蛋白质修复的检测)完成寡核苷酸的所述功能等价物的所述活性的评估。当它表示至少50％、或至少60％、或至少70％或至少80％或至少90％或至少95％或更多的功能等价物或等价物来源的所述寡核苷酸的的相应的活性时，优选地，保留至少某些程度的所述活性。遍及这个申请，当使用单词寡核苷酸时，可通过如此处限定的它的功能等价物或它的等价物代替它。在实施方式中，本发明的寡核苷酸的等价物或功能等价物包含修饰。遍及这个申请，当使用单词寡核苷酸时，除非另外指出，否则可以由如此处限定的反义寡核苷酸代替它。
[0097]
当与如此处早前指示的不包含任何5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶和2，6-二氨基嘌呤的它们的相对物相比(即，所谓的未修饰的寡核苷酸)时，如此处已经限定的，假设寡核苷酸或它的功能等价物，或它的等价物的应用对所述寡核苷酸的至少一种参数具有积极的效果(其中所述寡核苷酸或它的功能等价物，或它的等价物包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成并且包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基，并且由包含或由与肌养蛋白前体mrna外显子反向互补、和/或结合至和/或靶向和/或杂交和/或能够结合至和/或能够靶向和/或能够杂交于所述外显子的序列组成的核苷酸序列表示)，并因此假设其在患者的dmd或bmd细胞中和/或dmd或bmd患者中表现改善的治疗结果。这样的治疗结果的特征可以是：
[0098]-减轻dmd或bmd的一个或更多个症状和/或
[0099]-减轻来自患者的肌肉细胞的一种或更多特征和/或
[0100]-为所述个体提供功能性或半功能性肌养蛋白蛋白质和/或
[0101]-至少部分地减少所述个体中的异常肌养蛋白蛋白质的产生。
[0102]
此处已经限定了这些特征中的每一个。
[0103]
优选地，由包含或由结合至和/或靶向和/或反向互补于和/或杂交于和/或能够结合至和/或能够靶向和/或能够杂交于和/或反向互补于肌养蛋白前体mrna外显子44至55的至少部分的序列组成的核苷酸序列表示寡核苷酸，所述寡核苷酸具有至少10个核苷酸的长度。然而，所述寡核苷酸的长度可以是至少11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸。遍及本发明，表示寡核苷酸的所述序列也可被称为碱基或核苷酸序列。
[0104]
优选地，由包含或由具有结合至、和/或靶向和/或与肌养蛋白前体mrna的外显子的至少部分反向互补和/或与所述部分杂交和/或能够结合至和/或能够与所述部分杂交和/或能够靶向所述部分的能力的序列组成的核苷酸序列或碱基序列表示本发明的寡核苷酸。所述结合或靶向部分可以是本发明的寡核苷酸的长度的至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％或至少95％、98％或最高达100％。可以由核苷酸或碱基序列表示寡核苷酸，所述核苷酸或碱基序列包含结合和/或靶向和/或与选自由此处限定的肌养蛋白前体mrna的外显子44至55和另外的侧翼序列组成的组的外显子的至少部分反向互补和/或与所述部分杂交和/或能够结合至和/或能够与所述部分杂交和/或能够靶向所述部分的序列。在更优选的实施方式中，所述寡核苷酸的所述结合或靶向部分的长度是至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。可使用几种类型的侧翼序列。优选地，侧翼序列用于修饰蛋白质与所述寡核苷酸的结合，或修饰所述寡核苷酸的热力学性质，更优选地，修饰靶rna结合亲和力。在另一个优选
的实施方式中，另外的侧翼序列与不存在于所述外显子中的肌养蛋白前体mrna的序列反向互补。优选地，这样侧翼序列能够结合至和/或靶向包含或由所述外显子的分支点和/或剪接位点受体或供体共有序列组成的序列。在优选的实施方式中，这样的侧翼序列能够结合至和/或靶向包含或由邻近所述外显子的肌养蛋白前体mrna的内含子的序列组成的序列。
[0105]
一个优选的实施方式提供用于向所述个体提供功能性或半功能性肌养蛋白蛋白质的寡核苷酸，由序列或碱基序列表示所述寡核苷酸或它的功能等价物或它的等价物，所述序列或碱基序列包含：
[0106]-结合、能够结合、靶向、杂交或与肌养蛋白前体mrna外显子的区域反向互补的序列，其中所述区域杂交至肌养蛋白前体mrna外显子的另一个部分(封闭的结构)，和
[0107]-结合和/或靶向和/或杂交和/或与肌养蛋白前体mrna外显子的区域反向互补和/或能够结合和/或能够靶向和/或能够与所述区域杂交的序列，其中所述区域不能在所述肌养蛋白前体mrna中杂交(开链结构)。
[0108]
对于这个实施方式，参考wo 2004/083446专利申请。主要地由于相同的rna内的互补的或部分地互补的链的碱基配对，rna分子表现强的二级结构。很久以来，人们认为，rna中的结构在rna的功能中起作用。不希望受到理论的限制，有人认为，外显子的rna的二级结构在剪接过程的结构化中起作用。通过它的结构，外显子被认为是需要被包含在mrna内的部分。在实施方式中，寡核苷酸能够干扰外显子的结构并因此能够干扰所述外显子的剪接装置，从剪接装置掩蔽外显子并因此诱导所述外显子的跳读。已经发现很多寡核苷酸确实包含这种能力，一些比其他的更有效。不希望受到理论的限制，有人认为，具有开链结构的重叠改善寡核苷酸的侵袭效率(即，增加寡核苷酸用所述重叠可以进入该结构的效率)，然而具有闭合结构的重叠随后增加干扰外显子的rna的二级结构的效率。人们发现，没有极端地限制与闭合结构和开链结构均部分反向互补的长度。发明人观察到包含寡核苷酸的化合物的高效率，其中所述寡核苷酸在任一结构中具有可变的反向互补的长度。术语(反向)互补此处用于指的是，在生理条件下，可杂交到核酸的另一个链的核酸的链。本文稍后限定杂交条件。因此，不是绝对要求互补的区域中的所有的碱基能够与相反的链中的碱基配对。例如，当设计反义寡核苷酸时，例如，可以想要包含不能与互补的链上的碱基碱基配对的残基。允许某些程度的错配，如果在细胞的环境下，核苷酸的链能够杂交到互补的部分上。
[0109]
在优选的实施方式中，反义寡核苷酸(对于所述开链或对于所述闭合结构)的反向互补部分包含至少3个，并且更优选地、至少4个连续的核苷酸。优选地，这样设计相反的互补区域，使得当组合时，它们对于pre-mrna中的外显子是特异的。可用反向互补区域的多种长度创造这样的特异性，因为这取决于系统中的其他(前体)mrna中的真实的序列。随着所述寡核苷酸的大小的增加，一个或更多个其他前体mrna将能够杂交至寡核苷酸的风险降低。很明显，包含反向互补的区域中的错配但是保留杂交至前体mrna中的一个或多个靶向区域的能力的反义寡核苷酸可用于本发明。然而，优选地，至少该反向互补部分不包含这样的错配，因为典型地，这些比在一个或更多个互补区域中具有这样的错配的寡核苷酸具有更高的效力和更高的特异性。认为更高的杂交强度(即，增加与相反链相互作用的数目)在增加干扰系统的剪接机构的过程的效率中是有利的。优选地，反向互补性是从90至100％。通常，在20个核苷酸的寡核苷酸中允许1或2个错配，或在40个核苷酸的寡核苷酸中允许1至4个错配。因此，发明人可在10至50核苷酸的寡核苷酸中具有1、2、3、4、5个错配。优选地，在
10至50个核苷酸的寡核苷酸中存在0、1或2个错配。
[0110]
最好在其中外显子存在的前体mrna的背景中分析结构(即，开链结构和闭合结构)。可在真实的rna中分析这样的结构。然而，目前可能的是，很好地使用结构建模程序预测rna分子的二级结构(最低能量消耗)。适当的程序的非限制性实例是rna structure版本4.5或rna mfold版本3.5(zuker等人，2003)。本领域的技术人员将能够用适当的再现性、考虑核苷酸序列来预测外显子的可能结构。当向这样的建模程序提供所述外显子和侧翼内含子序列二者时获得最好的预测。典型地，不一定模拟整个前体mrna的结构。
[0111]
优选地，寡核苷酸的寡核苷酸涉及的开链结构和闭合结构彼此邻近。有人认为，这样，寡核苷酸与开链结构的退火诱导闭合结构的打开，于是，退火过程进入该闭合的结构。通过这种作用，以前闭合的结构采取(assume)不同的构造。然而，当潜在的(隐藏的(cryptic))剪接受体和/或供体序列存在于靶向外显子内时，偶然地产生限定不同的(新)的外显子的新的外显子内含信号或剪接调控序列、要素、结构或信号，即，具有不同的5
’
末端，不同的3
’
末端，或两者。因为从mrna排除靶向外显子，这种类型的活性落入本发明的范围内。mrna中，含有靶向外显子的部分的新的外显子的存在不改变事实，即，同样地，排除了该靶向的外显子。可将该新外显子(neo-exon)的内含看作只偶然地出现的副作用。当将外显子跳读用于修复由于突变而被破坏的肌养蛋白的开放阅读框(的部分)时，存在两种可以性。一种是，新外显子在阅读框的修复中是功能性，然而，在其他情况中，不修复阅读框。当选择包含借助于外显子跳读的方式用于修复肌养蛋白阅读框的寡核苷酸的化合物时，当然，清楚的是，在这些条件下，只能选择包含那些寡核苷酸的那些化合物，其具有或不具有新外显子，确实产生了修复肌养蛋白开放阅读框的外显子跳读。
[0112]
进一步提供的是用于向所述个体提供功能性或半功能性肌养蛋白蛋白质的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸或它的功能等价物或它的等价物包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成并且包含5-甲基吡啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基，并且由这样的核苷酸或碱基序列表示，其中所述核苷酸或碱基序列包含与用于肌养蛋白前体mrna的外显子的rna中的丝氨酸-精氨酸(sr)蛋白质的结合位点反向互补和/或结合至和/或靶向和/或能够与所述结合位点杂交的序列。在wo 2006/11270专利申请中，发明人公开了外显子内部的反义寡核苷酸在诱导外显子跳读中的效力和所述aon的靶前体-mrna位点中的预测的(例如，通过esefinder)sr结合位点的存在之间的相关性。因此，在一个实施方式中，产生了寡核苷酸，包含确定肌养蛋白外显子的rna中的sr(ser-arg)蛋白质的(假定的)结合位点和产生包含寡核苷酸的相应的化合物，所述寡核苷酸与所述rna反向互补和/或结合至和/或靶向所述rna和/或与所述rna杂交和/或能够结合和/或能够靶向所述rna和/或能够与所述rna杂交，并且至少部分地重叠所述(假定的)结合位点。术语“至少部分地重叠”此处限定为包含只有sr结合位点的单一核苷酸的重叠以及所述结合位点的多个核苷酸的重叠以及所述结合位点的完全的重叠。优选地，这个实施方式进一步包含由所述rna的二级结构确定的、与所述rna的另一个部分杂交的区域(闭合结构)和不能在所述结构中杂交的区域(开链结构)，并且随后形成至少部分地重叠所述(假定的)结合位点并且重叠所述闭合结构的至少部分和重叠所述开链结构的至少部分的寡核苷酸。这样，发明人增加获得能够干扰从前体mrna到mrna的外显子内含的寡核苷酸的机会。可能的是，第一选择的sr-结合区域不具有要求的开链-闭合结构，在这种情况
下，选择另一个(第二)sr蛋白结合位点，然后，其随后对开链-闭合结构的存在进行检验。继续这个过程，直到识别含有sr蛋白质结合位点以及(部分地重叠的)开链-闭合结构的序列。然后，将这个序列用于设计与所述序列反向互补的寡核苷酸。
[0113]
同样地，通过使所描述的顺序反向来进行用于产生反义寡核苷酸的这样的方法，即，首先产生寡核苷酸，包括由来自肌养蛋白外显子的rna的二级结构确定假设杂交到所述rna的另一个部分的结构的区域(闭合结构)和不能杂交在所述结构中的区域(开链结构)，和随后产生寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的至少部分与所述闭合结构反向互补并且其中所述寡核苷酸的至少另一部分与所述开链结构反向互补。然后，这之后是确定sr蛋白质结合位点是否至少与所述开链/闭合结构重叠。以这样的方式改进wo 2004/083446的方法。在又一个实施方式中，同时地进行选择。
[0114]
不希望受到任何理论的限制，目前应该认为，使用指向或靶向sr蛋白质结合位点的寡核苷酸导致(至少部分地)削弱sr蛋白质与sr蛋白质的结合位点的结合，其导致破坏的或受损的剪接。
[0115]
优选地，开链/闭合结构和sr蛋白质结合位点部分地重叠和甚至更优选的、开链/闭合结构完全地重叠sr蛋白质结合位点，或sr蛋白质结合位点完全地重叠开链/闭合结构。这允许改善的外显子内含物的破坏。
[0116]
除了共同的剪接位点和分支点内含子序列之外，很多(如果不是所有的)外显子含有剪接调控序列，如但不限于外显子剪接增强子(ese)序列，以通过剪接体促进真实(genuine)剪接位点的识别(cartegni等人，2002；和cartegni等人，2003)。剪接因子(叫做sr蛋白质)的子组可结合至这些ese并且将其他剪接因子，如u1和u2af招募至(微弱地限定的)剪接位点。详细地分析了四种最丰富的sr蛋白质(sf2/asf、sc35、srp40和srp55)的结合位点，并且在esefinder中进行这些结果，预测这些sr蛋白质的潜在的结合位点的网络来源(cartegni等人，2002；和cartegn等人，2003)。在寡核苷酸的有效性和通过所述寡核苷酸靶向的位点中的sf2/asf、sc35和srp40结合位点的存在/缺少之间存在相互关系。因此，在优选的实施方式中，本发明提供如上述描述的寡核苷酸，其反向互补于和/或靶向和/或结合至和/或杂交于和/或能够靶向和/或能够结合和/或能够杂交于sr蛋白质的结合位点。优选地，所述sr蛋白质是sf2/asf或sc35或srp40。
[0117]
在一个实施方式中，通过使用包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成的并且包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱的、并且具有特异性地结合或靶向和/或能够结合和/或能够靶向和/或能够杂交转录本中的肌养蛋白外显子的正确的剪接所需要的调控性rna序列的能力的寡核苷酸或它的功能等价物或它的等价物，向dmd患者提供功能性或半功能性肌养蛋白蛋白质。转录本中的外显子的正确的剪接需要几个顺式作用rna序列。具体地，认为元件如外显子剪接增强子(ese)、外显子识别序列(ers)和/或外显子剪接沉默子(ess)调节组成型(constitutive)和可替代的外显子的特异性的和有效的剪接。使用结合至和/或靶向和/或反向互补于和/或杂交于和/或能够结合和/或能够杂交于和/或能够靶向元件的序列特异性的反义寡核苷酸或碱基特异性的反义寡核苷酸(aon)，它们的调控功能被干扰使得外显子被跳读，如对于dmd所显示的。因此，在一个优选的实施方式中，使用寡核苷酸或它的功能等价物或它的等价物，其反向互补于和/或结合至和/或靶向和/或杂交于和/或能够结合至
和/或能够靶向和/或能够杂交于外显子剪接增强子(ese)、外显子识别序列(ers)和/或外显子剪接沉默子(ess)。
[0118]
在优选的实施方式中，本发明的寡核苷酸包含序列或碱基序列或由序列或碱基序列组成，所述序列或碱基序列反向互补于和/或结合至和/或靶向和/或杂交于和/或能够结合至和/或能够靶向和/或能够杂交于肌养蛋白前体mrna外显子44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54或55的至少部分，所述部分具有至少10个核苷酸。然而，所述部分可具有至少11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸。对于上述确定的肌养蛋白外显子，发明人提供所述外显子的核苷酸的链(下面确定的seq id no：2至seq id no：13)，其中寡核苷酸结合至/或反向互补于和/或靶向和/或杂交于和/或能够结合至和/或能够靶向和/或能够杂交于所述链。
[0119]
5
’-
gcgauuugacagaucuguugagaaauggcggcguuuucauuaugauauaaagauauuuaaucaguggcuaacagaagcugaacaguuucucagaaagacacaaauuccugagaauugggaacaugcuaaauacaaaugguaucuuaag-3
’
(seq id no：2)用于外显子44的跳读；
[0120]
5
’-
gaacuccaggauggcauugggcagcggcaaacuguugucagaacauugaaugcaacuggggaagaaauaauucagcaauccucaaaaacagaugccaguauucuacaggaaaaauugggaagccugaaucugcgguggcaggaggucugcaaacagcugucagacagaaaaaagag-3
’
(seq id no：3)用于外显子45的跳读；
[0121]
5
’-
gcuagaagaacaaaagaauaucuugucagaauuucaaagagauuuaaaugaauuuguuuuaugguuggaggaagcagauaacauugcuaguaucccacuugaaccuggaaaagagcagcaacuaaaagaaaagcuugagcaagucaag-3
’
(seq id no：4)用于外显子46的跳读；
[0122]
5
’-
uuacugguggaagaguugccccugcgccagggaauucucaaacaauuaaaugaaacuggaggacccgugcuuguaagugcucccauaagcccagaagagcaagauaaacuugaaaauaagcucaagcagacaaaucuccaguggauaaag-3
’
(seq id no：5)用于外显子47的跳读；
[0123]
5
’-
guuuccagagcuuuaccugagaaacaaggagaaauugaagcucaaauaaaagaccuugggcagcuugaaaaaaagcuugaagaccuugaagagcaguuaaaucaucugcugcugugguuaucuccuauuaggaaucaguuggaaauuuauaaccaaccaaaccaagaaggaccauuugacguucag-3
’
(seq id no：6)用于外显子48的跳读；
[0124]
5
’-
gaaacugaaauagcaguucaagcuaaacaaccggauguggaagagauuuugucuaaagggcagcauuuguacaaggaaaaaccagccacucagccagugaag-3
’
(seq id no：7)用于外显子49的跳读；
[0125]
5
’-
aggaaguuagaagaucugagcucugaguggaaggcgguaaaccguuuacuucaagagcugagggcaaagcagccugaccuagcuccuggacugaccacuauuggagccu-3
’
(seq id no：8)用于外显子50的跳读；
[0126]
5
’-
cuccuacucagacuguuacucuggugacacaaccugugguuacuaaggaaacugccaucuccaaacuagaaaugccaucuuccuugauguuggagguaccugcucuggcagauuucaaccgggcuuggacagaacuuaccgacuggcuuucucugcuugaucaaguuauaaaaucacagagggugauggugggugaccuugaggauaucaacgagaugaucaucaagcagaag-3
’
(seq id no：9)用于外显子51的跳读；
[0127]
5
’-
gcaacaaugcaggauuuggaacagaggcguccccaguuggaagaacucauuaccgcugcccaaaauuugaaaaacaagaccagcaaucaagaggcuagaacaaucauuacggaucgaa-3
’
(seq id no：10)用于外显子52的跳读；
[0128]
5
’-
uugaaagaauucagaaucagugggaugaaguacaagaacaccuucagaaccggaggcaacaguug
aaugaaauguuaaaggauucaacacaauggcuggaagcuaaggaagaagcugagcaggucuuaggacaggccagagccaagcuugagucauggaaggagggucccuauacaguagaugcaauccaaaagaaaaucacagaaaccaag-3
’
(seq id no：11)用于外显子53的跳读；
[0129]
5
’-
caguuggccaaagaccuccgccaguggcagacaaauguagauguggcaaaugacuuggcccugaaacuucuccgggauuauucugcagaugauaccagaaaaguccacaugauaacagagaauaucaaugccucuuggagaagcauucauaaaag-3
’
(seq id no：12)用于外显子54的跳读；
[0130]
5
’-
ggugagugagcgagaggcugcuuuggaagaaacucauagauuacugcaacaguucccccuggaccuggaaaaguuucuugccuggcuuacagaagcugaaacaacugccaauguccuacaggaugcuacccguaaggaaaggcuccuagaagacuccaagggaguaaaagagcugaugaaacaauggcaa-3
’
(seq id no：13)用于外显子55的跳读；
[0131]
因此，优选的寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成并且更优选地包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基、并且结合至和/或反向互补于和/或靶向和/或杂交于/或能够结合和/或能够靶向和/或能够杂交于选自seq id no：2至seq id no：13的下列外显子核苷酸序列中的一个内的至少10个并且最高达33个核苷酸的连续的链。
[0132]
也如下限定优选的寡核苷酸：
[0133]-包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成和
[0134]-结合至和/或反向互补于和/或靶向和/或杂交于和/或能够结合和/或能够靶向和/或能够杂交于选自如上述确定的seq id no：2至seq id no：13的下列外显子核苷酸序列中的一个内的至少10个并且最高达33个核苷酸的连续的链。
[0135]
更优选地，这样的寡核苷酸包含如此处先前限定的5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基。
[0136]
更优选的寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成并且更优选地包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基，并且由包含seq id no：14-seq id no：90或由seq id no：14-seq id no：90组成的核苷酸或碱基序列表示，或由包含seq id no：14-seq id no：90的片段或由seq id no：14-seq id no：90的片段组成的核苷酸或碱基序列表示。在表1中确认seq id no：14-seq id no：90。在这个背景下，“5-甲基嘧啶”意味着至少一个5-甲基嘧啶。因此，“至少一个5-甲基嘧啶”意味着至少一个5-甲基胞嘧啶和/或至少一个5-甲基尿嘧啶。
[0137]
因此，优选地，优选的未修饰的寡核苷酸源自核苷酸或碱基序列seq id no：14-seq id no：90中的一个(其中x＝c、y＝u、z＝a)，和/或由seq id no：91、seq id no：93、seq id no：94-seq id no：170表示。这些未修饰的寡核苷酸的每一个不包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)并且不包含2，6-二氨基嘌呤。请注意，seq id no：91与seq id no：132相同。
[0138]
因此，优选的修饰的寡核苷酸源自核苷酸或碱基序列seq id no：14-seq id no：90中的一个并且包含至少一个5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或至少一个2，6-二氨基嘌呤(即，至少一个x是m
5
c＝x
1
和/或至少一个y是m
5
u＝y
1
和/或至少一个z是a
2
a＝z
1
)。请注意，seq id no：92与seq id no：199相同。由包含seq id no：92、seq id no：171-seq id no：213、seq id no：215、seq id no：217、seq id no：218、seq id no：219
no：14的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：14的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：14的片段表示。
[0151]
因此，由seq id no：94表示源自seq id no：14的未修饰的寡核苷酸并且由seq id no：143表示seq id no：94的优选的片段。
[0152]
因此，在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，并且其由包含seq id no：94的核苷酸或碱基序列表示并且具有19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：94的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：94的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：94的片段表示。
[0153]
优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。seq id no：14的优选的片段包含seq id no：63并且seq id no：94的优选的片段包含seq id no：143，并且每一个所述优选的片段具有13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0154]
因此，更优选地，所述寡核苷酸包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基。因此，甚至更优选地，如此处限定的，所述寡核苷酸的所有的它的胞嘧啶和/或所有的它的尿嘧啶和/或所有的它的腺嘌呤已经被取代或修饰。
[0155]
在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，并且更优选地，包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基，由包含seq id no：15的核苷酸或碱基序列表示并且具有20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：15的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：15的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：15的片段表示。
[0156]
因此，由seq id no：95表示源自seq id no：15的未修饰的寡核苷酸。
[0157]
因此，在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，由包含seq id no：95的核苷酸或碱基序列表示并且具有20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：95的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：95的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：95的片段表示。
[0158]
优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。seq id no：15的优选的片段包含seq id no：64并且seq id no：95的优选的片段包含seq id no：144，并且每一个所述片段具有15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。因此，更优选地，所述寡核苷酸包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基。因此，甚至更优选地，如此处限定的，所述寡核苷酸的所有的它的胞嘧啶和/或所有的它的尿嘧啶和/或所有的它的腺嘌呤已经被取代或修饰。
[0159]
也如下限定这样优选的寡核苷酸：
[0160]-包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成和
[0161]-通过包含seq id no：15或seq id no：95或seq id no：64或seq id no：144或由
seq id no：15或seq id no：95或seq id no：64或seq id no：144组成的核苷酸或碱基序列表示，并且具有20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：15或seq id no：95或seq id no：64或seq id no：144的片段或由seq id no：15或seq id no：95或seq id no：64或seq id no：144的片段组成的核苷酸或碱基序列表示，所述片段包含seq id no：15或seq id no：95或seq id no：64或seq id no：144的至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：15或seq id no：95或seq id no：64或seq id no：144的至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个连续的核苷酸或碱基组成。
[0162]
更优选地，这样的寡核苷酸包含如此处先前限定的5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基。
[0163]
更优选地，寡核苷酸：
[0164]-由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，
[0165]-由5-甲基胞嘧啶代替所有它的胞嘧啶，
[0166]-由包含seq id no：15的核苷酸或碱基序列表示这样的寡核苷酸并且具有20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：15的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：15的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：15的片段表示这样的寡核苷酸。优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0167]
更优选地，寡核苷酸：
[0168]-由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，
[0169]-由5-甲基尿嘧啶代替所有它的尿嘧啶，
[0170]-由包含seq id no：204的核苷酸或碱基序列表示这样的寡核苷酸并且具有20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：204的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：204的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：204的片段表示这样的寡核苷酸。优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0171]
更优选地，寡核苷酸：
[0172]-由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，
[0173]-由5-甲基胞嘧啶代替所有它的胞嘧啶，
[0174]-由包含seq id no：208的核苷酸或碱基序列表示这样的寡核苷酸并且具有20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：208的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：208的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：208的片段表示这样的寡核苷酸。优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0175]
更优选地，寡核苷酸：
[0176]-由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，
[0177]-由5-甲基尿嘧啶代替所有它的尿嘧啶，并且由5-甲基胞嘧啶代替所有它的胞嘧啶，
[0178]-由包含seq id no：205的核苷酸或碱基序列表示这样的寡核苷酸并且具有20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：205的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：205的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：205的片段表示这样的寡核苷酸。优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0179]
更优选地，寡核苷酸：
[0180]-由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，
[0181]-由2，6-二氨基嘌呤代替所有它的腺嘌呤，
[0182]-由包含seq id no：207的核苷酸或碱基序列表示这样的寡核苷酸并且具有20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：207的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：207的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：207的片段表示这样的寡核苷酸。优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0183]
在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成、并且更优选地包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基，由包含seq id no：16的核苷酸或碱基序列表示并且具有20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：16的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：16的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：16的片段表示。
[0184]
因此，由seq id no：96表示源自seq id no：16的未修饰的寡核苷酸。
[0185]
因此，在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，由包含seq id no：96的核苷酸或碱基序列表示并且具有20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：96的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：96的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：96的片段表示。
[0186]
优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0187]
因此，更优选地，所述寡核苷酸包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基。因此，甚至更优选地，如此处限定的，所述寡核苷酸的所有的它的胞嘧啶和/或所有的它的尿嘧啶和/或所有的它的腺嘌呤已经被代替或修饰。
[0188]
在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成、并且更优选地包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基，由包含seq id no：17的核苷酸或碱基序列表示并且具有23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：17的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：17的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：17的片段表示。
[0189]
因此，由seq id no：97表示源自seq id no：17的未修饰的寡核苷酸并且由seq id no：145表示seq id no：97的优选的片段。
[0190]
因此，在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，由包含seq id no：97的核苷酸或碱基序列表示并且具有23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：97的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：97的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：97的片段表示。
[0191]
优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。seq id no：17的优选的片段包括seq id no：65并seq id no：97的优选的片段括seq id no：145，每一个所述片段具有11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0192]
因此，更优选地，所述寡核苷酸包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基。因此，甚至更优选地，如此处限定的，所述寡核苷酸的所有的它的胞嘧啶和/或所有的它的尿嘧啶和/或所有的它的腺嘌呤已经被代替或修饰。
[0193]
在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成、并且更优选地包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基，由包含seq id no：18的核苷酸或碱基序列表示并且具有23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：18的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：18的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：18的片段表示。
[0194]
因此，由seq id no：98表示源自seq id no：18的未修饰的寡核苷酸并由seq id no：146表示seq id no：98的优选的片段。
[0195]
优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。seq id no：18的优选的片段包括seq id no：66并且seq id no：98的优选的片段包括seq id no：146，每一个所述片段具有14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0196]
因此，在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，由包含seq id no：98的核苷酸或碱基序列表示并且具有23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：98的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：98的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：98的片段表示。
[0197]
因此，更优选地，所述寡核苷酸包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基。因此，甚至更优选地，如此处限定的，所述寡核苷酸的所有的它的胞嘧啶和/或所有的它的尿嘧啶和/或所有的它的腺嘌呤已经被代替或修饰。
[0198]
在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成并且更优选地包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基，由包含seq id no：19的核苷酸或碱基序列表示并且具有21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：19的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：19的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：19的片段表示。
[0199]
因此，由seq id no：99表示源自seq id no：19的未修饰的寡核苷酸。
[0200]
因此，在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，由包含seq id no：99的核苷酸或碱基序列表示并且具有21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：99的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：99的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：99的片段表示。
[0201]
优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0202]
因此，更优选地，所述寡核苷酸包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基。因此，甚至更优选地，如此处限定的，所述寡核苷酸的所有的它的胞嘧啶和/或所有的它的尿嘧啶和/或所有的它的腺嘌呤已经被代替或修饰。
[0203]
在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成并更优选地、包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基，由包含seq id no：20的核苷酸或碱基序列表示并且具有23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：20的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：20的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：20的片段表示。
[0204]
因此，由seq id no：100表示源自seq id no：20的未修饰的寡核苷酸并由seq id no：147、seq id no：148或seq id no：149表示seq id no：100的优选的片段。
[0205]
因此，在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，包含seq id no：100的核苷酸或碱基序列表示并且具有23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：100的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：100的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：100的片段表示。
[0206]
优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。seq id no：20的优选的片段包括seq id no：67并且seq id no：100的优选的片段包括seq id no：147，每一个所述片段具有20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。seq id no：20的另一个优选的片段包括seq id no：68并且seq id no：100的另一个优选的片段包括seq id no：148，每一个所述片段具有13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。seq id no：20的另一个优选的片段包含seq id no：69并且seq id no：100的优选的片段包含seq id no：149，每一个所述片段具有12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0207]
因此，更优选地，所述寡核苷酸包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基。因此，甚至更优选地，如此处限定的，所述寡核苷酸的所有的它的胞嘧啶和/或所有的它的尿嘧啶和/或所有的它的腺嘌呤已经被代替或修饰。
[0208]
用于诱导来自肌养蛋白前体-mrna的外显子45的跳读的优选的核苷酸如下。
[0209]
在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成并且更优选地、包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基，由包含seq id no：21的核苷酸或碱基序列表示并且具有25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：21的至少10个连续
的核苷酸或碱基或由seq id no：21的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：21的片段表示。
[0210]
因此，由seq id no：101表示源自seq id no：21的未修饰的寡核苷酸并由seq id no：150、seq id no：151或seq id no：152表示seq id no：101的优选的片段。
[0211]
因此，在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，由包含seq id no：101的核苷酸或碱基序列表示并且具有25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：101的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：101的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：101的片段表示。
[0212]
优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。seq id no：21的优选的片段包含seq id no：70并且seq id no：101的优选的片段包含seq id no：150，每一个所述片段具有20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。seq id no：21的另一个优选的片段包含seq id no：71并且seq id no：101的另一个优选的片段包含seq id no：151，每一个所述片段具有20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。seq id no：21的另一个优选的片段包含seq id no：72并且seq id no：101的优选的片段包含seq id no：152，每一个所述片段具有20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0213]
因此，更优选地，所述寡核苷酸包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基。因此，甚至更优选地，如此处限定的，所述寡核苷酸的所有的它的胞嘧啶和/或所有的它的尿嘧啶和/或所有的它的腺嘌呤已经被代替或修饰。
[0214]
也如下限定这样优选的寡核苷酸：
[0215]-包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成和
[0216]-由包含seq id no：21或由seq id no：21组成的核苷酸或碱基序列表示并且具有25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：21的片段或由seq id no：21的片段组成的核苷酸或碱基序列表示，所述片段包含seq id no：21的至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：21的至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个连续的核苷酸或碱基组成。
[0217]
更优选地，这样的寡核苷酸包含如此处先前限定的5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基。
[0218]
更优选地，寡核苷酸：
[0219]-由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，
[0220]-由5-甲基胞嘧啶代替所有它的胞嘧啶，
[0221]-由包含seq id no：21的核苷酸或碱基序列表示这样的寡核苷酸并且具有25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：21的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：21的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：21的片段表示这样的寡核苷酸。
[0222]
因此，具体地，由包含seq id no：200的核苷酸或碱基序列表示这样的寡核苷酸并
且具有25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：200的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：200的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：200的片段表示这样的寡核苷酸。
[0223]
优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0224]
更优选地，寡核苷酸：
[0225]-由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，
[0226]-由5-甲基尿嘧啶代替所有它的尿嘧啶，并且由5-甲基胞嘧啶代替所有它的胞嘧啶，
[0227]-由包含seq id no：21或具体地seq id no：209的核苷酸或碱基序列表示这样的寡核苷酸并且具有20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：21或seq id no：209的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：21或seq id no：209的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：21或seq id no：209的片段表示这样的寡核苷酸。优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0228]
更优选地，寡核苷酸：
[0229]-由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，
[0230]-由2，6-二氨基嘌呤代替所有它的腺嘌呤，
[0231]-由包含seq id no：21或具体地seq id no：210的核苷酸或碱基序列表示这样的寡核苷酸并且具有20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：21或seq id no：210的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：21或seq id no：210的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：21或seq id no：210的片段表示这样的寡核苷酸。优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0232]
在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成并且更优选地、包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基，由包含seq id no：22的核苷酸或碱基序列表示并且具有24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：22的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：22的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：22的片段表示。
[0233]
因此，由seq id no：102表示源自seq id no：22的未修饰的寡核苷酸。
[0234]
因此，在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，由包含seq id no：102的核苷酸或碱基序列表示并且具有24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：102的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：102的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：102的片段表示。
[0235]
优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0236]
因此，更优选地，所述寡核苷酸包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿
嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基。因此，甚至更优选地，如此处限定的，所述寡核苷酸的所有的它的胞嘧啶和/或所有的它的尿嘧啶和/或所有的它的腺嘌呤已经被代替或修饰。
[0237]
在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成并且更优选地、包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基，由包含seq id no：23的核苷酸或碱基序列表示并且具有25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：23的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：23的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：23的片段表示。
[0238]
因此，由seq id no：103表示源自seq id no：23的未修饰的寡核苷酸。
[0239]
因此，在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，由包含seq id no：103的核苷酸或碱基序列表示并且具有25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：103的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：103的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：103的片段表示。
[0240]
优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0241]
因此，更优选地，所述寡核苷酸包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基。因此，甚至更优选地，如此处限定的，所述寡核苷酸的所有的它的胞嘧啶和/或所有的它的尿嘧啶和/或所有的它的腺嘌呤已经被代替或修饰。
[0242]
在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成并且更优选地、包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基，由包含seq id no：24的核苷酸或碱基序列表示并且具有23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：24的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：24的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：24的片段表示。
[0243]
因此，由seq id no：104表示源自seq id no：24的未修饰的寡核苷酸。
[0244]
因此，在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，由包含seq id no：104的核苷酸或碱基序列表示，并且具有23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：104的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：104的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：104的片段表示。
[0245]
优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0246]
因此，更优选地，所述寡核苷酸包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基。因此，甚至更优选地，如此处限定的，所述寡核苷酸的所有的它的胞嘧啶和/或所有的它的尿嘧啶和/或所有的它的腺嘌呤已经被代替或修饰。
[0247]
在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成并且更优选地、包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基，由包含seq id no：25的核苷酸或碱基序列表示并且具有
24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：25的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：25的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：25的片段表示。
[0248]
因此，由seq id no：105表示源自seq id no：25的未修饰的寡核苷酸。
[0249]
因此，在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，由包含seq id no：105的核苷酸或碱基序列表示并且具有24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：105的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：105的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：105的片段表示。
[0250]
优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0251]
因此，更优选地，所述寡核苷酸包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基。因此，甚至更优选地，如此处限定的，所述寡核苷酸的所有的它的胞嘧啶和/或所有的它的尿嘧啶和/或所有的它的腺嘌呤已经被代替或修饰。
[0252]
在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成并且更优选地、包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基，由包含seq id no：26的核苷酸或碱基序列表示并且具有22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：26的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：26的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：26的片段表示。
[0253]
因此，由seq id no：106表示源自seq id no：26的未修饰的寡核苷酸。
[0254]
因此，在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，由包含seq id no：106的核苷酸或碱基序列表示并且具有22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：106的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：106的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：106的片段表示。
[0255]
优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0256]
因此，更优选地，所述寡核苷酸包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基。因此，甚至更优选地，如此处限定的，所述寡核苷酸的所有的它的胞嘧啶和/或所有的它的尿嘧啶和/或所有的它的腺嘌呤已经被代替或修饰。
[0257]
在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成并且更优选地、包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基，由包含seq id no：27的核苷酸或碱基序列表示并且具有22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：27的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：27的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：27的片段表示。
[0258]
因此，由seq id no：107表示源自seq id no：27的未修饰的寡核苷酸。
[0259]
因此，在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，由包含seq id no：107的核苷酸或碱基序列表示并且具有22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：107的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：107的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：107的片段表示。
[0260]
优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0261]
因此，更优选地，所述寡核苷酸包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基。因此，甚至更优选地，如此处限定的，所述寡核苷酸的所有的它的胞嘧啶和/或所有的它的尿嘧啶和/或所有的它的腺嘌呤已经被代替或修饰。
[0262]
在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成并且更优选地、包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基，由包含seq id no：28的核苷酸或碱基序列表示并且具有25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：28的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：28的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：28的片段表示。
[0263]
因此，由seq id no：108表示源自seq id no：28的未修饰的寡核苷酸。在表1中确定的seq id no：28和seq id no：108的每一个包含在位置7上的次黄嘌呤碱基。
[0264]
因此，在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，由包含seq id no：108的核苷酸或碱基序列表示并且具有25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：108的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：108的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：108的片段表示。
[0265]
优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0266]
因此，更优选地，所述寡核苷酸包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基。因此，甚至更优选地，如此处限定的，所述寡核苷酸的所有的它的胞嘧啶和/或所有的它的尿嘧啶和/或所有的它的腺嘌呤已经被代替或修饰。
[0267]
在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成并且更优选地、包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基，由包含seq id no：29的核苷酸或碱基序列表示并且具有25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：29的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：29的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：29的片段表示。
[0268]
因此，由seq id no：109表示源自seq id no：29的未修饰的寡核苷酸。
[0269]
因此，在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，由包含seq id no：109的核苷酸或碱基序列表示并且具有25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含或由seq id no：109的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：109的片段表示。
[0270]
优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、
26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0271]
因此，更优选地，所述寡核苷酸包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基。因此，甚至更优选地，如此处限定的，所述寡核苷酸的所有的它的胞嘧啶和/或所有的它的尿嘧啶和/或所有的它的腺嘌呤已经被代替或修饰。
[0272]
在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成并且更优选地、包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基，由包含seq id no：30的核苷酸或碱基序列表示并且具有30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：30的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：30的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：30的片段表示。
[0273]
因此，由seq id no：110表示源自seq id no：30的未修饰的寡核苷酸。
[0274]
因此，在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，由包含seq id no：110的核苷酸或碱基序列表示并且具有30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：110的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：110的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：110的片段表示。
[0275]
优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0276]
因此，更优选地，所述寡核苷酸包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基。因此，甚至更优选地，如此处限定的，所述寡核苷酸的所有的它的胞嘧啶和/或所有的它的尿嘧啶和/或所有的它的腺嘌呤已经被代替或修饰。
[0277]
用于诱导来自肌养蛋白前体-mrna的外显子51的跳读的优选的寡核苷酸如下。
[0278]
在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成并且更优选地、包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基，由包含seq id no：31的核苷酸或碱基序列表示并且具有20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：31的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：31的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：31的片段表示。
[0279]
因此，由seq id no：111表示源自seq id no：31的未修饰的寡核苷酸并且由seq id no：153或seq id no：154表示seq id no：111的优选的片段。
[0280]
因此，在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，由包含seq id no：111的核苷酸或碱基序列表示并且具有20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：111的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：111的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：111的片段表示。
[0281]
优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。seq id no：31的优选的片段包含seq id no：73并且seq id no：111的优选的片段包含seq id no：153，并且每一个这样的片段具有13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。seq id no：31的另一个优选的片段包含seq id no：74并且seq id no：111的另一个优选的片段包含seq id no：154，并且每一个这样的片段具有12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、
22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0282]
因此，更优选地，所述寡核苷酸包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基。因此，甚至更优选地，如此处限定的，所述寡核苷酸的所有的它的胞嘧啶和/或所有的它的尿嘧啶和/或所有的它的腺嘌呤已经被代替或修饰。
[0283]
也如下限定这样优选的寡核苷酸：
[0284]-包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成和
[0285]-由包含或由seq id no：31组成的核苷酸或碱基序列表示b并且具有20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：31的片段或由seq id no：31的片段组成的核苷酸或碱基序列表示，所述片段包含seq id no：31的至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：31的至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个连续的核苷酸或碱基组成。
[0286]
更优选地，这样的寡核苷酸包含如此处先前限定的5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基。
[0287]
更优选地，寡核苷酸：
[0288]-由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，
[0289]-由5-甲基胞嘧啶代替所有它的胞嘧啶，
[0290]-由包含seq id no：31或seq id no：215的核苷酸或碱基序列表示这样的寡核苷酸并且具有20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：31或seq id no：215的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：31或seq id no：215的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：31或seq id no：215的片段表示这样的寡核苷酸表示。优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0291]
更优选地，寡核苷酸：
[0292]-由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，
[0293]-由5-甲基尿嘧啶代替所有它的尿嘧啶，
[0294]-由包含seq id no：202的核苷酸或碱基序列表示并且具有20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：202的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：202的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：202的片段表示这样的寡核苷酸。优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0295]
更优选地，寡核苷酸：
[0296]-由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，
[0297]-由5-甲基胞嘧啶代替所有它的胞嘧啶，并且由5-甲基尿嘧啶代替所有它的尿嘧啶，
[0298]-由包含seq id no：203的核苷酸或碱基序列表示并且具有20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：203的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：203的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：203的片段表示这样的寡核苷酸。优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、
20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0299]
更优选地，寡核苷酸：
[0300]-由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，
[0301]-由2，6-二氨基嘌呤代替所有它的腺嘌呤，
[0302]-由包含seq id no：206的核苷酸或碱基序列表示这样的寡核苷酸并且具有20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：206的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：206的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：206的片段表示这样的寡核苷酸。优选地，这样的片段具有10、11、
[0303]
12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0304]
在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成并且更优选地、包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基，由包含seq id no：32的核苷酸或碱基序列表示并且具有17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：32的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：32的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：32的片段表示。
[0305]
因此，由seq id no：112表示源自seq id no：32的未修饰的寡核苷酸。
[0306]
因此，在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，由包含seq id no：112的核苷酸或碱基序列表示并且具有17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：112的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：112的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：112的片段表示。
[0307]
优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0308]
因此，更优选地，所述寡核苷酸包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基。因此，甚至更优选地，如此处限定的，所述寡核苷酸的所有的它的胞嘧啶和/或所有的它的尿嘧啶和/或所有的它的腺嘌呤已经被代替或修饰。
[0309]
在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成并且更优选地、包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基，由包含seq id no：33的核苷酸或碱基序列表示并且具有22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：33的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：33的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：33的片段表示。
[0310]
因此，由seq id no：113表示源自seq id no：33的未修饰的寡核苷酸。
[0311]
因此，在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，由包含seq id no：113的核苷酸或碱基序列表示并且具有22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：113的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：113的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：113的片段表示。
[0312]
优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0313]
因此，更优选地，所述寡核苷酸包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基。因此，甚至更优选地，如此处限定的，所述寡核苷酸的所有的它的胞嘧啶和/或所有的它的尿嘧啶和/或所有的它的腺嘌呤已经被代替或修饰。
[0314]
在另一个实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，并且由包含seq id no：34的核苷酸或碱基序列表示并且具有25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：34的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：34的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：34的片段表示。
[0315]
因此，由seq id no：114表示源自seq id no：34的未修饰的寡核苷酸。
[0316]
因此，在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，由包含seq id no：114的核苷酸或碱基序列表示并且具有25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：114的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：114的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：114的片段表示。
[0317]
因此，更优选地，所述寡核苷酸包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基。因此，甚至更优选地，如此处限定的，所述寡核苷酸的所有的它的胞嘧啶和/或所有的它的尿嘧啶和/或所有的它的腺嘌呤已经被代替或修饰。
[0318]
优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。seq id no：34的优选的片段包含seq id no：93或由seq id no：93组成(ps1116：5
’-
caacaucaaggaagauggcauuucu-3
’
)。
[0319]
也如下限定这样优选的寡核苷酸：
[0320]-包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成和
[0321]-由包含seq id no：34或seq id no：93或seq id no：114或由seq id no：34或seq id no：93或seq id no：114组成的核苷酸或碱基序列表示并且具有25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：34或seq id no：93或seq id no：114的片段或由seq id no：34或seq id no：93或seq id no：114的片段组成的核苷酸序列表示，所述片段包含seq id no：34或seq id no：93或seq id no：114的至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：34或seq id no：93或seq id no：114的至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个连续的核苷酸或碱基组成。
[0322]
更优选地，这样的寡核苷酸包含如此处先前限定的5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基。
[0323]
更优选地，寡核苷酸：
[0324]-由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，
[0325]-由5-甲基胞嘧啶代替所有它的胞嘧啶，
[0326]-由包含seq id no：34的核苷酸或碱基序列表示这样的寡核苷酸并且具有25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：34的至少10个连续的核苷
酸或碱基或由seq id no：34的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：34的片段表示这样的寡核苷酸。优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0327]
更优选地，寡核苷酸：
[0328]-由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，
[0329]-由2，6-二氨基嘌呤代替所有它的腺嘌呤，
[0330]-由包含seq id no：34的核苷酸或碱基序列表示这样的寡核苷酸并且具有25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：34的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：34的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：34的片段表示这样的寡核苷酸。优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0331]
在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成并且更优选地、包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基，由包含seq id no：35的核苷酸或碱基序列表示并且具有23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：35的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：35的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：35的片段表示。
[0332]
因此，由seq id no：115表示源自seq id no：35的未修饰的寡核苷酸。
[0333]
因此，在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，由包含seq id no：115的核苷酸或碱基序列表示并且具有23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：115的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：115的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：115的片段表示。
[0334]
优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0335]
因此，更优选地，所述寡核苷酸包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基。因此，甚至更优选地，如此处限定的，所述寡核苷酸的所有的它的胞嘧啶和/或所有的它的尿嘧啶和/或所有的它的腺嘌呤已经被代替或修饰。
[0336]
在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成并且更优选地、包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基，由包含seq id no：36的核苷酸或碱基序列表示并且具有23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：36的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：36的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：36的片段表示。
[0337]
因此，由seq id no：116表示源自seq id no：36的未修饰的寡核苷酸并且由seq id no：155或seq id no：156或seq id no：157表示seq id no：116的优选的片段。
[0338]
因此，在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，由包含seq id no：116的核苷酸或碱基序列表示并且具有23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：116的至少10个
连续的核苷酸或碱基或由seq id no：116的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：116的片段表示。
[0339]
优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。seq id no：36的优选的片段包含seq id no：75或seq id no：116的优选的片段包含seq id no：155，并且每一个所述片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。seq id no：36的另一个优选的片段包含seq id no：76或seq id no：116的另一个优选的片段包含seq id no：156，并且每一个所述片段具有14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。seq id no：36的另一个优选的片段包含seq id no：77或seq id no：116的另一个优选的片段包含seq id no：157，并且每一个所述片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0340]
因此，更优选地，所述寡核苷酸包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基。因此，甚至更优选地，如此处限定的，所述寡核苷酸的所有的它的胞嘧啶和/或所有的它的尿嘧啶和/或所有的它的腺嘌呤已经被代替或修饰。
[0341]
在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成并且更优选地、包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基，由包含seq id no：37的核苷酸或碱基序列表示并且具有30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：37的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：37的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：37的片段表示。
[0342]
因此，由seq id no：117表示源自seq id no：37的未修饰的寡核苷酸。
[0343]
因此，在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，由包含seq id no：117的核苷酸或碱基序列表示并且具有30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：117的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：117的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：117的片段表示。
[0344]
优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0345]
因此，更优选地，所述寡核苷酸包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基。因此，甚至更优选地，如此处限定的，所述寡核苷酸的所有的它的胞嘧啶和/或所有的它的尿嘧啶和/或所有的它的腺嘌呤已经被代替或修饰。
[0346]
在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成并且更优选地、包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基，由包含seq id no：38的核苷酸或碱基序列表示并且具有25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：38的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：38的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：38的片段表示。
[0347]
因此，由seq id no：118表示源自seq id no：38的未修饰的寡核苷酸。
[0348]
因此，在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，由包含seq id no：118的核苷酸或碱基序列表示并且具有25、
id no：40的片段表示。优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0362]
因此，由seq id no：120表示源自seq id no：40的未修饰的寡核苷酸并且由seq id no：158或seq id no：159或seq id no：160表示seq id no：120的优选的片段。
[0363]
因此，在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，由包含seq id no：120的核苷酸或碱基序列表示并且具有22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：120的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：120的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：120的片段表示。
[0364]
seq id no：40的优选的片段包含seq id no：78并且seq id no：120的优选的片段包含seq id no：158，并且每一个片段具有15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。seq id no：40的另一个优选的片段包含seq id no：79并且seq id no：120的另一个优选的片段包含seq id no：159，并且每一个片段具有14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。seq id no：40的另一个优选的片段包含seq id no：80并且seq id no：120的另一个优选的片段包含seq id no：160，并且每一个片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0365]
因此，更优选地，所述寡核苷酸包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基。因此，甚至更优选地，如此处限定的，所述寡核苷酸的所有的它的胞嘧啶和/或所有的它的尿嘧啶和/或所有的它的腺嘌呤已经被代替或修饰。
[0366]
也如下限定这样优选的寡核苷酸：
[0367]-包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成和
[0368]-由包含seq id no：40或seq id no：120或由seq id no：40或seq id no：120组成的核苷酸或碱基序列表示并且具有22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：40或seq id no：120或由seq id no：40或seq id no：120的片段组成的核苷酸序列表示，所述片段包含或由seq id no：40或120的至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个连续的核苷酸或碱基组成。
[0369]
更优选地，这样的寡核苷酸包含如此处先前限定的5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基。
[0370]
更优选地，寡核苷酸：
[0371]-由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，
[0372]-由5-甲基胞嘧啶代替所有它的胞嘧啶，
[0373]-由包含seq id no：40的核苷酸或碱基序列表示这样的寡核苷酸并且具有22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：40的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：40的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：40的片段表示这样的寡核苷酸。因此，由包含seq id no：171的核苷酸或碱基序列表示并且具有22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：171的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：171的至少10个连续的核苷酸或碱基组成
的seq id no：171的片段表示这样的寡核苷酸。优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。也包含修饰如在seq id no：171中表示的seq id no：40的并非所有的4个胞嘧啶。包含修饰这些胞嘧啶中的1、2或3个。
[0374]
更优选地，寡核苷酸：
[0375]-由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，
[0376]-由5-甲基尿嘧啶代替所有它的尿嘧啶，
[0377]-由包含seq id no：172的核苷酸或碱基序列表示这样的寡核苷酸并且具有22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：172的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：172的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：172的片段表示这样的寡核苷酸。优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。也包含修饰如在seq id no：172中表示的seq id no：40的并非所有的7个尿嘧啶。包含修饰这些尿嘧啶中的1、2、3、4、5或6个。
[0378]
更优选地，寡核苷酸：
[0379]-由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，
[0380]-由2，6-二氨基嘌呤代替所有它的腺嘌呤，
[0381]-由包含seq id no：173的核苷酸或碱基序列表示这样的寡核苷酸并且具有22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：173的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：173的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：173的片段表示这样的寡核苷酸。优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。也包含修饰如在seq id no：173中表示的seq id no：40的并非所有的5个腺嘌呤。包含修饰这些腺嘌呤中的1、2、3或4个。
[0382]
更优选地，寡核苷酸：
[0383]-由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，
[0384]-由5-甲基胞嘧啶代替所有它的胞嘧啶和由5-甲基尿嘧啶代替所有它的尿嘧啶，
[0385]-由包含seq id no：174的核苷酸或碱基序列表示这样的寡核苷酸并且具有22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：174的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：174的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：174的片段表示这样的寡核苷酸。因此，由包含seq id no：174的核苷酸或碱基序列表示并且具有22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：174的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：174的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：174的片段表示所述寡核苷酸。优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。也包含修饰如在seq id no：174中表示的seq id no：40的并非所有的4个胞嘧啶和并非所有的7个尿嘧啶。包含修饰这些胞嘧啶中的1、2或3个和/或这些尿嘧啶中的1、2、3、4、5或6个。
[0386]
更优选地，寡核苷酸：
[0387]-由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，
[0388]-由5-甲基胞嘧啶代替所有它的胞嘧啶和由2，6-二氨基嘌呤代替所有它的腺嘌呤，
[0389]-由包含seq id no：175的核苷酸或碱基序列表示这样的寡核苷酸并且具有22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：175的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：175的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：175的片段表示这样的寡核苷酸。因此，由包含seq id no：175的核苷酸或碱基序列表示并且具有22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：175的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：175的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：175的片段表示所述寡核苷酸。优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。也包含修饰如在seq id no：175中表示的seq id no：40的并非所有的4个胞嘧啶和并非所有的5个腺嘌呤。包含修饰这些胞嘧啶中的1、2或3个和/或这些腺嘌呤中的1、2、3或4个。
[0390]
更优选地，寡核苷酸：
[0391]-由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，
[0392]-由2，6-二氨基嘌呤代替所有它的腺嘌呤和由5-甲基尿嘧啶代替所有它的尿嘧啶，
[0393]-由包含seq id no：176的核苷酸或碱基序列表示这样的寡核苷酸并且具有22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：176的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：176的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：176的片段表示这样的寡核苷酸。优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。也包含修饰如在seq id no：176中表示的seq id no：40的并非所有的5个腺嘌呤和并非所有的7个尿嘧啶。包含修饰这些腺嘌呤中的1、2、3或4个和/或这些尿嘧啶中的1、2、3、4、5或6个。
[0394]
更优选地，寡核苷酸：
[0395]-由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，
[0396]-由2，6-二氨基嘌呤代替所有它的腺嘌呤，由5-甲基胞嘧啶代替所有它的胞嘧啶和由5-甲基尿嘧啶代替所有它的尿嘧啶，
[0397]-由包含seq id no：177的核苷酸或碱基序列表示这样的寡核苷酸并且具有22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：177的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：177的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：177的片段表示这样的寡核苷酸。优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。也包含修饰如在seq id no：177中表示的seq id no：40的并非所有的4个胞嘧啶和并非所有的7个尿嘧啶以及并非所有的5个腺嘌呤。包含，修饰这些胞嘧啶中的1、2或3个和/或这些尿嘧啶中的1、2、3、4、5或6个和/或这些腺嘌呤中的1、2、3或4个。
[0398]
在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成并且更优选地、包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基，由包含seq id no：41并且具有25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度的核苷酸序列或碱基表示，或由包含seq id no：41的至少10个连续的
核苷酸或碱基或由seq id no：41的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：41的片段表示。
[0399]
因此，由seq id no：121表示源自seq id no：41的未修饰的寡核苷酸。
[0400]
因此，在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，由包含seq id no：121的核苷酸或碱基序列表示并且具有25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：121的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：121的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：121的片段表示。
[0401]
优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0402]
因此，更优选地，所述寡核苷酸包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基。因此，甚至更优选地，如此处限定的，所述寡核苷酸的所有的它的胞嘧啶和/或所有的它的尿嘧啶和/或所有的它的腺嘌呤已经被代替或修饰。
[0403]
在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成并且更优选地、包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基，由包含seq id no：42的核苷酸或碱基序列表示并且具有25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：42的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：42的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：42的片段表示。
[0404]
因此，由seq id no：122表示源自seq id no：42的未修饰的寡核苷酸。
[0405]
因此，在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，由包含seq id no：122的核苷酸或碱基序列表示并且具有25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：122的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：122的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：122的片段表示。
[0406]
优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0407]
因此，更优选地，所述寡核苷酸包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基。因此，甚至更优选地，如此处限定的，所述寡核苷酸的所有的它的胞嘧啶和/或所有的它的尿嘧啶和/或所有的它的腺嘌呤已经被代替或修饰。
[0408]
在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成并且更优选地、包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基，由包含seq id no：43的核苷酸或碱基序列表示并且具有25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：43的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：43的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：43的片段表示。
[0409]
优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0410]
也如下限定这样优选的寡核苷酸：
[0411]-包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成和
[0412]-由包含seq id no：43或seq id no：123或由seq id no：43或seq id no：123组成的并且具有25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度核苷酸或碱基序列表示，或由包含seq id no：43或seq id no：123的片段或由seq id no：43或seq id no：123的片段组成的核苷酸序列表示，所述片段包含seq id no：43或seq id no：123的至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：43或seq id no：123的至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个连续的核苷酸或碱基组成。因此，由seq id no：123表示源自seq id no：43的未修饰的寡核苷酸并且由seq id no：161表示seq id no：123的优选的片段。
[0413]
因此，在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，由包含seq id no：123的核苷酸或碱基序列表示并且具有22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：123的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：123的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：123的片段表示。
[0414]
因此，更优选地，所述寡核苷酸包含如此处先前限定的5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基。甚至更优选地，如此处限定的，所述寡核苷酸的所有的它的胞嘧啶和/或所有的它的尿嘧啶和/或所有的它的腺嘌呤已经被代替或修饰。
[0415]
更优选地，寡核苷酸：
[0416]-由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，
[0417]-由5-甲基胞嘧啶代替所有它的胞嘧啶，
[0418]-由包含seq id no：43的核苷酸或碱基序列表示这样的寡核苷酸并且具有25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：43的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：43的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：43的片段表示这样的寡核苷酸。优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。因此，由包含seq id no：178的核苷酸或碱基序列表示并且具有25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：178的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：178的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：178的片段表示所述寡核苷酸。也包含修饰如在seq id no：178中表示的seq id no：43的并非所有的6个胞嘧啶。包含修饰这些胞嘧啶中的1、2、3、4或5个。
[0419]
seq id no：43的优选的片段包含seq id no：81并且seq id no：123的优选的片段包含seq id no：161，每一个所述片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0420]
更优选地，寡核苷酸：
[0421]-由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，
[0422]-由5-甲基尿嘧啶代替所有它的尿嘧啶，
[0423]-由包含seq id no：179的核苷酸或碱基序列表示这样的寡核苷酸并且具有25、
26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：179的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：179的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：179的片段表示。优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。也包含修饰如在seq id no：179中表示的seq id no：43的并非所有的11个尿嘧啶。包含修饰这些胞嘧啶中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。
[0424]
更优选地，寡核苷酸：
[0425]-由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，
[0426]-由2，6-二氨基嘌呤代替所有它的腺嘌呤，
[0427]-由包含seq id no：180的核苷酸或碱基序列表示这样的寡核苷酸并且具有25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：180的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：180的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：180的片段表示这样的寡核苷酸。优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。也包含修饰如在seq id no：180中表示的seq id no：43的并非所有的2个腺嘌呤。包含修饰这些胞嘧啶中的1个。
[0428]
更优选地，寡核苷酸：
[0429]-由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，
[0430]-由5-甲基胞嘧啶代替所有它的胞嘧啶和由5-甲基尿嘧啶代替所有它的尿嘧啶，
[0431]-由包含seq id no：181的核苷酸或碱基序列表示这样的寡核苷酸并且具有25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：181的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：181的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：181的片段表示这样的寡核苷酸。因此，由包含seq id no：181的核苷酸或碱基序列表示并且具有25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：181的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：181的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：181的片段表示所述寡核苷酸。优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。也包含修饰如在seq id no：181中表示的seq id no：43的并非所有的6个胞嘧啶和并非所有的11个尿嘧啶。包含修饰这些胞嘧啶中的1、2、3、4或5个和/或这些尿嘧啶中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。
[0432]
更优选地，寡核苷酸：
[0433]-由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，
[0434]-由5-甲基胞嘧啶代替所有它的胞嘧啶和由2，6-二氨基嘌呤代替所有它的腺嘌呤，
[0435]-由包含seq id no：182的核苷酸或碱基序列表示这样的寡核苷酸并且具有25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：182的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：182的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：182的片段表示这样的寡核苷酸。因此，由包含seq id no：182的核苷酸或碱基序列表示并且具有25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：182的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：182的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：182的片段表示所述寡核苷酸。优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、
20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。也包含修饰如在seq id no：182中表示的seq id no：43的并非所有的6个胞嘧啶和并非所有的2个腺嘌呤。包含修饰这些胞嘧啶中的1、2、3、4或5个和/或这些腺嘌呤中的1个。
[0436]
更优选地，寡核苷酸：
[0437]-由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，
[0438]-由2，6-二氨基嘌呤代替所有它的腺嘌呤和由5-甲基尿嘧啶代替所有它的尿嘧啶，
[0439]-由包含seq id no：183的核苷酸或碱基序列表示这样的寡核苷酸并且具有25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：183的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：183的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：183的片段表示这样的寡核苷酸。优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。也包含修饰如在seq id no：183中表示的seq id no：43的并非所有的2个腺嘌呤和并非所有的11个尿嘧啶。包含修饰这些腺嘌呤中的1个和/或这些尿嘧啶中的1、2、3、4、5、7、8、9或10个。
[0440]
更优选地，寡核苷酸：
[0441]-由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，
[0442]-由2，6-二氨基嘌呤代替所有它的腺嘌呤，由5-甲基胞嘧啶代替所有它的胞嘧啶和由5-甲基尿嘧啶代替所有它的尿嘧啶，
[0443]-由包含seq id no：184的核苷酸或碱基序列表示这样的寡核苷酸并且具有25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：184的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：184的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：184的片段表示这样的寡核苷酸。优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。也包含修饰如在seq id no：184中表示的seq id no：43的并非所有的6个胞嘧啶和并非所有的11个尿嘧啶和并非所有的2个腺嘌呤。包含修饰这些胞嘧啶中的1、2、3、4或5个和/或这些尿嘧啶中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个和/或这些腺嘌呤中的1个。
[0444]
用于诱导来自肌养蛋白前体-mrna的外显子53的跳读的优选的寡核苷酸如下。
[0445]
在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成并且更优选地、包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基，由包含seq id no：44的核苷酸或碱基序列表示并且具有18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：44的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：44的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：44的片段表示。
[0446]
因此，由seq id no：124表示源自seq id no：44的未修饰的寡核苷酸。
[0447]
因此，在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，由包含seq id no：124的核苷酸或碱基序列表示并且具有18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：124的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：124的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：124的片段表示。
[0448]
优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0449]
因此，更优选地，所述寡核苷酸包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基。因此，甚至更优选地，如此处限定的，所述寡核苷酸的所有的它的胞嘧啶和/或所有的它的尿嘧啶和/或所有的它的腺嘌呤已经被代替或修饰。
[0450]
在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成并且更优选地、包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基，由包含seq id no：45的核苷酸或碱基序列表示并且具有22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：45的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：45的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：45的片段表示。
[0451]
因此，由seq id no：125表示源自seq id no：45的未修饰的寡核苷酸。
[0452]
因此，在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，由包含seq id no：125的核苷酸或碱基序列表示并且具有22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：125的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：125的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：125的片段表示。
[0453]
优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0454]
因此，更优选地，所述寡核苷酸包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基。因此，甚至更优选地，如此处限定的，所述寡核苷酸的所有的它的胞嘧啶和/或所有的它的尿嘧啶和/或所有的它的腺嘌呤已经被代替或修饰。
[0455]
在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成并且更优选地、包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基，由包含seq id no：46的核苷酸或碱基序列表示并且具有24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：46的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：46的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：46的片段表示。
[0456]
因此，由seq id no：126表示源自seq id no：46的未修饰的寡核苷酸。
[0457]
因此，在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，由包含seq id no：126的核苷酸或碱基序列表示并且具有24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：126的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：126的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：126的片段表示。
[0458]
优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0459]
因此，更优选地，所述寡核苷酸包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基。因此，甚至更优选地，如此处限定的，所述寡核苷酸的所有的它的胞嘧啶和/或所有的它的尿嘧啶和/或所有的它的腺嘌呤已经被代替或修饰。
no：49的片段表示。
[0471]
因此，由seq id no：129表示源自seq id no：49的未修饰的寡核苷酸。
[0472]
因此，在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，由包含seq id no：129的核苷酸或碱基序列表示并且具有23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：129的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：129的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：129的片段表示。
[0473]
优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0474]
因此，更优选地，所述寡核苷酸包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基。因此，甚至更优选地，如此处限定的，所述寡核苷酸具有的所有的它的胞嘧啶和/或所有的它的尿嘧啶和/或所有的它的腺嘌呤已经被代替或修饰。
[0475]
在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成并且更优选地、包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基，由包含seq id no：50的核苷酸或碱基序列表示并且具有24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：50的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：50的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：50的片段表示。
[0476]
因此，由seq id no：130表示源自seq id no：50的未修饰的寡核苷酸。
[0477]
因此，在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，由包含seq id no：130的核苷酸或碱基序列表示并且具有24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：130的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：130的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：130的片段表示。
[0478]
优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0479]
因此，更优选地，所述寡核苷酸包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基。因此，甚至更优选地，如此处限定的，所述寡核苷酸具有的所有的它的胞嘧啶和/或所有的它的尿嘧啶和/或所有的它的腺嘌呤已经被代替或修饰。
[0480]
在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成并且更优选地、包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基，由包含seq id no：51的核苷酸或碱基序列表示并且具有25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：51的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：51的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：51的片段表示。
[0481]
因此，由seq id no：131表示源自seq id no：51的未修饰的寡核苷酸。
[0482]
因此，在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，由包含seq id no：131的核苷酸或碱基序列表示并且具有25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：131的至少10个连续的
核苷酸或碱基或由seq id no：131的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：131的片段表示。
[0483]
优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0484]
因此，更优选地，所述寡核苷酸包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基。因此，甚至更优选地，如此处限定的，所述寡核苷酸具有的所有的它的胞嘧啶和/或所有的它的尿嘧啶和/或所有的它的腺嘌呤已经被代替或修饰。
[0485]
在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成并且更优选地、包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基，由包含seq id no：52的核苷酸或碱基序列表示并且具有25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：52的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：52的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：52的片段表示。
[0486]
因此，由seq id no：91表示源自seq id no：52的未修饰的寡核苷酸并且由seq id no：162、seq id no：163或seq id no：164表示seq id no：91的优选的片段。seq id no：91与seq id no：132相同。
[0487]
因此，在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，由包含seq id no：91的核苷酸或碱基序列表示并且具有25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：91的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：91的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：91的片段表示。
[0488]
优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0489]
因此，更优选地，所述寡核苷酸包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基。因此，甚至更优选地，如此处限定的，所述寡核苷酸具有的所有的它的胞嘧啶和/或所有的它的尿嘧啶和/或所有的它的腺嘌呤已经被代替或修饰。
[0490]
也如下限定这样优选的寡核苷酸：
[0491]-包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成和
[0492]-由包含seq id no：52或seq id no：91或由seq id no：52或seq id no：91组成的核苷酸或碱基序列表示并且具有25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：52或seq id no：91的片段或由seq id no：52或seq id no：91的片段组成的核苷酸序列表示，所述片段包含seq id no：52或seq id no：91的至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：52或seq id no：91的至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个连续的核苷酸或碱基组成。
[0493]
更优选地，这样的寡核苷酸包含如此处先前限定的5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基。
[0494]
更优选地，寡核苷酸：
[0495]-由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，
[0496]-由5-甲基胞嘧啶代替所有它的胞嘧啶，
[0497]-由包含seq id no：52的核苷酸或碱基序列表示这样的寡核苷酸并且具有25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：52的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：52的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：52的片段表示。优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0498]
seq id no：52的优选的片段包含seq id no：82并且seq id no：91的优选的片段包含seq id no：162，每一个所述这样的片段具有20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。seq id no：52的另一个优选的片段包含seq id no：83并且seq id no：91的另一个优选的片段包含seq id no：163，每一个所述这样的片段具有20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。seq id no：52的另一个优选的片段包含seq id no：84并且seq id no：91的另一个优选的片段包含seq id no：164，每一个所述这样的片段具有17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。seq id no：52的最优选的片段包含seq id no：91或由seq id no：91组成(ps229l：5
’-
guugccuccgguucugaagguguuc-3
’
)。seq id no：52的另一个最优选的片段包含seq id no：92或由seq id no：92组成(ps524：5
’-
guugxxuxxgguuxugaagguguux-3
’
；其中x是5-甲基嘧啶)。
[0499]
也如下限定这样优选的寡核苷酸：
[0500]-包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成和
[0501]-由包含seq id no：82、seq id no：83、seq id no：84、seq id no：91或seq id no：92或seq id no：162或seq id no：163或seq id no：164或由seq id no：82、seq id no：83、seq id no：84、seq id no：91或seq id no：92或seq id no：162或seq id no：163或seq id no：164组成的核苷酸或碱基序列表示并且具有17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：82、seq id no：83、seq id no：84、seq id no：91或seq id no：92或seq id no：162或seq id no：163或seq id no：164的片段或由seq id no：82、seq id no：83、seq id no：84、seq id no：91或seq id no：92或seq id no：162或seq id no：163或seq id no：164的片段组成的核苷酸或碱基序列表示，所述片段包含seq id no：82、seq id no：83、seq id no：84、seq id no：91或seq id no：92或seq id no：162或seq id no：163或seq id no：164的至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：82、seq id no：83、seq id no：84、seq id no：91或seq id no：92或seq id no：162或seq id no：163或seq id no：164的至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个连续的核苷酸或碱基组成。
[0502]
更优选地，这样的寡核苷酸包含如此处先前限定的5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基。
[0503]
更优选地，寡核苷酸：
[0504]-由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，
[0505]-由5-甲基胞嘧啶代替所有它的胞嘧啶，
[0506]-由包含seq id no：82、seq id no：83、seq id no：84或seq id no：92的核苷酸或
碱基序列表示这样的寡核苷酸并且具有17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：82、seq id no：83、seq id no：84或seq id no：92的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：82、seq id no：83、seq id no：84或seq id no：92的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：82、seq id no：83、seq id no：84或seq id no：92的片段表示。优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。seq id no：92与seq id no：199相同。也包含修饰如在seq id no：92中表示的seq id no：52并非所有的6个胞嘧啶。包含修饰这些胞嘧啶中的1、2、3、4或5个。
[0507]
更优选地，寡核苷酸：
[0508]-由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，
[0509]-由5-甲基胞嘧啶代替它的胞嘧啶中的两个，
[0510]-由包含seq id no：218的核苷酸或碱基序列表示这样的寡核苷酸并且具有17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：218的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：218的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：218的片段表示。优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0511]
更优选地，寡核苷酸：
[0512]-由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，
[0513]-由5-甲基胞嘧啶代替它的胞嘧啶中的三个，
[0514]-由包含seq id no：219的核苷酸或碱基序列表示这样的寡核苷酸并且具有17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：219的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：219的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：219的片段表示。优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0515]
更优选地，寡核苷酸：
[0516]-由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，
[0517]-由5-甲基胞嘧啶代替它的胞嘧啶中的四个，
[0518]-由包含seq id no：217的核苷酸或碱基序列表示这样的寡核苷酸并且具有17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：217的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：217的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：217的片段表示。优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0519]
更优选地，寡核苷酸：
[0520]-由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，
[0521]-由5-甲基尿嘧啶代替所有它的尿嘧啶，
[0522]-由包含seq id no：211的核苷酸或碱基序列表示这样的寡核苷酸并且具有25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：211的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：211的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：211的片段表示。因此，由包含seq id no：211的核苷酸或碱基序列表示这样的寡核苷酸并且具
有25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：211的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：211的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：211的片段表示。优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。也包含修饰如在seq id no：211中表示的seq id no：52并非所有的9个尿嘧啶。包含修饰这些尿嘧啶中的1、2、3、4、5、6、7或8个。
[0523]
更优选地，寡核苷酸：
[0524]-由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，
[0525]-由5-甲基胞嘧啶代替所有它的胞嘧啶和由5-甲基尿嘧啶代替所有它的尿嘧啶，
[0526]-由包含seq id no：212的核苷酸或碱基序列表示这样的寡核苷酸并且具有22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：212的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：212的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：212的片段表示。因此，由包含seq id no：212的核苷酸或碱基序列表示所述寡核苷酸并且具有22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：212的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：212的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：212的片段表示。优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。也包含修饰如在seq id no：212中表示的seq id no：52的并非所有的6个胞嘧啶和并非所有的9个尿嘧啶。包含修饰这些胞嘧啶中的1、2、3、4或5个和/或这些尿嘧啶中的1、2、3、4、5、6、7或8个。
[0527]
更优选地，寡核苷酸：
[0528]-由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，
[0529]-由2，6-二氨基嘌呤代替所有它的腺嘌呤，
[0530]-由包含seq id no：213的核苷酸或碱基序列表示这样的寡核苷酸并且具有25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：213的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：213的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：213的片段表示。优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。也包含修饰如在seq id no：213中表示的seq id no：52并非所有的2个腺嘌呤。包含修饰这些腺嘌呤中的1个。
[0531]
在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成并且更优选地、包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基，由包含seq id no：53的核苷酸或碱基序列表示并且具有25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：53的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：53的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：53的片段表示。
[0532]
因此，由seq id no：133表示源自seq id no：53的未修饰的寡核苷酸。
[0533]
因此，在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，由包含seq id no：133的核苷酸或碱基序列表示并且具有25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：133的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：133的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：133的片段表示。
[0534]
优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0535]
因此，更优选地，所述寡核苷酸包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基。因此，甚至更优选地，如此处限定的，所述寡核苷酸具有的所有的它的胞嘧啶和/或所有的它的尿嘧啶和/或所有的它的腺嘌呤已经被代替或修饰。
[0536]
在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成并且更优选地、包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基，由包含seq id no：54的核苷酸或碱基序列表示并且具有30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含或由seq id no：54的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：54的片段表示。
[0537]
因此，由seq id no：134表示源自seq id no：54的未修饰的寡核苷酸。
[0538]
因此，在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，由包含seq id no：134的核苷酸或碱基序列表示并且具有30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：134的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：134的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：134的片段表示。
[0539]
优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0540]
因此，更优选地，所述寡核苷酸包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基。因此，甚至更优选地，如此处限定的，所述寡核苷酸具有的所有的它的胞嘧啶和/或所有的它的尿嘧啶和/或所有的它的腺嘌呤已经被代替或修饰。
[0541]
在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成并且更优选地、包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基，由包含seq id no：55的核苷酸或碱基序列表示并且具有30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：55的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：55的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：55的片段表示。
[0542]
因此，由seq id no：135表示源自seq id no：55的未修饰的寡核苷酸。
[0543]
因此，在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，由包含seq id no：135的核苷酸或碱基序列表示并且具有30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：135的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：135的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：135的片段表示。
[0544]
优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0545]
因此，更优选地，所述寡核苷酸包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基。因此，甚至更优选地，如此处限定的，所述寡核苷酸具有已经被代替或修饰的所有的它的胞嘧啶和/或所有的它的尿嘧啶和/或所有的它的腺嘌呤。
[0546]
在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成并且更优选地、包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基，由包含seq id no：56的核苷酸或碱基序列表示并且具有33、34或35个核苷酸的长度，或由包含seq id no：56的至少10个连续的核苷酸或碱基或由
seq id no：56的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：56的片段表示。
[0547]
因此，由seq id no：136表示源自seq id no：56的未修饰的寡核苷酸。
[0548]
因此，在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，由包含seq id no：136的核苷酸或碱基序列表示并且具有33、34或35个核苷酸的长度，或由包含seq id no：136的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：136的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：136的片段表示。
[0549]
优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0550]
因此，更优选地，所述寡核苷酸包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基。因此，甚至更优选地，如此处限定的，所述寡核苷酸具有的所有的它的胞嘧啶和/或所有的它的尿嘧啶和/或所有的它的腺嘌呤已经被代替或修饰。
[0551]
用于诱导来自肌养蛋白前体-mrna的外显子55的跳读的优选的寡核苷酸如下。
[0552]
在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成并且更优选地、包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基，由包含seq id no：57的核苷酸或碱基序列表示并且具有24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：57的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：57的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：57的片段表示。优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0553]
也如下限定这样优选的寡核苷酸：
[0554]-包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成和
[0555]-由包含seq id no：57或由seq id no：57组成的核苷酸或碱基序列表示，并且具有24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：57的片段或由seq id no：57的片段组成的核苷酸或碱基序列表示，所述片段包含或由seq id no：57的至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个连续的核苷酸或碱基组成。
[0556]
因此，由seq id no：137表示源自seq id no：57的未修饰的寡核苷酸，和由seq id no：165或166表示seq id no：137的优选的片段。
[0557]
因此，在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，并且由包含seq id no：137的核苷酸或碱基序列表示并且具有24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：137的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：137的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：137的片段表示。
[0558]
更优选地，这样的寡核苷酸包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基。甚至更优选地，如此处限定的，所述寡核苷酸具有的所有的它的胞嘧啶和/或所有的它的尿嘧啶和/或所有的它的腺嘌呤已经被代替或修饰。
[0559]
更优选地，寡核苷酸：
[0560]-由2
’-
o-甲基硫代磷酸rna组成，
[0561]-由5-甲基胞嘧啶代替所有它的胞嘧啶，
[0562]-由包含seq id no：57的核苷酸或碱基序列表示这样的寡核苷酸并且具有24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：57的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：57的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：57的片段表示。
[0563]
因此，由包含seq id no：185的核苷酸或碱基序列表示所述寡核苷酸并且具有24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：185的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：185的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：185的片段表示所述寡核苷酸。也包含修饰如在seq id no：185中表示的seq id no：57的并非所有的8个胞嘧啶。包含修饰这些胞嘧啶中的1、2、3、4、5、6或7个。
[0564]
优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0565]
seq id no：57的优选的片段包含seq id no：85并且seq id no：137的优选的片段包含seq id no：165，每一个所述片段具有16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。seq id no：57的另一个优选的片段包含seq id no：86并且seq id no：137的另一个优选的片段包含seq id no：166，每一个所述片段具有11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0566]
更优选地，寡核苷酸：
[0567]-由2
’-
o-甲基硫代磷酸rna组成，
[0568]-由5-甲基尿嘧啶代替所有它的尿嘧啶，
[0569]-由包含seq id no：186的核苷酸或碱基序列表示这样的寡核苷酸并且具有24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：186的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：186的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：186的片段表示。优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。也包含修饰如在seq id no：186中表示的seq id no：57的并非所有的7个尿嘧啶。包含修饰这些胞嘧啶中的1、2、3、4、5或6个。
[0570]
更优选地，寡核苷酸：
[0571]-由2
’-
o-甲基硫代磷酸rna组成，
[0572]-由2，6-二氨基嘌呤代替所有它的腺嘌呤，
[0573]-由包含seq id no：187的核苷酸或碱基序列表示这样的寡核苷酸并且具有24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：187的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：187的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：187的片段表示。优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。也包含修饰如在seq id no：187中表示的seq id no：57的并非所有的5个腺嘌呤。包含修饰这些胞嘧啶中的1、2、3或4个。
[0574]
更优选地，寡核苷酸：
[0575]-由2
’-
o-甲基硫代磷酸rna组成，
[0576]-由5-甲基胞嘧啶代替所有它的胞嘧啶，和由5-甲基尿嘧啶代替所有它的尿嘧啶，
[0577]-由包含seq id no：188的核苷酸或碱基序列表示这样的寡核苷酸并且具有24、
25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：188的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：188的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：188的片段表示。因此，由包含seq id no：188的核苷酸或碱基序列表示并且具有24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：188的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：188的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：188的片段表示所述寡核苷酸。优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。也包含修饰如在seq id no：188中表示的seq id no：57的并非所有的8个胞嘧啶和并非所有的7个尿嘧啶。包含修饰这些胞嘧啶中的1、2、3、4、5、6或7个和/或这些尿嘧啶中的1、2、3、4、5或6个。
[0578]
更优选地，寡核苷酸：
[0579]-由2
’-
o-甲基硫代磷酸rna组成，
[0580]-由5-甲基胞嘧啶代替所有它的胞嘧啶，和由2，6-二氨基嘌呤代替所有它的腺嘌呤，
[0581]-由包含seq id no：189的核苷酸或碱基序列表示这样的寡核苷酸并且具有24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：189的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：189的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：189的片段表示。因此，由包含seq id no：189的核苷酸或碱基序列表示并且具有24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：189的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：189的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：189的片段表示所述寡核苷酸。优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。也包含修饰如在seq id no：189中表示的seq id no：57的并非所有的8个胞嘧啶和并非所有的5个腺嘌呤。包含修饰这些胞嘧啶中的1、2、3、4、5、6或7个和/或这些腺嘌呤中的1、2、3或4个。
[0582]
更优选地，寡核苷酸：
[0583]-由2
’-
o-甲基硫代磷酸rna组成，
[0584]-由2，6-二氨基嘌呤代替所有它的腺嘌呤，和由5-甲基尿嘧啶代替所有它的尿嘧啶，
[0585]-由包含seq id no：190的核苷酸或碱基序列表示这样的寡核苷酸并且具有24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：190的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：190的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：190的片段表示。优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。也包含修饰如在seq id no：190中表示的seq id no：57的并非所有的5个腺嘌呤和并非所有的7个尿嘧啶。包含修饰这些腺嘌呤中的1、2、3或4个和/或这些尿嘧啶中的1、2、3、4、5或6个。
[0586]
更优选地，寡核苷酸：
[0587]-由2
’-
o-甲基硫代磷酸rna组成，
[0588]-由2，6-二氨基嘌呤代替所有它的腺嘌呤，由5-甲基胞嘧啶代替所有它的胞嘧啶，和由5-甲基尿嘧啶代替所有它的尿嘧啶，
[0589]-由包含seq id no：191的核苷酸或碱基序列表示这样的寡核苷酸并且具有24、
25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：191的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：191的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：191的片段表示。优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。也包含修饰如在seq id no：191中表示的seq id no：57的并非所有的8个胞嘧啶和并非所有的7个尿嘧啶和并非所有的5个腺嘌呤。包含修饰这些胞嘧啶中的1、2、3、4、5、6或7个和/或这些尿嘧啶中的1、2、3、4、5或6个和/或这些腺嘌呤中的1、2、3或4个。
[0590]
在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成并且更优选地、包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基，由包含seq id no：58的核苷酸或碱基序列表示并且具有25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：58的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：58的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：58的片段表示。
[0591]
因此，由seq id no：138表示源自seq id no：58的未修饰的寡核苷酸。
[0592]
因此，在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，由包含seq id no：138的核苷酸或碱基序列表示并且具有25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：138的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：138的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：138的片段表示。
[0593]
优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0594]
因此，更优选地，所述寡核苷酸包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基。因此，甚至更优选地，如此处限定的，所述寡核苷酸具有的所有的它的胞嘧啶和/或所有的它的尿嘧啶和/或所有的它的腺嘌呤已经被代替或修饰。
[0595]
也如下限定这样优选的寡核苷酸：
[0596]-包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成和
[0597]-由包含或由seq id no：58或seq id no：138组成的核苷酸或碱基序列表示，并且具有25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度或由包含seq id no：58或seq id no：138的片段或由seq id no：58或seq id no：138的片段组成的核苷酸或碱基序列表示，所述片段包含seq id no：58或seq id no：138的至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：58或seq id no：138的至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个连续的核苷酸或碱基组成。
[0598]
更优选地，这样的寡核苷酸包含如此处先前限定的5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基。
[0599]
更优选地，寡核苷酸：
[0600]-由2
’-
o-甲基硫代磷酸rna组成，
[0601]-由5-甲基胞嘧啶代替所有它的胞嘧啶，
[0602]-由包含seq id no：58的核苷酸或碱基序列表示这样的寡核苷酸并且具有25、26、
no：198的片段表示。优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。也包含修饰如在seq id no：198中表示的seq id no：59的并非所有的5个胞嘧啶和并非所有的6个尿嘧啶和并非所有的6个腺嘌呤。包含修饰这些胞嘧啶中的1、2、3或4个和/或这些尿嘧啶中的1、2、3、4或5个和/或这些腺嘌呤中的1、2、3、4或5个。
[0641]
在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成并且更优选地、包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基，由包含seq id no：60的核苷酸或碱基序列表示并且具有24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：60的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：60的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：60的片段表示。
[0642]
因此，由seq id no：140表示源自seq id no：60的未修饰的寡核苷酸。
[0643]
因此，在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，由包含seq id no：140的核苷酸或碱基序列表示并且具有24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：140的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：140的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：140的片段表示。
[0644]
优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0645]
因此，更优选地，所述寡核苷酸包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基。因此，甚至更优选地，如此处限定的，所述寡核苷酸具有的所有的它的胞嘧啶和/或所有的它的尿嘧啶和/或所有的它的腺嘌呤已经被代替或修饰。
[0646]
在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成并且更优选地、包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基，由包含seq id no：61的核苷酸或碱基序列表示并且具有24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：61的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：61的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：61的片段表示。
[0647]
因此，由seq id no：141表示源自seq id no：61的未修饰的寡核苷酸。
[0648]
因此，在优选的实施方式中，寡核苷酸包含2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna单体或由2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna组成，由包含seq id no：141的核苷酸或碱基序列表示并且具有24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度，或由包含seq id no：141的至少10个连续的核苷酸或碱基或由seq id no：141的至少10个连续的核苷酸或碱基组成的seq id no：141的片段表示。
[0649]
优选地，这样的片段具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。
[0650]
因此，更优选地，所述寡核苷酸包含5-甲基嘧啶(即，5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)和/或2，6-二氨基嘌呤碱基。因此，甚至更优选地，如此处限定的，所述寡核苷酸具有的所有的它的胞嘧啶和/或所有的它的尿嘧啶和/或所有的它的腺嘌呤已经被代替或修饰。
2012021985(replicor)，其全部内容由引用结合于此)已经描述了在包含寡核苷酸的组合物中出现的钙盐关于所述寡核苷酸的免疫刺激作用的正面影响。
[0662]
药物组合物可包含辅药(aid)以增强所述化合物的稳定性、溶解性、吸收、生物利用度、活性、药物代谢动力学、药效学和细胞摄取，特别是能够形成复合物、纳米粒子、微粒、纳米管、纳米凝胶、水凝胶、泊洛沙姆或普朗尼克类、聚合物泡囊、胶体、微泡、囊泡、胶团、脂质复合体(lipoplex)和/或脂质体(liposome)的赋形剂。纳米粒子的实例包括聚合的纳米粒子、金纳米粒子、磁性纳米粒子、二氧化硅纳米粒子、脂质纳米粒子、糖微粒、蛋白质纳米粒子和肽纳米粒子。
[0663]
优选的组合物包含至少一种赋形剂，其可进一步辅助增强所述组合物和/或所述寡核苷酸与组织和/或细胞和/或进入组织和/或细胞内的靶向和/或递送。优选的组织或细胞是肌肉组织或细胞。
[0664]
本领域已知很多这些赋形剂(例如，参考，bruno，2011)并且可被归类为第一类型赋形剂。第一类型赋形剂的实例包含聚合物(例如，聚乙烯亚胺(pei)、聚-2-羟丙烯亚胺(php)、聚丙烯亚胺(ppi)、葡萄聚糖衍生物、氰基丙烯酸正丁酯(pbca)、氰基丙烯酸正己基酯(phca)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(plga)、聚胺类(例如，精胺、亚精胺、腐胺、尸胺)、壳聚糖、聚(氨基胺类)(pamam)、聚(酯胺)、聚乙烯醚、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、聚乙二醇(peg)、环糊精、透明质酸、多聚乙酰神经氨酸(colominic acid)，和它们的衍生物)、树枝状大分子(例如，聚(酰胺-胺))、脂类{例如，1，2-二油酰基-3-二甲基铵丙烷(dodap)、二油酰基二甲基氯化铵(dodac)、卵磷脂衍生物[例如，1，2-二硬脂酰基-sn-甘油酸-3-磷酸胆碱(dspc)]溶血-卵磷脂衍生物(lyso-phosphatidylcholine derivaties)[例如，1-硬脂酰基-2-溶血-sn-甘油酸-3-磷酸胆碱(s-lysopc)]、鞘磷脂、2-{3-[二-(3-氨基-丙基)-氨基]-丙基氨基}-n-二四乙酰基氨基甲酰基甲基乙酰胺(rpr209120)、磷酸甘油衍生物[例如，1，2-二棕榈酰基-sn-甘油酸-3-磷酸甘油，钠盐(dppg-na)、磷脂酸(phosphatidic acid)衍生物[例如，1，2-二硬脂酰基-sn-甘油酸-3-磷脂酸，钠盐((dspa))、磷脂酰乙醇胺衍生物[例如，二油酰基-l-r-磷脂酰乙醇胺(dope)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油酸-3-磷酸乙醇胺(dspe)、2-二植烷酰基-sn-甘油酸-3-磷酸乙醇胺(2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine，dphype)]、n-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-n，n，n-三甲胺(dotap)、n-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-n，n，n-三甲胺(dotma)、1，3-二-油酰氧基-2-(6-羧基-精胺基)-丙酰胺(dosper)、(1，2-二肉豆蔻酰氧丙基)-3-二甲基羟基乙基铵(dmrie)、(n1-胆甾醇基氧基羰基)-3，7-二氮杂壬烷-1，9-二胺(cdan)、二甲基双十八烷基溴化铵(ddab)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(popc)、(b-l-精氨酰基-2，3-l-二氨基丙酸-n-棕榈基-n-油烯基-酰胺三盐酸化物(atufect01))、1，n，n-二甲基-3-氨基丙烷衍生物[例如，1，2-二硬脂酰氧基]-n，n-二甲基-3-氨基丙烷(dsdma)、1，2-二油烯基氧基-n，n-二甲基-3-氨基丙烷(dodma)、1，2-二亚油烯基氧基-n，n-3-二甲基氨基丙烷(1，2-dilinoleyloxy-n，n-3-dimethylaminopropane，dlindma)、2，2-二亚油烯基-4-二甲基氨基甲基[1，3]-二氧戊环(dlin-k-dma)、磷脂酰丝氨酸衍生物[1，2-二油烯基-sn-甘油酸-3-磷酸-l-丝氨酸，钠盐(dops)、胆固醇}蛋白质(例如，白蛋白、明胶、脱端胶原蛋白(atelocollagen))和肽(例如，鱼精蛋白、pepfects、nickfects、聚精氨酸、聚赖氨酸、cady、mpg)。
[0665]
另一个优选的组合物可包含被归类为第二类赋形剂的至少一种赋形剂。第二类型
赋形剂可包含或可含有本文所描述的缀合基团以增强本发明的组合物和/或寡核苷酸与组织和/或细胞和/或进入组织和/或细胞内的靶向和/或递送，例如，肌肉组织或细胞。可将两种类型的赋形剂组合到此处确定的一个单一的组合物内。
[0666]
技术人员可选择、组合和/或修改一种或更多上述或其他可替换的赋形剂和递送系统以配制和递送用于本发明的化合物。
[0667]
可以以指定时间将有效的浓度的本发明的这样的药物组合物给予动物，优选地哺乳动物。更优选的哺乳动物是人类。根据本发明使用的此处限定的寡核苷酸或组合物可适于直接给予受此处确定的疾病或病况影响或具有发展所述疾病或病况的风险的个体的体内细胞、组织和/或器官，并且可直接地体内、离体或体外给予。给予可以是经由局部、全身和/或非肠道途径，例如，静脉内、皮下、腹膜内、鞘内、肌肉、眼部、鼻部、泌尿生殖道、皮肤内、真皮、肠内、玻璃体内、海绵囊内、大脑内、鞘内、硬膜外或口服途径。
[0668]
优选地，可以以用于口服递送的乳剂、悬浮剂、丸剂、片剂、胶囊剂或软凝胶剂的形式，或以用于递送到呼吸道和肺的气雾剂或干粉剂的形式胶囊化本发明的这样的药物组合物。
[0669]
在实施方式中，可以与已知用于所述疾病的治疗的另外的化合物一起使用本发明的化合物。这样的其他化合物可用于减少炎症，优选地用于减少肌肉组织炎症，和/或用于改善肌纤维功能、完整性和/或生存和/或改善、增加或修复心脏功能性附属(adjunct)化合物。实例是，但不限于，类固醇，优选地，(糖)皮质类固醇、ace抑制剂(优选地，培多普利)、血管紧张素ii型1受体阻滞剂(优选地，氯沙坦)、肿瘤坏死因子-α(tnfα)抑制剂、tgfβ抑制剂(优选核心蛋白聚糖)、人类重组二聚糖、migf-1的来源、肌生成抑制蛋白抑制剂、甘露糖-6-磷酸盐、抗氧化剂、离子通道抑制剂、蛋白酶抑制剂、磷酸二酯酶抑制剂(优选地，pde5抑制剂，如西地那非或他达拉非)、组蛋白脱乙酰酶抑制剂(hdac抑制剂、雄激素受体调节剂、肌氨酸、磷酸肌氨酸和/或l-精氨酸)。这样的组合应用可以是顺序应用：在不同的组合物中给予每一种成分。可替代地，可在单一组合物中同时应用每一种化合物。
[0670]
应用
[0671]
在进一步的方面中，提供了在先前章节中描述的组合物或寡核苷酸用作药物或治疗部分，或应用于其中所述寡核苷酸在细胞内发挥它的活性的应用。
[0672]
优选地，本发明的寡核苷酸或组合物用作用于预防、延迟、治愈、减轻和/或治疗dmd或bmd的药物或治疗部分。
[0673]
方法
[0674]
在进一步的方面中，提供了用于预防、治疗、治愈、减轻和/或延迟个体、所述个体的细胞、组织或器官的如在先前章节中限定的病况或疾病的方法。方法包括给予所述个体或需要其的受试者本发明的寡核苷酸或组合物。
[0675]
根据本发明的方法，其中此处限定的寡核苷酸或组合物可以适于给予受此处限定的疾病的任何一种影响的个体的体内细胞、组织和/或器官，并且可以体内、离体或体外给予。优选地，需要其的个体或受试者是哺乳动物，更优选地是人类。
[0676]
在进一步在方面中，提供了用于诊断的方法，其中本发明的寡核苷酸具有(provided with)放射性标记或荧光标记。
[0677]
在实施方式中，在本发明的方法中，寡核苷酸或组合物的浓度的范围为从0.01nm
至1m。更优选地，使用的浓度是从0.05至500nm，或从0.1至500nm，或从0.02至500nm，或从0.05至500nm，甚至更优选地，从1至200nm。
[0678]
优选地，根据其中存在严格方案要求的临床试验中(体内应用)的上升剂量研究的基础上设计根据本发明的寡核苷酸或组合物的剂量范围。可以以其中范围为从0.01至200mg/kg或0.05至100mg/kg或0.1至50mg/kg或0.1至20mg/kg，优选地从0.5至10mg/kg的剂量使用如此处限定的寡核苷酸。
[0679]
如上述给予的寡核苷酸或组合物的浓度或剂量的范围为用于体内或离体应用的优选的浓度或剂量。技术人员将理解，取决于使用的寡核苷酸的特性、要治疗的靶细胞、基因打靶和它的表达水平、使用的媒介和转染和孵育条件，可进一步改变使用的寡核苷酸的浓度或剂量，并且可需要任何进一步的优化。
[0680]
在这个文件和它的权利要求中，以其非限制性的意义使用动词“包含”和它的变化形式，意味着，包含跟随该单词的项目，但是不排除没有特别提到的项目。另外，可由“基本上由...组成”代替动词“由...组成”，意味着，此处限定的寡核苷酸或组合物可包含除了特别指出的之外的另外的成分，所述另外的成分不改变本发明的独特的特性。另外，关于由不定冠词“一个(a)”或“一种(an)”之后的要素不排除存在超过一种要素的可能性，除非背景明确地要求，存在一个并且是唯一的要素。因此，不定冠词“一个”或“一种”通常意味着“至少一个”。
[0681]
除非另外指出，可同时组合此处确定的每一个实施方式。因此，在本说明书中引用的所有的专利和文献参考全部内容通过引用结合与此。
[0682]
限定
[0683]
遍及申请，当在与此处确定的前体mrna的部分反向互补的反义寡核苷酸的背景下使用时，可交换地使用单词“结合”、“靶向”、“杂交”。
[0684]
另外，遍及申请，当在与此处确定的前体mrna的部分反向互补的反义寡核苷酸的背景下使用时，并且用于其中可发现其中所述寡核苷酸可与所述前体mrna的所述部分结合、靶向或杂交的条件时，可交互地使用表述“能够结合”、“能够靶向”、“能够杂交”。
[0685]
如本文所使用的，“杂交”指的是互补的寡聚化合物的配对(例如，反义化合物和它的靶核酸)。在不限于具体的机制时，最常见的配对机制涉及氢键结合，其可以是互补核苷或核苷酸碱基(核酸碱基)之间的watson-crick、hoogsteen或反hoogsteen氢键结合。例如，天然的碱基腺嘌呤是与天然的核酸碱基胸腺嘧啶和尿嘧啶互补的核酸碱基，其中由氢键的形成而配对。天然的碱基鸟嘌呤是与天然的碱基胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶互补的核酸碱基。可在不同的环境下发生杂交。
[0686]
如本文所使用的，“特异性杂交”指的是，寡聚化合物以比它杂交到另一个核酸位点高的亲和力杂交到一个核酸位点上的能力。在某些实施方式中，反义寡核苷酸特异性地杂交到一个以上的靶位点上。
[0687]
在本发明的背景中，除非另外指出，否则在细胞的生理条件下(优选地，肌细胞)使用“杂交”。
[0688]
如本文所使用，“核苷”指的是，包含杂环碱基部分和糖部分的化合物。核苷包括但不限于，天然存在的核苷(如在dna和rna中发现的)、脱碱基核苷、修饰的核苷和糖修饰的核苷。可用多种取代基中中任一项修饰核苷。
[0689]
如本文所使用的，“糖部分”意味着天然的(呋喃糖基(furanosyl))、修饰的糖部分或糖替代物(sugar surrogate)。
[0690]
如本文所使用的，“修饰的糖部分”意味着化学修饰的呋喃糖基糖或非呋喃基糖部分。同样，这个术语包括呋喃糖基糖类似物和衍生物，包括三环的糖、二环的糖、四氢吡喃类、吗啉代、2
’-
修饰的糖、4
’-
修饰的糖、5
’-
修饰的糖和4
’-
修饰的糖。
[0691]
如本文所使用的，“糖修饰的核苷”意味着包含修饰的糖部分的核苷。
[0692]
如本文所使用的，术语“糖替代物”指的是，能够代替天然存在的核苷的呋喃糖环的结构。在某些实施方式中，糖替代物是非呋喃糖(或4
’-
取代的呋喃糖)环或环体系或开环体系。这样的结构包含相对于天然的呋喃糖环的简单的改变，如六元环或可像在其中用于肽核酸的非环体系的情况一样更复杂。糖替代物包含但不限于吗啉和环己烯和环己糖醇。在具有糖替代物基团的大多数核苷中，通常保留杂环碱基部分，以允许杂交。
[0693]
如本文所使用的，“核苷酸”指的是进一步包含修饰的或未修饰的磷酸酯连接基团或非磷酸酯核苷间键的核苷。
[0694]
如本文所使用的，“连接的核苷”可以是或可以不是由磷酸酯键连接的，因此包括“连接的核苷酸”。
[0695]
如本文所使用的，“碱基”指的是核苷的杂环碱基部分。碱基可以是天然存在的或可以是修饰的，并因此包括但不限于腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶和它们的类似物如5-甲基胞嘧啶。在某些实施方式中，核酸碱基(nucleobase)可以包含能够与另一个核酸的碱基氢键结合的任何原子或原子的组。
[0696]
如本文所使用的，“修饰的核苷”指的是，与天然存在的rna或dna核苷相比包含至少一个修饰的核苷。这样的修饰可以是在糖部分上和/或在核酸碱基上。
[0697]
如本文所使用的，“t
m”意味着解链温度，其是双链核酸的两个链分开的温度。t
m
经常用作双链体稳定性或反义化合物针对互补rna分子的结合亲和力的量度标准。
[0698]
如本文所使用的，“2
’-
修饰的”或“2
’-
取代的”指的是包括包含在2
’
位置上含有取代基(而不是h或oh)的糖的核苷。2
’-
修饰的核苷包括但不限于，双环核苷，其中桥连接糖环的两个碳原子连接糖环的2
’
碳和另一个碳；和具有非桥接的2
’-
取代基的核苷，如烯丙基、氨基、叠氮基、巯基(硫代，thio)、o-烯丙基、o-c
1-c
10
烷基、-ocf
3
、o-(ch
2
)
2-o-ch
3
、2
′-
o(ch
2
)
2
sch
3
、o-(ch
2
)
2-o-n(r
m
)(r
n
)或o-ch
2-c(＝o)-n(r
m
)(r
n
)，其中每一个r
m
和r
n
独立地是h或取代的或未取代的的c
1-c
10
烷基。2
’-
修饰的核苷可进一步包含其他修饰，例如，在糖的其他位置和/或在核酸碱基上。
[0699]
如本文所使用的，“2
′-
ome”或“2
′-
och
3”或“2
′-
o-甲基”各自指的是包含在糖环的2
’
位置上含有-och
3
基团的糖的核苷。
[0700]
如本文所使用的，“moe”或“2
′-
moe”或“2
′-
och
2
ch
2
och
3”或“2
′-
o-甲氧乙基”各自指的是包含在糖环的2
’
位置上含有-och
2
ch
2
och
3
基团的糖的核苷。
[0701]
如本文所使用的，术语“腺嘌呤类似物”意味着，当并入寡聚物时，能够与rna或dna的互补链的胸腺嘧啶或尿嘧啶形成watson-crick碱基对的化学修饰的嘌呤核酸碱基。
[0702]
如本文所使用的，术语“尿嘧啶类似物”意味着，当并入寡聚物时，能够与rna或dna的互补链的任意腺嘌呤形成watson-crick碱基对的化学修饰的嘧啶碱基。
[0703]
如本文所使用的，术语“胸腺嘧啶类似物”意味着，当并入寡聚物时，能够与rna或
dna的互补链的腺嘌呤形成watson-crick碱基对的化学修饰的嘧啶碱基。
[0704]
如本文所使用的，术语“胞嘧啶类似物”意味着，当并入寡聚物时，能够与rna或dna的互补链的鸟嘌呤形成watson-crick碱基对的化学修饰的嘧啶碱基。例如，胞嘧啶类似物可以是5-甲基胞嘧啶。
[0705]
如本文所使用的，术语“鸟嘌呤类似物”意味着，当并入寡聚物时，能够与rna或dna的互补链的胞嘧啶形成watson-crick碱基对的化学修饰的嘌呤碱基。
[0706]
如本文所使用的，术语“鸟苷”指的是，包含鸟嘌呤或鸟嘌呤类似物核糖碱基的核苷或糖修饰的核苷。
[0707]
如本文所使用的，术语“尿苷”指的是，包含尿嘧啶或尿嘧啶类似物核糖碱基的核苷或糖修饰的核苷。
[0708]
如本文所使用的，术语“胸苷”指的是，包含胸腺嘧啶或胸腺嘧啶类似物核糖碱基的核苷或糖修饰的核苷。
[0709]
如本文所使用的，术语“胞苷”指的是，包含胞嘧啶或胞嘧啶类似物核糖碱基的核苷或糖修饰的核苷。
[0710]
如本文所使用的，术语“腺苷”指的是，包含腺嘌呤或腺嘌呤类似物核糖碱基的核苷或糖修饰的核苷。
[0711]
如本文所使用的，“寡核苷酸”指的是，包含多个连接的核苷的化合物。在某些实施方式中，多个核苷的一个或多个是修饰的。在某些实施方式中，寡核苷酸包含一个或更多个核糖核苷(rna)和/或脱氧核糖核苷(dna)。
[0712]
如本文所使用的，“寡核苷(oligonucleoside)”指的是，其中没有一个核苷间键含有磷原子的寡核苷酸。如本文所使用的，寡核苷酸包括寡核苷。
[0713]
如本文所使用的，“修饰的寡核苷酸”或“化学修饰的寡核苷酸”指的是，包含至少一个修饰的糖、修饰的碱基和/或修饰的核苷间键或骨架的寡核苷酸。
[0714]
如本文所使用的，“核苷间键”或“骨架”指的是，相邻的核苷之间的共价键。
[0715]
如本文所使用的，“天然存在的核苷间键”指的是3
’
至5
’
磷酸二酯键。
[0716]
如本文所使用的，“修饰的核苷间键”指的是，除了天然存在的核苷间键之外的任何的核苷间键。
[0717]
如本文所使用的，“寡聚化合物”指的是，包含两个或更多个亚结构的聚合结构。在某些实施方式中，寡聚化合物是寡核苷酸。在某些实施方式中，寡聚化合物是单链的寡核苷酸。在某些实施方式中，寡聚化合物是包含两个寡核苷酸的双链复合物。在某些实施方式中，寡聚化合物是包含一个或更多个缀合基团和/或末端基团的单链或双链寡核苷酸。
[0718]
如本文所使用的，“缀合(共轭，conjugate)”指的是结合至寡核苷酸或寡聚化合物的原子或原子的组。通常，缀合基团修饰它们所附着的化合物的一个或更多个性质，包括但不限于，药效动力学、药代动力学、结合、吸收、细胞分布、细胞摄取、电荷和清除。缀合基团通常用于化学领域和直接地连接或经由可选的连接部分或连接基团连接至母体化合物(parent compound)如寡聚化合物。在某些实施方式中，缀合基团包括但不限于，嵌入剂(intercalator)、报告分子、多胺、聚酰胺、聚乙二醇、硫醚、聚醚、胆固醇、硫代胆固醇、胆酸部分、叶酸、脂质、磷脂、生物素、吩嗪、菲啶、蒽醌、金刚烷、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素和染料。在某些实施方式中，缀合物是末端基团。在某些实施方式中，缀合附着至寡核苷酸的
3
’
或5
’
末端核苷或附着至内部核苷。
[0719]
如本文所使用的，“缀合连接基团”指的是用于将缀合物附着寡核苷酸或寡聚化合物的任何原子或原子的组。连接基团或双官能连接部分如本领域已知的那些服从于本发明。
[0720]
如本文所使用的，“反义化合物”指的是这样的寡聚化合物，它的至少部分至少部分地与靶向核酸互补，其中所述反义化合物杂交于所述靶核酸并且调节所述靶核酸的活性、加工或表达。
[0721]
如本文所使用的，“表述”指的是，基因最终产生蛋白质的过程。表达包括但不限于，转录、剪接、转录后修饰和翻译。
[0722]
如本文所使用的，“反义寡核苷酸”指的是反义化合物，其是寡核苷酸。
[0723]
如本文所使用的，“反义活性”指的是，归因于反义化合物与它的靶核酸的杂交的任何可检测的和/或可测量的活性。在某些实施方式中，这样的活性可以是核酸或蛋白质的量的增加或减少。在某些实施方式中，这样的活性可以是核酸或蛋白质的剪接变体的比率的改变。反义活性的检测和/或测量可以是直接的或间接的。在某些实施方式中，通过观察细胞或动物的表型变化评估反义活性。
[0724]
如本文所使用的，“靶核酸”指的是任何核酸分子，它的表达、量或活性能够由反义化合物所调节。在某些实施方式中，靶核酸是dna或rna。在某些实施方式中，靶rna是mrna、前体mrna、非编码rna、前前体微rna(pri-microrna)、前体微rna(pre-microrna)、成熟微rna、启动子定向的rna或天然的反义转录本。例如，靶核酸可以是其表达与具体的病症或疾病状态相关的细胞基因(或从基因转录的mrna)，或来自病原性媒介物(infectious agent)的核酸分子。在某些实施方式中，靶核酸是病毒核酸或细菌核酸。
[0725]
如本文所使用的，“靶mrna”指的是编码蛋白质的预选择的rna分子。
[0726]
如本文所使用的，“靶向”或“靶向至”指的是，反义化合物与特定靶核酸分子或靶核酸分子内的核苷的特定区域的结合。如果在生理条件下，它足以与靶核酸分子互补以允许杂交，则反义化合物靶向靶核酸。
[0727]
如本文所使用的，“靶位点”指的是，由反义化合物结合的靶核酸的区域。在某些实施方式中，靶位点至少部分地在rna分子的3
’
非翻译区内。在某些实施方式中，靶位点至少部分地在rna分子的5
’
非翻译区内。在某些实施方式中，靶位点至少部分地在rna分子的编码区内。在某些实施方式中，靶位点至少部分地在rna分子的外显子内。在某些实施方式中，靶位点至少部分地在rna分子的内含子内。在某些实施方式中，靶位点至少部分地在rna分子的微rna靶位点内。在某些实施方式中，靶位点至少部分地在rna分子的重复区内。
[0728]
如本文所使用的，“靶蛋白质”指的是，由反义化合物调节它的表达的蛋白质。在某些实施方式中，由靶核酸编码靶蛋白质。在某些实施方式中，另外，由靶核酸影响靶蛋白质的表达。
[0729]
如本文所使用的，关于核酸碱基的“互补性”指的是，能够与另外的核酸碱基进行碱基配对的核酸碱基。例如，在dna中，腺嘌呤(a)与胸腺嘧啶(t)互补。例如，在rna中，腺嘌呤(a)与尿嘧啶(u)互补。在某些实施方式中，互补核酸碱基指的是，能够与它的靶核酸的核酸碱基进行碱基配对的反义化合物的核酸碱基。例如，如果在反义化合物的某些位置上的核酸碱基能够与靶核酸的某些位置上的核酸碱基氢键结合，那么认为寡核苷酸和靶核酸之
间的氢键结合的位置在那个核酸碱基对上是互补的。包含某些修饰的核酸碱基可保持与配对物核酸碱基配对的能力，因此，仍然是能够核酸碱基互补。
[0730]
如本文所使用的，关于核酸碱基的“非互补的”指的是，彼此不能形成氢键或另外不能支持杂交的核酸碱基对。
[0731]
如本文所使用的，关于连接的核苷、寡核苷酸或核酸的“互补性”指的是，寡聚化合物通过核酸碱基互补性杂交于另一个寡聚化合物或核酸的能力。在某些实施方式中，当由彼此结合的核酸碱基占据每一个分子中的足够数的相应位置时，反义化合物和它的靶标彼此互补以允许反义化合物和靶标之间的稳定的结合。本领域的技术人员认识到，在没有排除寡聚化合物保持处于结合的能力的情况下，包含错配是可能的。因此，本文所描述的是可以包含最高达大约20％错配的核苷酸的反义化合物(即，不与靶的相应的核苷酸核酸碱基互补)。优选地，反义化合物含有不超过大约15％、更优选地不超过10％、最优选地不超过5％的错配或没有错配。剩余的核苷酸是互补的核酸碱基或另外不破坏杂交的(例如，通用碱基)。本领域的技术人员将认识到，本文所提供的化合物与靶核酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互补。
[0732]
如本文所使用的，“调节”指的是，当与调节之前的功能或活性比较时，功能或活性的数量或质量的扰动(perturbation)。例如，调节包含基因表达方面的改变，增加(刺激或诱导)或减少(抑制或降低)。作为进一步的实例，表达的调节可以包括扰动前体mrna加工的剪接位点选择，与未扰动的条件相比，产生存在的具体的剪接变体的量的改变。作为进一步的实例，调节包括扰动蛋白质的翻译。
[0733]
如本文所使用的，“基序”指的是，寡聚化合物或它的区域的修饰的模式。可由寡聚化合物的某些核苷和/或某些连接基团上的修饰限定基序。
[0734]
如本文所使用的，“核苷基序”指的是，寡聚化合物或它的区域中的核苷修饰的模式。这样的寡聚化合物的连接可以是被修饰的或未修饰的。除非另外指出，本文仅描述核苷的基序意在是核苷基序。因此，在这样的情况下，不限制连接。
[0735]
如本文所使用的，“连接基序”指的是，寡聚化合物或它的区域中的连接修饰的模式。这样的寡聚化合物的核苷可以是被修饰的或未修饰的。除非另外指出，本文仅描述连接的基序意在是连接基序。因此，在这样的情况下，不限制核苷。
[0736]
如本文所使用的，“相同的修饰”指的是，相对于天然存在的分子的修饰与另一个彼此相同，包括没有修饰。因此，例如，两个未修饰的dna核苷具有“相同的修饰”，即使dna核苷是未修饰的。
[0737]
如本文所使用的，关于核苷的“修饰的类型”或“类型”的核苷指的是，核苷的修饰并且包括修饰的和未修饰的核苷。因此，除非另外指出，“具有第一类型的修饰的核苷”可以是未修饰的核苷。
[0738]
如本文所使用的，“单独的区域”指的是，寡聚化合物的部分，其中该区域内的核苷和核苷间键都包含相同的修饰；并且核苷和/或任何相邻的部分的核苷间键包含至少一个不同的修饰。
[0739]
如本文所使用的，“药用盐”指的是，保留活性化合物的期望的生物活性且不赋予非期望的毒物学影响的活性化合物的盐。
[0740]
如本文所使用的，“帽子结构”或“末端帽子部分”指的是，反义化合物的任一末端
上包含的化学修饰。
[0741]
如本文所使用的，术语“独立地”意味着，彼此独立地选择要求保护的寡核苷酸内的重复的变量的每一次出现。例如，可选择每一个重复变量，使得，(i)重复的变量的每一个是相同的，(ii)两个或更多是相同的，或(iii)重复的变量的每一个可以是不同的。
[0742]
普通化学限定
[0743]
如本文所使用的，“烷基”指的是，饱和的直链或支链碳氢化合物取代基或基团，典型地，含有最高达二十四个碳原子。烷基基团的实例包括但不限于，甲基、乙基、丙基、丁基、异丙基、正己基、辛基、癸基、十二烷基等等。典型地，烷基基团包含从1至24个碳原子，更典型地，从1至12个碳原子(c
1-c
12
烷基)，其中更选优具有从1至6个碳原子(c
1-c
6
烷基)。本文所使用的术语“低级烷基”包含从1至6个碳原子(c
1-c
6
烷基)。可选地，本文所使用的烷基可以包含一个或更多个另外的取代基。
[0744]
如本文所使用的，“烯基”指的是直链或支链碳氢化合物链基团或取代基，典型地，含有最高达二十四个碳原子并且具有至少一个碳-碳双键。烯基基团的实例包括但不限于，乙烯基、丙烯基、丁烯基、1-甲基-2-丁烯-1-基、二烯如1，3-丁二烯基等等。典型地，烯基基团包含从2至24个碳原子，更典型地，从2至12个碳原子，其中更优选具有从2至6个碳原子。可选地，本文所使用的烯基基团可以包含一个或更多个另外的取代基。
[0745]
如本文所使用的，“炔基”指的是直链或支链碳氢化合物基团或取代基，典型地，含有最高达二十四个碳原子并且具有至少一个碳-碳三键。炔基基团的实例包括但不限于，乙炔基、1-丙炔基、1-丁炔基、等等。典型地，炔基基团包含从2至24个碳原子，更典型地，从2至12个碳原子，其中更优选具有从2至6个碳原子。可选地，本文所使用的炔基基团包含一个或更多个另外的取代基。
[0746]
如本文所使用的，“氨基烷基”指的是，氨基取代的烷基基团或取代基。这个术语意味着包括在任何位置上具有氨基取代基的c
1-c
12
烷基基团，并且其中氨基烷基基团经由它的烷基部分附着至母体分子。可用取代基进一步取代氨基烷基基团的烷基和/或氨基部分。
[0747]
如本文所使用的，“脂肪族”指的是直链或支链碳氢化合物基团或取代基，典型地含有最高达二十四个碳原子，其中任何两个碳原子之间的饱和度是单键、双键或三键。优选地，脂肪族含有从1至24个碳原子，更典型地从1至12个碳原子，其中更优选具有从1至6个碳原子。可用包括氮、氧、硫和磷在内的一个或更多个杂原子间断脂肪族基团的直链或支链。由杂原子间断的这样的脂肪族基团包括但不限于，聚烷氧基，如聚二醇、多胺和聚亚胺。可选地，本文所使用的脂肪族基团可包含另外的取代基团。
[0748]
如本文所使用的，“脂环族”或“脂环基”指的是其中环体系是脂肪族的环状基团或取代基。环体系可包含一个或更多个环，其中至少一个环是脂肪族的。优选的脂环族部分包括在环中具有从5至9个碳原子的环。可选地，本文所使用的脂环族基团可以包含另外的取代基。
[0749]
如本文所使用的，“烷氧基”指的是包含烷基基团和氧原子的基团或取代基，其中烷氧基基团经由它的氧原子附着于母体分子。烷氧基基团的实例包括但不限于，甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、新戊氧基、正己氧基等等。可选地，本文所使用的烷氧基可包含另外的取代基。
[0750]
如本文所使用的，“卤代基”、“卤化物”和“卤素”指的是选自氟、氯、溴和碘的原子、
基团或取代基。
[0751]
如本文所使用的，“芳基”和“芳族的”指的是包含具有一个或更多个芳环的单环或多环碳环的环体系的基团或取代基。芳基基团的实例包括但不限于，苯基、萘基、四氢萘基、茚满基、茚基(indenyl)等等。优选的芳基环体系在一个或更多个环中具有从5至20个碳原子。可选地，本文所使用的芳基基团可以包含另外的取代基。
[0752]
如本文所使用的，“芳烷基”和“芳基烷基”指的是包含烷基和芳基的基团或取代基，其中芳烷基或芳基烷基基团经由它的烷基部分附着于母体分子。实例包括但不限于，苄基、苯乙基等等。可选地，本文所使用的芳烷基可以包含附着于烷基、芳基或两个基团上、其形成基团或取代基的另外的取代基。
[0753]
如本文所使用的，“杂环基”指的是包含单环或多环环体系的基团或取代基，其包含至少一个杂原子并且是不饱和的、部分地饱和的或完全地饱和的，从而包括杂芳基基团。杂环基也意味着包括稠环体系部分，其中一个或更多个稠环含有至少一个杂原子并且其他环可以含有一个或更多个杂原子或可选地不含有杂原子。典型地，杂环基团包含选自硫、氮或氧的至少一个原子。杂环基团的实例包含[1，3]二氧戊环、吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑基、异噻唑基、喹喔啉基、哒嗪酮基(pyridazinonyl)、四氢呋喃基等等。可选地，本文所使用的杂环基团可包含另外的取代基。
[0754]
如本文所使用的，“杂芳基”和“杂芳族的”指的是，包含单环或多环芳族环、环体系或稠环体系的基团或取代基，其中至少一个环是芳族的并且包含一个或更多个杂原子。杂芳基也意味着包括稠环体系，该稠环体系包括其中一个或更多个稠环不含有杂原子的系统。典型地，杂芳基基团包含选自硫、氮或氧的一个环原子。杂芳基基团的实例包括但不限于，吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、噁唑基、异噁唑基、噻二唑基、噁二唑基、苯硫基(thiophenyl)、呋喃基、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、喹喔啉基等等。杂芳基基团或取代基可以直接地或通过连接部分如脂族基团或杂原子附着于母体分子。可选地，本文所使用的杂芳基可包含另外的取代基。
[0755]
如本文所使用的，“杂芳烷基”指的是包含如先前限定的杂芳基基团和烷基部分的基团或取代基，其中杂芳烷基基团经由它的烷基部分附着于母体分子。实例包括但不限于，吡啶基甲基、嘧啶基乙基、萘啶基丙基等等。可选地，本文所使用的杂芳基烷基基团可以在杂芳基或烷基部分的一个或两者上包含另外的取代基。
[0756]
如本文所使用的，“单环或多环的”指的是任何环体系，如具有是稠和的或连接的的环的单环或多环体系，并且意味着包含独立地选自脂肪族的、脂环族的、芳基、杂芳基、芳烷基、芳基烷基、杂环的、杂芳基、杂芳族的和杂芳基烷基的单环的和混合的环体系。这样的单环的和多环结构可以含有具有均匀的或不同的饱和度的环，包括完全饱和的、部分饱和的或完全不饱和的环。每一个环可以包含选自c、n、o和s的环原子以使环成为杂环，以及环只包含c环原子。杂环和所有的碳环可存在于混合的基序中，如，例如，苯并咪唑，其中稠环体系中的一个环只具有碳环原子而其他环具有两个氮原子。可用取代基进一步取代单环或多环结构，如，例如，苯邻二甲酰亚胺，其具有附着到一个环上的两个氧基团(＝o)。在另一个方面中，单环或多环结构可以直接地通过环原子、通过取代基或双官能连接部分附着于母体分子。
[0757]
如本文所使用的，“酰基”指的是，包含羰基部分(c＝o或-c(o)-)和另外的取代基x的基团或取代基，其中酰基基团经由它的羰基部分附着于母体分子。同样地，通过从有机酸去除羟基在形式上获得酰基，并且具有通式-c(o)-x，其中典型地，x是脂肪族的、脂环族的或芳族的。术语“酰基”也意味着包括具有通式-y(o)
n-x的杂酰基基团或取代基，其中x与上述限定的相同，并且典型地y(o)n是磺酰基、亚磺酰基或磷酸盐。酰基的实例包括脂肪族羰基、芳族羰基、脂肪族磺酰基、芳族亚磺酰基、脂肪族亚磺酰基、芳族磷酸盐、脂肪族磷酸盐等等。可选地，本文所使用的酰基可以包含另外的取代基。
[0758]
如本文所使用的，“取代基”和“取代基基团”包含典型地加入到其他取代基或母体化合物以增强期望的性质或给出期望的效果的基团。可以保护或去保护取代基基团，并且可以将取代基基团附着到母体化合物中的一个有效的位点或很多有效的位点上。也可用其他取代基基团进一步取代取代基基团，并且取代基基团可以直接地或经由连接基团如烷基或烃基基团附着于母体化合物。本文中，“烃基”指的是包含c、o和h的任何基团。包括的是具有任何饱和度的直链、支链和环状基团。这样的烃基基团可以包含一个或更多个选自n、o和s的杂原子，并且可以用一个或更多个取代基基团进一步取代这样的烃基基团。
[0759]
除非另外指出，术语取代的或“可选地取代的”指的是可选存在下列取代基中中任一项的：卤素、羟基、烷基、烯基、炔基、酰基(-c(o)r
aa
)、羧基(-c(o)o-r
aa
)、脂肪基、脂环族基团、烷氧基、取代的氧基(-o-r
aa
)、芳基、芳烷基、杂环的、杂芳基、杂芳烷基、氨基(-nr
bb
r
cc
)、亚氨基(＝nr
bb
)、酰胺基(-c(o)nr
bb
r
cc
或-n(r
bb
)c(o)r
aa
)、叠氮基(-n
3
)、硝基(-no
2
)、氰基(-cn)、脲基(-oc(o)nr
bb
r
cc
或-n(r
bb
)c(o)or
aa
)、脲基(-n(r
bb
)c(o)nr
bb
r
cc
)、硫脲基(-n(r
bb
)c(s)nr
bb
r
cc
)、胍基(-n(r
bb
)c(＝nr
bb
)nr
bb
r
cc
)、脒基(-c(＝nr
bb
)nr
bb
r
cc
或-n(r
bb
)c(nr
bb
)r
aa
)、巯基(-sr
bb
)、亚磺酰基(-s(o)r
bb
)、磺酰基(-s(o)
2
r
bb
)、磺胺基(-s(o)
2
nr
bb
r
cc
或-n(r
bb
)s(o)
2
r
bb
)和缀合基团。此处，r
aa
、r
bb
和r
cc
中的每一个独立地是h、可选地连接的化学官能团或另外的取代基基团，优选但是不限于选自由h、烷基、烯基、炔基、脂肪族的、烷氧基、酰基、芳基、芳烷基、杂芳基、脂环族的、杂环的和杂芳烷基组成的组。将本文所描述的化合物内的选定取代基表示为递归度(recursive degree)。
[0760]
在这个背景下，“递归取代基”意味着取代基可列举它自身的另一个实例。由于这样的取代基的递归性，理论上，大的数量可以存在于任何给定权利要求中。医药化学和有机化学领域的技术人员明白，由预定的化合物的期望的性质合理地限制这样的取代基的总数。这样的性质包括(以举例的方式)并且不限于，物理性质如分子量、溶解性或log p，应用性质如对预定目标的活性和实际性质如合成的容易度。
[0761]
递归取代基是本发明的预定方面。医药化学和有机化学领域的技术人员明白这样的取代基的多功能性。至于根据递归取代基存在于本发明的权利要求的程度，将如上所述的确定总数。
[0762]
本文所使用的术语“稳定的化合物”和“稳定的结构”意味着指示化合物足够强健以继续存在，由反应混合物分离至有用的纯净度，并且配制成有效的治疗剂。此处只预期稳定的化合物。
[0763]
如本文所使用的，具体的单元的范围指示数中的零(0)意味着，单元可以是不存在的。例如，寡聚化合物包含具体的基序的0-2区域，意味着，寡聚化合物可包含一个或两个具有特定的基序的这样的区域，或寡聚化合物可不具有具该特定基序的任何区域。在其中缺
少分子的内部部分的实例中，与缺少部分侧接的部分彼此直接地结合。同样地，本文所使用的术语“没有”指示某些特征不存在。
[0764]
如本文所使用的，“类似物”或“衍生物”意味着化合物或部分结构相似，但是关于要素组成与母体化合物不同，与如何制造化合物无关。例如，类似物或衍生的化合物不需要由母体化合物作为化学原材料而制备。
[0765]
仅为了说明性目的提供下列实施例，和并不意在以任何方式限制本发明的范围。
附图说明
[0766]
图1a至图1c：
[0767]
在用(图1a)ps229l/ps524，seq id no：52(对应于对于未修饰的序列的seq id no：91，对应于seq id no：92，其中修饰了所有的胞嘧啶)或(图1b)ps220/ps339(seq id no：21，对应于对于未修饰的序列的seq id no：101，对应于seq id no：200，其中修饰了所有的胞嘧啶)或(图1c)ps524/ps1317/ps1318/ps1319，seq id no：52(对应于seq id no：92(ps524)，其中修饰了所有的6个胞嘧啶，对应于seq id no：217(ps1317)，其中修饰了6个胞嘧啶中的4个，对应于seq id no：218(ps1318)其中修饰了6个胞嘧啶中的2个并且对应于seq id no：219(ps1319)，其中修饰了seq id no：217的6个胞嘧啶中的3个)转染之后，在体外在分化的健康肌肉细胞中具有或没有胞嘧啶的aon与5-甲基胞嘧啶代替的比较。由每个浓度三次重复(n＝3)(图1a、图1b)或两次重复(n＝2)(图1c)转染计算平均跳读百分数。实线指的是具有5-甲基胞嘧啶的aon，虚线指的是具有未代替的胞嘧啶的aon(图1a、图1b)。
[0768]
图2a至图2b：
[0769]
野生型(对照)和mdx小鼠的药代动力学研究的总结，比较具有5-甲基胞嘧啶(ps524，seq id no：52(即，对应于seq id no：92，其中修饰了所有的胞嘧啶)和ps652，seq id no：57(即，对应于seq id no：185，其中修饰了所有的胞嘧啶))的aon和具有未修饰(非甲基化的)胞嘧啶(ps229l，对应于用于未修饰的序列的seq id no：91的seq id no：52，和ps531，对应于用于未修饰的序列的seq id no：137的seq id no：57)的aon的血浆和肌肉组织曲线。(图2a)以下的药代动力学组织分析：1)在一次单一sc注射之后，mdx小鼠对对照小鼠的肌肉中的aon的平均水平之间的比值；2)第14天时，几种mdx肌肉中(dia＝隔膜，gastroc＝腓肠肌，quadr＝四头肌，tric＝三头肌)的aon的水平(g/g)；3)第14天时，相对肌肉/肾脏和肌肉/肝脏水平，和4)三头肌中不同的aon的估计的半衰期。(图2b)以下的药代动力学血浆分析：1)tmax(达到cmax的时间，只包含分析的两个时间点(15或60min))，2)cmax(达到的最高的血浆浓度)3)auc(曲线下面积；指示生物利用度)和4)c1(24h上的血浆清除率)。
[0770]
图3a至图3h：
[0771]
在用0、10、25、或50μg/ml的具有未修饰的胞嘧啶ps232(seq id no：39，对应于用于未修饰的序列的seq id no：119)和ps534(seq id no：59，对应于用于未修饰的序列的seq id no：139)(黑条)的aon或具有5-甲基胞嘧啶ps648(seq id no：39，对应于seq id no：201，其中修饰了所有的胞嘧啶)和ps653(seq id no：59，对应于seq id no：192，其中修饰所有的胞嘧啶)(灰色条)的aon孵育之后，人类全血中的细胞因子水平的分析。用市售的elisa试剂盒确定tnfα(图3a，图3b)、mcp-1(图3c，图3d)、ip-10(图3e，图3f)、和il6(图3g，
图3h)的水平。每一个实验重复四次(n＝4)。显示每一个细胞因子的最显著的响应的数据。
[0772]
图4a和图4b：
[0773]
具有5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶的aon与对应的没有这些碱基修饰的aon的活性比较。图4a：体外转染200nm，两次，到分化的健康肌肉细胞中。将活性表示为平均百分数外显子51(ps43，由seq id no：111表示的未修饰的序列，ps559，对应于seq id no：202，其中修饰了所有的尿嘧啶，ps1106，对应于seq id no：203，其中修饰了所有的胞嘧啶和所有的尿嘧啶。所有的序列来源于seq id no：31)；外显子44(ps188，由seq id no：95表示的未修饰的序列，ps785，对应于seq id no：204，其中修饰了所有的尿嘧啶，ps1107，对应于seq id no：205，其中修饰了所有的胞嘧啶和所有的尿嘧啶。所有的序列来源于seq id no：15)；或外显子52(ps235，由seq id no：120表示的未修饰的序列，ps786，对应于seq id no：172，其中修饰了所有的尿嘧啶。所有的序列来源于seq id no：40))跳读(n＝2)。在下面的表格中显示aon序列(5
’
至3
’
)和碱基修饰(粗体的，下划线的核苷酸)。图4b：mdx小鼠的腓肠肌中肌肉注射20μg的ps49(未修饰的序列，seq id no：216)或ps959(修饰的序列，其中修饰了所有的尿嘧啶，seq id no：214)。将活性表示为平均百分数鼠类外显子23跳读(n＝4)。在下面的表格中显示aon序列(5
’
至3
’
)和碱基修饰(粗体，下划线的核苷酸)。
[0774]
图5a至图5c：
[0775]
具有2，6-二氨基嘌呤的aon与没有该碱基修饰的相应的aon的活性比较。图5a：体外转染，200nm，两次，到分化的健康肌肉细胞内。将活性表示为平均百分数外显子51(ps43，由seq id no：111表示的未修饰的序列，ps403，对应于seq id no：206，其中修饰了所有的腺嘌呤，所有的序列来源于seq id no：31)；外显子52(ps235，由seq id no：120表示的未修饰的序列，ps897：对应于seq id no：173，其中修饰了所有的腺嘌呤，所有的序列来源于seq id no：40)；或外显子44(ps188，由seq id no：95表示的未修饰的序列，ps733：对应于seq id no：207，其中修饰了所有的腺嘌呤，所有的序列来源于seq id no：15)跳读(n＝2)。在下面的表格中显示aon序列(5
’
至3
’
)和碱基修饰(粗体的，下划线的核苷酸)。图5b和图5c：用2，6-二氨基嘌呤(ps733；seq id no：207)代替所有的未修饰的腺嘌呤(ps188；seq id no：95)对体外安全性的影响。在猴子血浆中测量作为用于激活可替代的互补通路的标记的剪接因子c3a(图5b)和bb(图5c)。
实施例
[0776]
表1
[0777]
aon的通用结构。x＝c或m
5
c，y＝u或m
5
u，z＝a或a
2
a；i＝肌苷(次黄嘌呤碱基)，x
1
＝m
5
c，y
1
＝m
5
u，z
1
＝a
2
a。
[0778]
[0779]
[0780][0781]
[0782]
表2
[0783]
aon的通用结构。x＝c或m
5
c，y＝u或m
5
u，z＝a或a
2
a；i＝肌苷(次黄嘌呤碱基)，x
1
＝m
5
c，y
1
＝m
5
u，z
1
＝a
2
a。
[0784]
[0785][0786]
表3.最优选的aon
[0787]
aon的通用结构。x＝c或m
5
c，y＝u或m
5
u，z＝a或a
2
a；i＝肌苷(次黄嘌呤碱基)，x
1
＝m
5
c，y
1
＝m
5
u，z
1
＝a
2
a。
[0788]
no：119(ps232)和对应于seq id no：201，其中修饰了所有的胞嘧啶(ps648)；ps531/ps652，基于seq id no：57，对应于对于未修饰的序列的seq id no：137(ps531)和对应于seq id no：185，其中修饰了所有的胞嘧啶(ps652)；ps534/ps653，基于seq id no：59，对应于对于未修饰的序列的seq id no：139(ps534)和对应于seq id no：192，其中修饰了所有的胞嘧啶(ps653))都是2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna，并且通过标准的亚磷酰胺方案使用op-10合成器(oligopilot)合成，或以40nmol-4.5mmol合成规模，从商业供应商获得。在两个步骤序列中切割prosensa-合成的寡核苷酸并且去保护(diea，之后浓缩nh
4
oh处理)，由hplc纯化并且溶解在水中并且添加过量的nacl以交换离子。在蒸发之后，将化合物再次溶解于水中，由fplc脱盐或超滤并冻干。质谱证实发现所有的化合物和纯度的识别(由uplc确定)对于所有化合物来说是可接受的(＞75-80％)；从商业来源获得的化合物如接收时状态使用：ps399(chemgenes，1μmol合成规模，如接收时状态使用)、ps1317，ps1318，和ps1319(chemgenes，200nmol合成规模，如接收时状态使用)、ps229l，ps232，ps524，和ps648(eurogentec，40nmol合成规模，如接收时状态使用)、ps229l(prosensa，5.9g获得的材料，纯度81％)、ps524(avecia，4.5mmol合成规模，纯度93％)、ps534(prosensa，2μmol合成规模，纯度86％)、ps653(prosensa，40nmol合成规模，纯度77％)、ps531(avecia，4.6g获得的材料，纯度85％)、ps652(avecia，2.4g获得的材料，纯度84％和3.8g获得的材料，纯度82％)。关于本文所描述的体外转染实验，在20mm磷酸盐缓冲液(ph7.0)中制备aon的50μm工作液。关于这个实施例中的全血细胞因子释放实验，存储溶液的浓度(在无dna酶/rna酶的蒸馏水(invitrogen)中制备)不同：ps232(8.75mg/ml)，ps534(7.02mg/ml)，ps648(8.55mg/ml)，ps653(8.12mg/ml)。
[0796]
转染和rt-pcr分析
[0797]
根据非glp标准操作程序，以0-100-200-400nm的三个(triplo)aon浓度系列(图1a，ps229l/ps524，seq id no：91/seq id no：92)或0-50-100-200-400-800nm(图1b，ps220/ps399，seq id no：101/seq id no：200)或以400nm的两个(duplo)浓度(图1c，ps524/ps1317/ps1318/ps1319，seq id no：92/seq id no：217/seq id no：218/seq id no：219)在6-孔板中转染分化的人健康对照肌肉细胞(肌管)。对于转染，使用聚乙烯亚胺(exgen500，fermentas)(2μl每μgaon，在0.15m nacl中)。从先前报道的材料和方法(aartsma-rus等人，2003)改编上述的转染程序。在转染之后的24hrs，分离rna并通过rt-pcr分析。简单地说，为了产生肌养蛋白特异的cdna，在1000nm输入rna上，在逆转录酶(rt)反应中使用外显子47(ps220/ps399)或外显子55(ps229l/ps524/ps1317/ps1318/ps1319)中的dmd基因特异性反向引物。随后，为每一个样品，在3μl的肌养蛋白cdna上完成pcr分析，并且包括在外显子侧翼外显子45(ps220/ps399)或53(ps229l/ps524/ps1317/ps1318/ps1319)中使用dmd基因特异引物的第一pcr和巢式pcr。根据描述的非glp标准操作程序(aartsma-rus等人，2003)进行rna分离和rt-pcr分析。由凝胶电泳(2％琼脂糖凝胶)分析rt-pcr产物。通过dna lab-on-a-chip分析(agilent)量化产生的rt-pcr片段。由“agilent 2100 bioanalyzer”软件和excel 2007处理数据。评估较小的转录本产物(含有外显子45(ps220/ps399)或53跳读(ps229l/ps524/ps1317/ps1318/ps1319))与转录本产物的总量的比率(以百分数表示外显子45或53跳读效率)并且直接地与非转染的细胞中的比率相比较。
[0798]
野生型和mdx小鼠的药代动力学研究
[0799]
从jackson实验室(美国缅因州)获得5周龄的mdx(c57bl/10scsn-dmd
mdx
/j)和野生型(c57bl/10scsnj)小鼠。由每周三次皮下注射持续两周给予在生理盐水中100mg/kg的剂量的aon(ps229l/ps524，对应于seq id no：91/seq id no：92，ps531/ps652，对应于seq id no：137/seq id no：185)。为了确定aon的血浆曲线，在用于动物的下列时间上：给药之后15min、1h、2h、6h和24小时，从2个动物/时间点(每aon组)获得血浆样品。为了获得血浆，将静脉全血采集到li-肝素管内、离心并保持在-80℃，直到分析。对于分布分析，在动物的牺牲(sacrifice)上收获7种器官(心脏、肾脏皮质、肝脏、隔膜、腓肠肌、四头肌&三头肌)。将组织快速冷冻并存储在-80℃，直到分析。
[0800]
aon杂交试验
[0801]
为了确定血浆和组织中的aon(ps229l/ps524，对应于seq id no：91/seq id no：92，ps531/ps652，对应于seq id no：137/seq id no：185)的浓度，使用aon杂交试验，其以yu等人，2002描述的试验为基础。关于组织分布分析，在含有2mg/ml蛋白酶k的protk缓冲液(100mmol/l tris-hcl ph8.5，200mmol/l nacl，5mmol/l edta，0.2％sds)中，使用magnalyzer(roche)，使组织均匀化为60mg/ml的浓度，随后是在55℃的旋转杂交炉中2小时孵育(肝脏)或4小时孵育(所有其他器官)并且然后存储在-20℃，直到使用。在60倍稀释汇集(pool)的mdx对照组织匀浆(肾脏、肝脏、几个肌肉组)中稀释所有的组织匀浆和校正曲线(调整到试验的标准)。对每一个aon特异的模板探针(5
’
gaatagacg-反-aon-生物素3
’
，dna磷酸盐缓冲液)和连接探针(p-cgtctattc-dig dna磷酸酯寡核苷酸)用于杂交试验。用模板探针(50nmol/l)，在37℃孵育匀浆1h并将杂交的样品转移到链霉亲和素涂覆的96-孔板上，并且在37℃孵育30min。随后，洗涤平板4次并添加地高辛-标记的连接剂(2nmol/l)并在环境温度下孵育30min。用抗-dig-pod(1∶7,500-1∶30,000；roche diagnostics)检测dig-标签，用3，3
′
，5，5
′-
四甲基联苯胺基质(sigma aldrich，荷兰)使其可视化，并用酸溶液(sigma aldrich)终止反应。使用biotek synergy ht读板仪(beun de ronde，abcoude，荷兰)测量450nm的吸收。使用100倍稀释汇集的mdx血浆，根据相同的方案分析血浆样品。
[0802]
全血细胞因子释放试验
[0803]
为了检测由选定的aon(ps232/ps648，对应于seq id no：119/seq id no：201，ps534/ps653，对应于seq id no：139/seq id no：192)诱导的可能的细胞因子刺激，使用来自健康的人类志愿者的全血。将不同的aon浓度(范围从0至50μg/ml，以大约1∶0.01(v/v)的稀释)加入到血液中，并且在5％co
2
气氛下，在37℃孵育样品4小时。在孵育之后，在4℃，在3200xg下离心样品15分钟，并采集血浆上清液并存储在-20℃，直到细胞因子量化。由夹心elisa(人类mcp-1、il-6、tnf-α、ip-10elisa试剂盒(r&d systems))确定mcp-1、il-6、tnf-α和ip-10浓度。用人全血的实验重复三到四次。图3a至图3h只以一个实验为基础，但是认为是代表性的。
[0804]
结果
[0805]
在体外，培养的、分化的、健康的肌肉细胞中，测试用5-甲基胞嘧啶(m5c)代替所有的胞嘧啶对aon活性(即，诱导外显子跳读效力)的影响。在图1a和图1b中，示出两个样品。当在使用0-100-200-400nm的剂量响应(dose-response)转染实验中比较ps229l和ps524(＝ps229l-m5c)时(即，未修饰的序列seq id no：91与其中修饰了所有的胞嘧啶的修饰的序列seq id no：92比较)，在200和400nm，ps524明显地比ps229l有效(1.9倍更高的外显子53跳
读水平)(图1a)。同样地，当在使用0-50-100-200-400-800nm的剂量响应转染实验中比较ps220和ps399(＝ps220-m5c)时(即，未修饰的序列seq id no：101与其中修饰了所有的胞嘧啶的修饰的序列seq id no：200比较)，ps399明显地比ps220更加有效，特别是在较低的浓度(在50nm最高达10倍更高的外显子45跳读水平)(图1b)。这些结果证明，5-甲基胞嘧啶的存在对aon的活性具有积极的影响。当与未修饰的配对物寡核苷酸ps229l(seq id no：91)比较时，在用5-甲基胞嘧啶(m5c)代替所有的6个胞嘧啶的ps524(seq id no：92)中，其对外显子跳读活性具有积极的影响(图1a)。为了测试这样积极影响是否可以与包含的碱基修饰的数量或百分数相关，在体外，在培养的、分化的、健康肌肉细胞中，测试了分别地具有用5-甲基胞嘧啶代替的6个胞嘧啶中的4、2和3个的ps1317、ps1318和ps1319，并且直接地与ps524比较。ps1317、ps1318和ps1319都在诱导外显子53跳读中起作用(分别地47％、37％和45％)(图1c)。然而，当与用ps524获得的水平比较时(64％)，这些结果的确表明，减少的5-甲基胞嘧啶(m5c)的数目，从6至4、3或2个5-甲基胞嘧啶，导致对aon的外显子跳读活性的减少的积极影响。
[0806]
为了研究5-甲基胞嘧啶是否影响生物稳定性、生物分布和/或生物用度，在野生型(对照)和mdx小鼠中进行药代动力学研究。用于dmd的mdx小鼠模型在外显子23中具有天生的无义突变，并因此，是肌养蛋白缺陷的。细胞膜上缺少肌养蛋白增加肌肉纤维对相对小分子如aon的渗透性，并且确实证明将由肌肉摄取的2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna aon增强了最高达10-倍(heemskerk等人，2010)。用100mg/kg的含有5-甲基胞嘧啶的aon(ps524，ps652，对应于seq id no：92，seq id no：185)或具有未修饰的胞嘧啶的它们的相对物(ps229l，ps531，对应于seq id no：91，seq id no：137)皮下注射小鼠，每周三次，持续两周。在最后注射后的不同的时间点(1、7、14天)处死小鼠并分离不同的肌肉组(心脏、隔膜、腓肠肌、四头肌和三头肌)以及肝脏和肾脏以确定其中的aon浓度(图2a)。如预期的，对于所有的化合物，mdx肌肉中的浓度(所有样品的平均)比对照小鼠中的那些高。对于具有5-甲基胞嘧啶的aon，显示mdx与对照aon水平的比率相对更高。更具体地，在mdx小鼠中，ps524和ps652的水平比ps229l和ps531的水平高2至3倍(图2a)。当监测肾脏和肝脏中的aon的水平时(已知的毒性器官)，肌肉组织和毒性组织之间的比率保持相似，或对ps524甚至有利。这些结果表明，具有5-甲基胞嘧啶的aon比具有未修饰的胞嘧啶的aon的吸收更好或在肌肉组织中更稳定。甚至，当与ps229l(7天)和ps531(10天)比较时，肌肉中的半衰期更长，ps524(＞20天)和ps625(25天)。在血浆中，注射的aon的cmax值相似，其证明，小鼠接受相等的剂量(图2b)。显著地，对于含有5-甲基胞嘧啶的aon，auc值(作为用于生物用度的指示)是1.5至2.3倍更高。这与较低的清除相关，其支撑它们的更高的肌肉组织水平。因此，由该药代动力学的结果证明，5-甲基胞嘧啶的存在对aon的生物稳定性、生物分布和/或生物用度具有积极影响，而肌肉/毒性器官比率与具有未修饰的胞嘧啶的aon的那些相似。
[0807]
将具有5-甲基胞嘧啶的aon(对应于seq id no：201，192的ps648、ps653)的体外安全曲线与具有未修饰的胞嘧啶的aon的那个比较(ps232、ps534，对应于seq id no：119，seq id no：139)。aon可以通过激活toll-样受体(包括tlr7、tlr8、tlr9)刺激先天性免疫应答，其引起包括先天性免疫在内的一系列协同的免疫应答。几个化学因子和细胞因子，如ip-10、tnfα、il-6和mcp-1在这个过程中起作用，因此，在用0至50μg/ml的每一种aon孵育的人全血中(用市售elisa试剂盒)监测。ps232和ps534都具有未修饰的胞嘧啶并且以增加的剂
量上诱导tnf-α(图3a，图3b)、mcp-1(图3c，图3d)、ip-10(图3e，图3f)和il-6(图3g，图3h)的释放。相反，ps648和ps653(具有5-甲基胞嘧啶)对tnf-α、ip-10和il-6不具有任何影响。ps653而不是ps648似乎只诱导mcp-1的少量释放。结论是，5-甲基胞嘧啶的存在在体外改善这些aon的安全曲线。
[0808]
实施例2
[0809]
材料和方法
[0810]
aon
[0811]
所有的寡核苷酸(ps43/ps559/ps1106，所有的都基于seq id no：31，和对应于seq id no：111(ps43)未修饰的序列，seq id no：202，其中修饰了所有的尿嘧啶(ps559)；和seq id no：203(ps1106)，其中修饰了所有的尿嘧啶和所有的胞嘧啶；ps188/ps785/ps1107，所有的都seq id no：15，并且对应于seq id no：95(ps188)，未修饰的序列，seq id no：204(ps785)其中修饰了所有的尿嘧啶，和seq id no：205(ps1107)，其中修饰了所有的尿嘧啶和所有的胞嘧啶；ps235/ps786，两者都基于seq id no：40，并且对应于seq id no：120(ps235)，未修饰的序列，和seq id no：172(ps786)，其中修饰了所有的尿嘧啶；和ps49(seq id no：216)，未修饰的序列，和ps959(seq id no：214)其中修饰了所有的胞嘧啶)都是2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna，并且通过标准的亚磷酰胺方案，使用op-10合成器(oligopilot)合成，或以200nmol-286.1g规模，从商业供应商获得。在两个步骤序列中切割prosensa-合成的寡核苷酸并去保护(diea，之后浓缩nh
4
oh处理)，由hplc纯化并且溶解在水中和添加过量的nacl，以交换离子。在蒸发之后，将化合物再次溶解在水中，由fplc脱盐或超滤并冻干。质谱证实发现所有的化合物和纯度(由uplc确定)的特性(identity)对于所有化合物来说是可接受的(＞75-80％)；从商业来源获得的化合物如接收时状态使用：ps188(girindus，286.1g获得的产物，纯度93％)、ps785，ps786，ps1106和ps1107(chemgenes，200nmol合成规模，如接收时状态使用)、ps43(prosensa，1μmol合成规模，纯度90％)、ps559(chemgenes，1μmol合成规模，纯度93％)、ps235(prosensa，1.92mmol合成规模，纯度91％)。对于本文所描述的体外转染实验，在20mm磷酸盐缓冲液(ph7.0)中制备aon的50μm工作液。
[0812]
转染和rt-pcr分析
[0813]
根据非glp标准操作程序，用200nm的固定的aon浓度在6-孔板中转染分化的人健康对照肌肉细胞(肌管)。对于转染，使用聚乙烯亚胺(exgen500，fermentas)(2μl每μg aon，在0.15m nacl中)。从先前报告的材料和方法(aartsma-rus等人，2003)改编上述的转染程序。在转染之后的24hrs，分离rna并且通过rt-pcr分析。简单地说，为了产生肌养蛋白特异的cdna，对1000ng输入rna上，在逆转录酶(rt)反应中使用外显子53(ps43/ps559/ps1106，seq id no：111，seq id no：202，seq id no：203)、外显子46(ps188/ps785/ps1107，seq id no：95，seq id no：204，seq id no：205)或外显子54(ps235/ps786，seq id no：120，seq id no：172)中的dmd基因特异反向引物。随后，为每一个样品，在3μl肌养蛋白cdna上完成pcr分析，并且包括在外显子侧翼外显子51(ps43/ps559/ps1106)、外显子44(ps188/ps785/ps1107)或52(ps235/ps786)中，使用dmd基因特异引物的第一pcr和巢式pcr。根据描述的非glp标准操作程序(aartsma-rus等人，hum mol genet 2003；12(8)：907-14)进行rna分离和rt-pcr分析。通过凝胶电泳(2％琼脂糖凝胶)分析rt-pcr产物。通过dna lab-on-a-chip分
析(agilent)量化产生的rt-pcr片段。通过“agilent 2100 bioanalyzer”软件和excel 2007处理数据。评估较小的转录本产物(含有外显子51(ps43/ps559/ps1106)、外显子44(ps188/ps785/ps1107)或外显子52跳读(ps235/ps786))与转录本产物的总量的比率(以百分数表示外显子51、44或52跳读效率)并且直接地与非转染的细胞中的比较。
[0814]
体内给予和rt-pcr
[0815]
由当地lumc动物道德委员会(dec号11145)批准用mdx小鼠模型(c57bl/10scsn-mdx/j；charles river实验室)的实验。用异氟烷麻醉每组两只mdx小鼠，和然后在两个连续日中，用在无菌的生理盐水中稀释为50μl的总体积/次注射的20ug ps49(seq id no：216)or ps959(seq id no：214)肌肉注射两个腓肠肌。在最后注射之后1周，通过断颈处死动物，并分离肌肉并快速冷冻在magnalyzer greenbead管中(roche)。将六百μl tripure(roche)加入到管中，并且用研磨珠均质器(bulletblender)机器，3 x 1min速度10使肌肉均质化。将裂解物转移到添加有120μl氯仿的干净的管中。剧烈地摇晃样品，在冰上孵育5分钟，然后在4℃以最大转速离心15分钟。将上清液转移到另一个管中并添加1体积的异丙醇。混合样品并在4℃孵育至少30分钟。然后，在4℃以最大转速将样品离心15分钟，用70％乙醇洗涤，之后是在4℃以最大转速的10分钟的第二次离心。风干rna沉淀并且将其溶解在depc处理过的水中。根据制造商的指示，使用transcriptor逆转录酶(rt)(roche diagnostics)，用随机六聚物引物使用400ng总rna产生cdna。使用小鼠外显子22和外显子24特异性引物，使用1.5μl cdna作为模板，在50μl反应中，94℃持续30s，60℃持续30s和72℃持续30s的30个循环进行pcr。在2％琼脂糖凝胶上可视化pcr产物，agilent 2100 bioanalyzer量化(agilent，santa clara，ca，usa)。
[0816]
结果
[0817]
在体外，在培养的、分化的、健康的肌肉细胞中，首先以固定的200nm aon浓度测试用5-甲基胞嘧啶代替所有的未修饰的胞嘧啶和用5-甲基尿嘧啶代替的所有的未修饰的尿嘧啶(如在ps1106，ps1107、seq id no：203，seq id no：205中)和只用5-甲基尿嘧啶代替所有的未修饰的尿嘧啶(如在ps559、ps785、ps786，seq id no：202、seq id no：204、seq id no：172中)对aon活性(即，诱导外显子跳读效率)的影响(图4a)。当与具有未修饰的尿嘧啶的它们的相对物比较时，具有5-甲基尿嘧啶(ps559、ps785和ps786)的aon增加外显子跳读效率1.3倍至3倍。当也由5-甲基胞嘧啶代替未修饰的胞嘧啶时，跳读水平进一步增加(ps1106对ps559，seq id no：203对seq id no：202)或相似(ps1107对ps785，seq id no：205对seq id no：204)。也在mdx小鼠模型的肌肉中测试了用5-甲基尿嘧啶(如在ps959；seq id no：214)代替所有未修饰的尿嘧啶(如在ps49中，seq id no：216)对aon活性(即，诱导外显子跳读效率)的影响。当与具有未修饰的尿嘧啶(n＝4每aon)比较时，具有所有的5-甲基尿嘧啶的ps959增加大约3倍的外显子23跳读效率(图4b)。这些结果证明，在体内和体外，不仅5-甲基胞嘧啶对外显子跳读活性具有积极影响(如在图1a至图1c中显示的)，而且，5-甲基尿嘧啶也具有积极影响。另外，这些5-甲基嘧啶的组合使用甚至可进一步增加活性。
[0818]
实施例3
[0819]
材料和方法
[0820]
aon
[0821]
所有的寡核苷酸(ps43/ps403，基于seq id no：31，和对应于用于未修饰的序列的
seq id no：111(ps43)，和对应于seq id no：206，其中修饰了所有的腺嘌呤(ps403)；ps188/ps733，基于seq id no：15，和对应于未修饰的序列的seq id no：95(ps188)，和对应于seq id no：207(ps733)其中修饰了所有的腺嘌呤；ps235/ps897，基于seq id no：40，和对应于seq id no：120(ps235)，未修饰的，和对应于seq id no：173(ps897)，其中修饰了所有的腺嘌呤)都是2
’-
o-甲基硫代磷酸酯rna，并且通过标准的亚磷酰胺方案，使用op-10合成器(oligopilot)合成，或以200nmol-151g规模，从商业供应商获得。在两个步骤序列中切割prosensa-合成的寡核苷酸并去保护(diea，之后浓缩nh
4
oh处理)，通过hplc纯化并且溶解在水中并添加过量的nacl以交换离子。在蒸发之后，将化合物再次溶解在水中，通过fplc脱盐或超滤和冻干。质谱证实发现所有的化合物和纯度(由uplc确定)的特性对于所有化合物来说是可接受的(＞75-80％)；从商业来源获得的化合物如接收时状态使用：ps188(girindus，151g获得的产物，纯度92％)、ps733(trilink或chemgenes，200nmol/1mg合成规模，如接收时状态使用)、ps43(prosensa，10μmol合成规模，纯度86％)、ps403(chemgenes，1μmol合成规模，如接收时状态使用)、ps235(prosensa，1.92mmol合成规模，纯度91％)、ps897(chemgenes，200nmol合成规模，如接收时状态使用)。对于本文所描述的体外转染实验，在20mm磷酸盐缓冲液(ph7.0)中制备aon的50μm工作液。对于本文所描述的体外补体激活实验，在20mm磷酸盐缓冲液(ph7.0)中制备ps188和ps733的3mg/ml储备溶液。
[0822]
转染和rt-pcr分析
[0823]
根据非glp标准操作程序，以200nm的固定的aon浓度在6-孔板中转染分化的人健康对照肌肉细胞(肌管)。对于转染，使用聚乙烯亚胺(exgen500，fermentas)(2μl每μg aon，在0.15m nacl中)。从先前报告的材料和方法(aartsma-rus等人，2003)改编上述的转染程序。在转染之后的24hr，分离rna并通过rt-pcr分析。简单地说，为了形成肌养蛋白特异的cdna，对1000ng输入rna，在逆转录酶(rt)反应中使用外显子53(ps43/ps403，seq id no：111/seq id no：206)、外显子46(ps188/ps733，seq id no：95/seq id no：207)或外显子54(ps235/ps897，seq id no：120/seq id no：173)中的dmd基因特异反向引物。随后，为每一个样品，在3μl的肌养蛋白cdna上完成pcr分析，并且包含在外显子侧翼外显子51(ps43/ps403)、外显子44(ps188/ps733)或52(ps235/ps897)中使用dmd基因特异引物的第一pcr和巢式pcr。根据描述的非glp标准操作程序(aartsma-rus等人，hum mol genet 2003；12(8)：907-14)进行rna分离和rt-pcr分析。通过凝胶电泳分析(2％琼脂糖凝胶)分析rt-pcr产物。通过dna lab-on-a-chip(agilent)分析量化产生的rt-pcr片段。通过“agilent 2100 bioanalyzer”软件和excel 2007处理数据。评估较小的转录本产物(含有外显子51(ps43/ps403)、外显子44(ps188/ps733)或外显子52跳读(ps235/ps897))与转录本产物的总量的比率(以百分数表示外显子51、44或52跳读效率)并且直接地与非转染的细胞中的比较。
[0824]
补体激活实验
[0825]
反义寡核苷酸可激活可替代的互补途径，其含有几个剪接因子，如c3a和因子bb(后者对于可替代的途径是独特的)。在来自食蟹猴(cynomolgus)的血浆中(lihe plasma，cit，france)评估aon可能激活互补途径能力。将以1∶10稀释(v/v)，增加浓度(从0至300μg/ml)的ps188(seq id no：95)和ps733(ps207)添加到血浆中并且在37℃孵育30min。由将样品转移到冰上终止反应，并在冰冷稀释剂中制备稀释物。由elisa(quidel，san diego，ca)确定bb和c3a浓度。
[0826]
结果
[0827]
在体外，在培养的、分化的健康肌肉细胞中，以固定的aon浓度(200nm)，检测用2，6-二氨基嘌呤代替所有未修饰的腺嘌呤对aon活性的作用(即，诱导外显子跳读效率)。在图5a中显示三个不同的aon序列的实施例。当与具有未修饰的腺嘌呤的它们的相对物比较时(与seq id no：111，95，120比较)，具有2，6-二氨基嘌呤(ps403，ps897，和ps733，seq id no：206，seq id no：207，seq id no：173)的aon增加外显子跳读效率2至4倍。似乎与每一个aon中的2，6-二氨基嘌呤的数目相关。
[0828]
在猴子血浆中检测用2，6-二氨基嘌呤(如在ps733中；seq id no：207)代替所有的未修饰的腺嘌呤(如在ps188中；seq id no：95)对体外安全(即，可能激活可替代的互补途径)的影响。然而，ps188诱导剪接因子bb和c3a的相对高水平，ps733中的2，6-二氨基嘌呤完全地破坏对可替代地途径的影响，显示bb或c3a水平没有增加(图5b)。因此，2，6-二氨基嘌呤的存在似乎在体外改善ps188的安全曲线。
[0829]
这些结果证明2，6-二氨基嘌呤对外显子跳读活性和aon的安全的积极影响。
[0830]
参考文献目录
[0831]
van ommen，van deutekom，aartsma-rus，curr opin mol ther.2008；10(2)：140-9.
[0832]
yokota，duddy，partidge，acta myol.2007；26(3)：179-84.
[0833]
van deutekom et al.，n engl j med.2007；357(26)：2677-86.
[0834]
goemans et al.，n engl j med.2011；364(16)：1513-22.
[0835]
cirak et al.，lancet 2011；378：595-605.
[0836]
heemskerk et al.，mol ther 2010；18(6)：1210-7.
[0837]
aartsma-rus et al.，hum mol gen 2003；12(8)：907-14.
[0838]
yu rz.，anal biochem 2002；304：19-25.
[0839]
krieg am.et al.，nature 1995；374：546-549.
[0840]
diebold s.s.，et.al.，eur j immunol.2006；dec；36(12)：3256-67.
[0841]
krieg，a.m.，curr.opin.immunol.2000；12：35-43.
[0842]
wagner，h.，adv.immunol.1999；73：329-368.
[0843]
popovic pj.et al.j of immunol 2006；177：8701-8707.
[0844]
peacock h et al.j.am.chem.soc.2011，133，9200
[0845]
arai k et al.bioorg.med.chem.2011，21，6285
[0846]
ehmsen j.et al，j.cell sci.2002，115(ptl4)：2801-2803.
[0847]
monaco a.p.，et al.，genomics 1988；2：90-95.
[0848]
manzur a.y.et al.，wiley publishers，2008.the cochrane collaboration.
[0849]
hodgetts s.，et al，neuromuscular disorders 2006；16：591-602.
[0850]
aartsma-rus et al，oligonucleotides 2010，20(2)：69-77
[0851]
zuker m.，et al，nucleic acids res.2003；31(13)：3406-15.
[0852]
cartegni l，et al，nat rev genet 2002；3(4)：285-98.
[0853]
cartegni l，et al，nucleic acids res 2003；31(13)：3568-71
[0854]
remington：the science and practice of pharmacy，20th edition.
[0855]
baltimore，md：lippincott williams&wilkins，2000
[0856]
kumar l，pharm.technol.2008，3，128
[0857]
bruno，k.，advanced drug delivery reviews 2011；63：1210.
[0858]
hari et al.org.biomol.chem.2012，10，9639)；
[0859]
hanessian et al.angew.chem.intl ed.2012，45，11242。

起点商标作为专业知识产权交易平台，可以帮助大家解决很多问题，如果大家想要了解更多知产交易信息请点击 【在线咨询】或添加微信 【19522093243】与客服一对一沟通，为大家解决相关问题。

此文章来源于网络,如有侵权,请联系删除