一种非洲猪瘟病毒点亮RNA探针检测试剂盒及其制备方法和应用与流程

一种非洲猪瘟病毒点亮rna探针检测试剂盒及其制备方法和应用
技术领域
[0001]
本发明属于食品生物技术领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒点亮rna探针检测试剂盒及其制备方法和应用。


背景技术：

[0002]
非洲猪瘟(asf)，是一种急性、发热传染性很高的滤过性病毒所引起的猪烈性传染病。asf发病过程短，其中急性感染死亡率高达100%。临床表现为发热，心跳加快，呼吸困难等症状。asf自1909年在肯尼亚首次报道后相继在全球多个国家发生、扩散和流行。截止目前，尚未有治疗asf的特效方法。我国对非洲猪瘟疫情所采取的措施主要以预防和控制为主。因此，对肉质食品和临床疑似病毒的检测鉴别，能够为及早发现和控制非洲猪瘟提供病原学依据。随着分子生物学技术的发展，不同的技术手段已被开发用于asf病毒的检测。常用的分子生物学技术如聚合酶链式反应(pcr，多重pcr，实时荧光定量pcr)、恒温基因扩增技术 (环介导恒温扩增(lamp)、依赖核酸序列的扩增 (nasba))等虽然具有特异性强、操作简便、检测量大、判断直观等优势。但同时缺点也较明显，如成本较高、引物设计存在限制、灵敏度不够高等。因此，一种快速、低廉、高精度的检测手段亟待开发。
[0003]
核酸适配体技术最初主要用于活细胞成像和定位。核酸适配体具有稳定的二级结构，是一种能够和靶标分子特异性结合的人工合成核酸片段，它可以是dna也可以是rna，长度一般为25到60个核苷酸。基于发光效应的rna适配体探针检测技术具有特异性好，灵敏度高，成本低且检测方法操作简便等优点。然而，目前国内尚未有非洲猪瘟病毒检测用的rna探针试剂盒。


技术实现要素：

[0004]
针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种非洲猪瘟病毒点亮rna探针检测试剂盒及其制备方法和应用。本发明根据非洲猪瘟病毒编码p54蛋白的核酸序列，设计了一种检测非洲猪瘟病毒的点亮rna探针，利用所述rna探针能够快速、方便、高效地鉴定非洲猪瘟病毒，特异性好，灵敏度高，且检测方法操作简便高效。
[0005]
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种非洲猪瘟病毒点亮rna探针seq-lighting，其特征在于该探针的核苷酸序列如seq id no.1所示。
[0006]
所述的一种非洲猪瘟病毒点亮rna探针seq-lighting，其特征在于该探针与非洲猪瘟病毒核酸序列p54的部分特异序列seq-p54特异结合，所述seq-p54的核苷酸序列如seq id no.2所示。
[0007]
所述的探针seq-lighting在制备用于非洲猪瘟病毒检测试剂盒中的应用。
[0008]
一种非洲猪瘟病毒点亮rna探针检测试剂盒，其特征在于包括检测滤纸片、p54部分特异序列seq-p54和depc-水溶液，所述检测滤纸片由9μl点亮rna探针seq-lighting、64μ
l无细胞体外转录体系、1μl20
ꢀµ
m dfhbi、缓冲液10μl 140mm kcl、10μl 1mm mgcl
2
、10μl 10mm nah
2
po
4
、ph7.0滴加吸附在直径2mm的无菌滤纸片上，冷冻干燥后制得。
[0009]
一种非洲猪瘟病毒点亮rna探针检测试剂盒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）制备点亮rna探针seq-lighting：从p54基因序列选取长度22bp的碱基，与spinach中形成茎环结构的长度为54bp的碱基进行组合构建成rna探针，对rna探针进行全合成并构建rna探针质粒puc-rna probe，转化大肠杆菌dh5a获得工程菌并培养，提取puc-rna probe质粒，采用限制性核酸内切酶ndeι进行线性化处理，获得rna 探针的cdna，进行体外转录，纯化浓缩后得到点亮rna探针seq-lighting，置于-80℃冰箱保存，备用；（2）将步骤（1）得到的点亮rna探针seq-lighting 9μl、64μl无细胞体外转录体系、1μl20
ꢀµ
mdfhbi、缓冲液10μl140mm kcl、10μl1mm mgcl
2
、10μl10mm nah
2
po
4
、、ph7.0滴加吸附在直径2mm的无菌滤纸片上，冷冻干燥后制得检测滤纸片，密封保存，所述无细胞体外转录体系包括转录酶系、ntp buffer mix、100mm蔗糖；（3）p54部分特异序列seq-p54；（4）步骤（2）得到的检测滤纸片、p54部分特异序列seq-p54与depc-水溶液构成检测试剂盒。
[0010]
所述的一种非洲猪瘟病毒点亮rna探针检测试剂盒的制备方法，其特征在于所述步骤（1）中大肠杆菌工程菌培养具体为：（a）配置lb液体培养基，包括nacl 10 g/l，蛋白胨10 g/l，酵母浸出粉5 g/l，ph 6.8；（b）在培养基中加入终浓度为40
ꢀµ
g/ml的卡那抗生素，之后以接种比例1%接入含有puc-rna probe质粒的大肠杆菌工程菌；（c）于37
°
c，200 rpm的条件下培养14 h。
[0011]
所述的一种非洲猪瘟病毒点亮rna探针检测试剂盒的制备方法，其特征在于所述步骤（1）中puc-rna probe质粒线性化处理具体为：处理体系由15μlpuc-rna probe质粒，2.5 μl10
×
buffer，1μl酶，6.5 μl ddh
2
o组成，处理条件为37
°
c 4 h，酶切后的产物使用san prep柱式pcr产物纯化试剂盒进行纯化回收。
[0012]
所述的一种非洲猪瘟病毒点亮rna探针检测试剂盒的制备方法，其特征在于所述步骤（1）中rna探针体外转录具体为：体系为30
µ
l，包含ntp buffer mix 10
µ
l，t7 rna polymerase mix 2
µ
l，rna 探针的cdna11
µ
l 或1
ꢀµ
g，depc-水7
ꢀµ
l，反应条件为37
°
c16h。
[0013]
一种非洲猪瘟病毒点亮rna探针检测试剂盒的使用方法，其特征在于包括以下步骤：（1）按照地标db21/t 3256-2020利用样品处理剂提取样品中的dna；（2）将步骤（1）提取的dna和p54部分特异序列seq-p54分别滴加在检测滤纸片上，同时利用depc-水补齐至100μl，避光，37℃下保温150 min；（3）在激发波长为460 nm，发射波长为502 nm的条件下进行测定荧光值。
[0014]
所述的非洲猪瘟病毒点亮rna探针检测试剂盒在非洲猪瘟病毒检测上的应用。
[0015]
上述检测方法在检测鉴定猪病样组织中是否含有非洲猪瘟病毒方面的应用，或在检测鉴定非洲猪瘟病毒方面的应用均在本发明保护范围内。
[0016]
本发明点亮rna探针亲和性强，可以和待测样品中的p54 rna特异性结合，形成稳定的二级结构，此二级结构能特异性与荧光染料结合，产生荧光。本发明试剂盒检测相对于
其他猪瘟病毒检测方法来说，整个检测过程耗时短，成本低，便于食品检测和临床检测，具有较大的应用前景。且能够在离体无活细胞和无活病毒的体系中对非洲猪瘟实现快速安全的检测。本发明的检测方法特异性好，灵敏度高，能够方便、快速、高效的鉴定非洲猪瘟病毒，且操作简便，高效，便于临床检测和食品检测，具有较大的应用前景。
附图说明
[0017]
图1为软件预测的p54基因特异序列与点亮rna探针结合后的二级结构；图2为rna探针与p54片段特异性结合的荧光检测结果图；图3为rna探针抗干扰实验的荧光检测结果图。
具体实施方式
[0018]
下述实施例中的方法，若无特别说明，均为常规方法；所用试剂，若无特别说明，均为市场购买而得。以下实施方法仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0019]
实施例1：点亮rna探针的制备从p54基因序列选取长度为22bp的碱基，与spinach中可以形成茎环结构的长度为54bp的碱基进行组合构建成rna探针，并利用nupack软件模拟rna探针与p54特异序列结合后的二级结构，并筛选出能够与p54特异序列形成茎环结构的rna探针，最终结果见图1。
[0020]
将确定的rna探针进行全合成并构建rna探针质粒puc-rna probe。转化大肠杆菌dh5a获得工程菌。大肠杆菌工程菌培养步骤如下：（1）配置lb液体培养基(nacl 10 g/l，蛋白胨10 g/l，酵母浸出粉5 g/l，ph 6.8)；（2）在培养基中加入终浓度为40
ꢀµ
g/ml的卡那抗生素，之后以接种比例1%接入含有puc-rna probe质粒大肠杆菌工程菌；（3）于37
°
c，200 rpm的条件下培养14 h。
[0021]
puc-rna probe质粒提取过程参照sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒(上海生工生物股份有限公司)所提供的方法进行。
[0022]
提取的puc-rna probe质粒采用限制性核酸内切酶ndeι进行线性化处理，处理体系由15 μl质粒，2.5 μl10
×
buffer，1μl酶，6.5 μl ddh
2
o组成。处理条件为37
°
c 4 h。酶切后的产物使用san prep柱式pcr产物纯化试剂盒进行纯化回收，获得rna 探针的cdna。
[0023]
rna探针体外转录获得。rna探针体外转录的体系为30
µ
l包含ntp buffer mix 10
µ
l，t7 rna polymerase mix 2
µ
l，rna 探针的cdna11
µ
l (1
ꢀµ
g)，depc-水7
ꢀµ
l。反应条件为37
°
c16h。所需体外转录试剂盒购于neb。所获rna采用柱式rna快速浓缩纯化试剂盒(上海生工生物股份有限公司)进行纯化和浓缩后置于-80
°
c冰箱保存。
[0024]
实施例2：快速检测试剂盒制备快速检测试剂盒制备过程中使用的试剂配制如下：（1）利用depc-水配置反应缓冲液：140 mm kcl，1 mm mgcl
2
以及10 mm nah
2
po
4
。（2）利用dmso配置20
ꢀµ
m dfhbi，配置好后避光保存；（3）无细胞体外转录体系（包括但不限于转录酶系、ntp buffer mix）；（4）利用depc-水配置100mm蔗糖。
[0025]
在2mm的无菌滤纸片上滴加9μl实施例1中制备好的rna探针；滴加10μl的140 mm kcl，10μl的1 mm mgcl
2
以及10μl的10 mm nah
2
po
4
；滴加4μl的转录酶系，50μlntp buffer mix；滴加10μl100mm蔗糖；滴加1μl20
ꢀµ
m dfhbi。将上述无菌滤纸片进行冷冻干燥，冷冻干
燥后制得检测滤纸片，密封避光保存。
[0026]
实施例1得到的检测滤纸片、p54部分特异序列seq-p54与depc-水溶液构成检测试剂盒。
[0027]
实施例3：非洲猪瘟病毒p54基因特异序列的检测将实施例1中确定的p54特异序列全合成，得到了含有质粒puc-p54的大肠杆菌。大肠杆菌的培养及质粒提取过程参考实施例1。提取的puc-p54质粒采用限制性核酸内切酶pstι进行线性化处理，处理体系、处理条件及纯化过程参考实施例1。将得到线性puc-p54质粒测定浓度。在检测滤纸片上添加7μlpuc-p54（100nm），并添加93μldepc-水。避光，37℃下保温150min。利用酶标仪在37℃，激发波长为460 nm；发射波长为502 nm的条件下进行测定，测定45min，每隔一分钟测定荧光值。结果显示，与仅含有检测滤纸片的样品相比，p54的加入明显提高了溶液的荧光值，如图2。
[0028]
实施例4：点亮rna探针抗干扰能力采用大肠杆菌以及单增李斯特菌的dna作为阴性对照。大肠杆菌和单增李斯特菌的培养采用lb培养基，收集对数期的细胞进行dna提取。dna的提取过程参照细菌基因组快速抽提试剂盒(宝日医生物技术有限公司)所提供的方法进行。dna提取后测定浓度并于-20
°
c保存备用。检测步骤参照上述实施例3进行，其中添加8μl大肠杆菌dna和6.5μl单增李斯特菌dna，分别添加85μl和86.5μl depc-水。避光，37℃下保温150min。
[0029]
测定过程参考实施例3。测定结果显示，rna探针结合大肠杆菌rna或单增李斯特菌rna的可能性较小，如图3。反应体系中大肠杆菌rna以及单增李斯特菌rna单独存在或同时存在不会对p54基因的检测产生明显干扰。因此，本发明所设计的针对非洲猪瘟病毒p54基因的rna探针结构具备良好的抗干扰性能。

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