一种西曲瑞克的转盐方法与流程

一种西曲瑞克的转盐方法
一、技术领域：
[0001]
本发明属于生物药品制备方法技术领域，特别是涉及一种西曲瑞克的转盐方法。
二、

背景技术：
：
[0002]
西曲瑞克(cetrorelix)是一种合成的10肽，是一种黄体激素释放激素(lhrh)拮抗剂。lhrh可与垂体细胞的膜受体结合。西曲瑞克与内源性lhrh竞争性的结合这些受体，从而控制促性腺激素的分泌。它能控制卵巢的刺激作用，预防不成熟卵泡过早排出，帮助受孕。并可用于治疗乳腺癌和宫颈癌、子宫内膜异位症、性早熟、子宫肌瘤、卵巢雄激素过多和经前综合征。
[0003]
西曲瑞克氨基酸序列：
[0004]
ac-d-2-nal-d-4-cpa-d-3-pal-ser-tyre-d-cit-leu-arg-pro-d-ala-nh2
[0005]
目前，关于西曲瑞克的分离纯化方法也有相关文献公开报道。例如：1、cn 201711299105.1的发明专利申请，公开了一种采用醋酸根型的阴离子交换树脂和反相高效液相色谱的纯化工艺。2、cn 201710468205.6的发明专利申请，公开了一种运用磷酸二氢钠水溶液和乙腈溶液进行纯化的方法。专利cn200810043454.1采用磷酸盐或tfa盐作为流动相。3、cn 200910134943.2的发明专利申请，公开了一种采用c18制备柱进行纯化的方法，其中流动相为1％tfa/h20溶液和甲醇，5％甲醇-100％甲醇。4、cn 201310305700.7的发明专利申请，公开了一种采用c18制备柱进行纯化的方法，采用的流动相为a(0.1％乙酸/水k)/b(0.1％乙酸/乙腈)。5、cn 201510083267.6的发明专利申请，公开的技术方案中采用的流动相a为纯乙腈或甲醇，b相为0.01～10％v/v的三氟醋酸的水溶液或磷酸的水溶液。6、cn 201611265510.7的发明专利申请公开的技术方案中，采用制备柱填料为碳载硅胶类型，流动相为含0.1％tfa的水、含0.1％tfa的乙腈和含0.1％tfa的甲醇中的一种或几种。7、cn 201711231965.1的发明专利申请公开的技术方案中，采用1％的醋酸水溶液(a相)和乙睛(b相)作为流动相。另外，中国药物化学杂志第20卷第1期2010年2月报道西曲瑞克的固相合成中，洗脱剂为含0.09％tfa乙腈-0.1％tfa水溶液系统。以上专利文献显示，西曲瑞克的纯化过程都采用了色谱纯化系统，而使用色谱系统进行纯化，收集的西曲瑞克洗脱液含有大量流动相，西曲瑞克浓度低，不利于进一步的纯化或转盐。因此，采用色谱系统纯化西曲瑞克过程中不可避免地存在溶液浓缩步骤。目前，西曲瑞克文献资料中常用的溶液浓缩是采用旋转蒸发仪在真空条件下将部分溶剂蒸发，过程往往需要对西曲瑞克溶液进行加热，可能导致西曲瑞克受热分解产生新的杂质。另外，文献中采用醋酸水溶液-乙腈体系进行转盐，转盐效果较差，成品中可能存在三氟乙酸残留。
三、

技术实现要素：
：
[0006]
本发明要解决的技术问题是：为了克服上述西曲瑞克现有纯化转盐方法中存在的技术问题，本发明提供一种改进的西曲瑞克的转盐方法。本发明技术方案在使用色谱系统进行纯化获得西曲瑞克溶液后，采用反渗透压技术，室温条件下通过反渗透技术对西曲瑞
克溶液进行浓缩，避免了加热过程，避免浓缩过程加热导致西曲瑞克降解的可能。同时，反渗透技术浓缩西曲瑞克溶液，效率更高。采用磷酸-乙腈体系和醋酸铵-甲醇体系对西曲瑞克中的三氟乙酸进行置换，采用醋酸-甲醇体系进行洗脱，获得醋酸西曲瑞克。
[0007]
为了解决上述问题，本发明采取的技术方案是：
[0008]
本发明提供一种西曲瑞克的转盐方法，所述转盐方法包括以下步骤：
[0009]
a、将西曲瑞克粗肽制成粗肽溶液，然后采用滤膜进行过滤，收集滤液；
[0010]
b、将步骤a所得滤液采用色谱柱进行反相色谱纯化，收集目标峰洗脱液，得到西曲瑞克溶液；
[0011]
c、将步骤b所得西曲瑞克溶液采用反渗透膜进行浓缩，得到浓缩液；采用纯化水冲洗反渗透膜，收集冲洗液，将冲洗液与浓缩液混合均匀，得到西曲瑞克浓缩液；
[0012]
d、将步骤c所得西曲瑞克浓缩液采用c18反相色谱柱进行转盐，转盐过程中依次采用两种体系进行转盐，采用醋酸溶液甲醇体系进行洗脱，洗脱时在主峰出现后开始收集洗脱液，主峰完全结束后停止收集，得到西曲瑞克溶液；
[0013]
e、将步骤d收集得到的西曲瑞克溶液采用反渗透膜进行浓缩，浓缩结束，收集浓缩液；采用纯化水冲洗反渗透膜，收集冲洗液，冲洗液与浓缩液混合均匀，将混合液转移至冻干盘中，液体高度控制在2cm以下，放入冻干机进行冻干，得到西曲瑞克醋酸盐成品。
[0014]
根据上述的西曲瑞克的转盐方法，步骤a中所述粗肽溶液是将西曲瑞克粗肽采用流动相溶解所得；所述流动相是由0.1％的三氟乙酸水溶液和含0.1％三氟乙酸的乙腈溶液混合而成，所述0.1％的三氟乙酸水溶液与含0.1％三氟乙酸的乙腈溶液混合时二者之间的体积比为90：10；所述粗肽与流动相二者之间的质量体积比为1g：25～50ml。
[0015]
根据上述的西曲瑞克的转盐方法，步骤a中所述滤膜为0.45μm的水系滤膜。根据上述的西曲瑞克的转盐方法，步骤b中反相色谱纯化过程中采用的制备柱为c18色谱柱，色谱柱的直径和长度为50mm
×
250mm；色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，固定相的粒度为10μm；检测波长为230nm，流动相a为0.1％的三氟乙酸水溶液，流动相b为含0.1％三氟乙酸的乙腈溶液；流速为30ml/min；梯度洗脱条件为60min内有机相由5％增加至40％，水相由95％降至60％。
[0016]
根据上述的西曲瑞克的转盐方法，步骤c中采用反渗透膜进行浓缩时控制压力为8～10mpa，浓缩至原溶液体积的1/5。
[0017]
根据上述的西曲瑞克的转盐方法，步骤d中所述两种转盐体系过程和洗脱体系过程中检测波长均为230nm，色谱柱均采用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，柱子的直径和长度为50mm
×
250mm；流速均为30ml/min。
[0018]
根据上述的西曲瑞克的转盐方法，步骤d中所述两种转盐体系中第一体系流动相a为0.5％的磷酸水溶液(氨水调ph至5～6)，流动相b为乙腈，置换时间为80min，水相与有机相的比例为90：10；第二体系流动相a为1％的醋酸铵水溶液，流动相b为甲醇，置换时间为60min，水相与有机相的比例为90：10；第三体系洗脱时流动相a为0.5％的醋酸水溶液，流动相b为甲醇，洗脱时间为80min，其中前40min采用等度洗脱，水相和有机相的比例为90：10，后40min采用梯度洗脱，水相由90％降至60％，有机相比例由10％升至40％。
[0019]
根据上述的西曲瑞克的转盐方法，步骤e中采用反渗透膜进行浓缩时控制压力为8～10mpa，浓缩至原溶液体积的1/5。
[0020]
本发明的积极有益效果：
[0021]
1、本发明转盐方法技术方案中，采用反渗透技术对多肽溶液进行浓缩，浓缩过程均在室温下进行，相比传统旋蒸浓缩方法，浓缩过程温度低，从而避免了多肽浓缩过程中因受热而出现降解的现象。
[0022]
2、本发明技术方案中采用磷酸水溶液/乙腈体系、醋酸铵水溶液/甲醇体系对西曲瑞克三氟乙酸盐进行洗脱，将西曲瑞克上的三氟乙酸盐置换成醋酸盐，置换效率更高，成品中无三氟乙酸残留。
四、附图说明：
[0023]
图1本发明实施例1所得产品醋酸西曲瑞克成品的液相色谱图。
五、具体实施方式：
[0024]
以下结合实施例进一步阐述本发明，但并不限制本发明技术方案保护的范围。
[0025]
实施例1：
[0026]
本发明西曲瑞克的转盐方法，所述转盐方法的详细步骤如下：
[0027]
a、将32.0g西曲瑞克粗肽转入烧杯中，放入搅拌子，加入含0.1％三氟乙酸的乙腈溶液80ml，搅拌使之溶解，然后加入0.1％的三氟乙酸水溶液720ml，搅拌至溶清，得到粗肽溶液；将所得粗肽溶液采用0.45μm的水系滤膜过滤，收集滤液；
[0028]
b、将步骤a所得滤液采用色谱柱进行反相色谱纯化，收集目标峰洗脱液，得到西曲瑞克溶液；
[0029]
采用色谱柱进行反相色谱纯化过程中的条件如下：
[0030]
用经过滤的纯化水冲洗制备柱5分钟，然后改用流动相平衡柱子，平衡后，将步骤a所得西曲瑞克粗肽滤液，经进样泵泵入制备柱，按照如下色谱条件收集目的肽洗脱液；
[0031]
色谱条件：制备柱为c18色谱柱，色谱柱的直径和长度为50mm
×
250mm；色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，固定相的粒度为10μm；检测波长为230nm，流动相a为0.1％的三氟乙酸水溶液，流动相b为含0.1％三氟乙酸的乙腈溶液；进样量为50ml/次，流速为30ml/min；梯度洗脱条件为60min内有机相由5％增加至40％，水相由95％降至60％；
[0032]
在主峰出现后开始收集洗脱液，主峰完全结束后停止收集，得到西曲瑞克溶液；
[0033]
c、将步骤b所得西曲瑞克溶液采用反渗透膜进行浓缩，控制压力为8mpa，浓缩至原体积的1/5，得到浓缩液；采用纯化水冲洗反渗透膜，收集冲洗液，将冲洗液与浓缩液混合，得到西曲瑞克浓缩液；
[0034]
d、将步骤c所得西曲瑞克浓缩液采用c18反相色谱柱进行转盐，转盐过程中依次采用两种体系进行置换，采用醋酸溶液甲醇体系进行洗脱，洗脱时在主峰出现后开始收集洗脱液，主峰完全结束后停止收集，得到西曲瑞克溶液；
[0035]
转盐具体过程中，首先采用第一体系的流动相平衡柱子，将步骤c所得西曲瑞克浓缩液，经进样泵泵入c18制备柱，然后依次按照第一体系色谱条件、第二体系色谱条件对西曲瑞克溶液中的三氟乙酸进行置换；置换后按照第三体系色谱条件进行洗脱，收集目标肽洗脱液；
[0036]
第一体系色谱条件为：检测波长为230nm，色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为固
定相，固定相的粒度为10μm，柱子的直径和长度为50mm
×
250mm；进样量为50ml/次，流速为30ml/min；流动相a为0.5％的磷酸水溶液(氨水调ph至5～6)，流动相b为乙腈，置换时间为80min，水相与有机相的比例为90：10；
[0037]
第二体系色谱条件为：检测波长为230nm，色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，固定相的粒度为10μm，柱子的直径和长度为50mm
×
250mm；流速为30ml/min；流动相a为1％的醋酸铵水溶液，流动相b为甲醇，置换时间为60min，水相与有机相的比例为90：10；
[0038]
第三体系色谱条件为：检测波长为230nm，色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，固定相的粒度为10μm，柱子的直径和长度为50mm
×
250mm；流速为30ml/min；流动相a为0.5％的醋酸水溶液，流动相b为甲醇，洗脱时间为80min，其中前40min采用等度洗脱，水相和有机相的比例为90：10，后40min采用梯度洗脱，水相由90％降至60％，有机相比例由10％升至40％。
[0039]
e、将步骤d收集得到的西曲瑞克溶液采用反渗透膜进行浓缩，控制压力为8mpa，浓缩至原体积的1/5，浓缩结束，收集浓缩液；采用纯化水冲洗反渗透膜，收集冲洗液，冲洗液与浓缩液混合，将混合液转移至冻干盘中，液体高度控制在2cm以下，放入冻干机进行冻干，得到西曲瑞克醋酸盐成品。
[0040]
本实施例所得产品的液相色谱图详见附图1。由附图1可知，本发明所得产品中未残留三氟乙酸，纯度较高。
[0041]
实施例2：
[0042]
本发明西曲瑞克的转盐方法，所述转盐方法的详细步骤如下：
[0043]
a、将16.0g西曲瑞克粗肽转入烧杯中，放入搅拌子，加入含0.1％三氟乙酸的乙腈溶液80ml，搅拌使之溶解，然后加入0.1％的三氟乙酸水溶液720ml，搅拌至溶清，得到粗肽溶液；将所得粗肽溶液采用0.45μm的水系滤膜过滤，收集滤液；
[0044]
b、将步骤a所得滤液采用色谱柱进行反相色谱纯化，收集目标峰洗脱液，得到西曲瑞克溶液；
[0045]
采用色谱柱进行反相色谱纯化过程中的条件如下：
[0046]
用经过滤的纯化水冲洗制备柱5分钟，然后改用流动相平衡柱子，平衡后，将步骤a所得西曲瑞克粗肽滤液，经进样泵泵入制备柱，按照如下色谱条件收集目的肽洗脱液；
[0047]
色谱条件：制备柱为c18色谱柱，色谱柱的直径和长度为50mm
×
250mm；色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，固定相的粒度为10μm；检测波长为230nm，流动相a为0.1％的三氟乙酸水溶液，流动相b为含0.1％三氟乙酸的乙腈溶液；进样量为50ml/次，流速为30ml/min；梯度洗脱条件为60min内有机相由5％增加至40％，水相由95％降至60％；
[0048]
在主峰出现后开始收集洗脱液，主峰完全结束后停止收集，得到西曲瑞克溶液；
[0049]
c、将步骤b所得西曲瑞克溶液采用反渗透膜进行浓缩，控制压力为10mpa，浓缩至原体积的1/5，得到浓缩液；采用纯化水冲洗反渗透膜，收集冲洗液，将冲洗液与浓缩液混合，得到西曲瑞克浓缩液；
[0050]
d、将步骤c所得西曲瑞克浓缩液采用c18反相色谱柱进行转盐，转盐过程中依次采用两种体系进行置换，采用醋酸溶液甲醇体系进行洗脱，洗脱时在主峰出现后开始收集洗脱液，主峰完全结束后停止收集，得到西曲瑞克溶液；
[0051]
转盐具体过程中，首先采用第一体系的流动相平衡柱子，将步骤c所得西曲瑞克浓
缩液，经进样泵泵入c18制备柱，然后依次按照第一体系色谱条件、第二体系色谱条件对西曲瑞克溶液中的三氟乙酸进行置换；置换后按照第三体系色谱条件进行洗脱，收集目标肽洗脱液；
[0052]
第一体系色谱条件为：检测波长为230nm，色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，固定相的粒度为10μm，柱子的直径和长度为50mm
×
250mm；进样量为50ml/次，流速为30ml/min；流动相a为0.5％的磷酸水溶液(氨水调ph至5～6)，流动相b为乙腈，置换时间为80min，水相与有机相的比例为90：10；
[0053]
第二体系色谱条件为：检测波长为230nm，色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，固定相的粒度为10μm，柱子的直径和长度为50mm
×
250mm；流速为30ml/min；流动相a为1％的醋酸铵水溶液，流动相b为甲醇，置换时间为60min，水相与有机相的比例为90：10；
[0054]
第三体系色谱条件为：检测波长为230nm，色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，固定相的粒度为10μm，柱子的直径和长度为50mm
×
250mm；流速为30ml/min；流动相a为0.5％的醋酸水溶液，流动相b为甲醇，洗脱时间为80min，其中前40min采用等度洗脱，水相和有机相的比例为90：10，后40min采用梯度洗脱，水相由90％降至60％，有机相比例由10％升至40％。
[0055]
e、将步骤d收集得到的西曲瑞克溶液采用反渗透膜进行浓缩，控制压力为10mpa，浓缩至原体积的1/5，浓缩结束，收集浓缩液；采用纯化水冲洗反渗透膜，收集冲洗液，冲洗液与浓缩液混合，将混合液转移至冻干盘中，液体高度控制在2cm以下，放入冻干机进行冻干，得到西曲瑞克醋酸盐成品。

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