一种绿色荧光白磷钙石纳米晶的制备方法与流程

[0001]
本发明涉及一种具有绿色荧光性能的白磷钙石纳米晶的制备方法。


背景技术：

[0002]
生物细胞与组织成像技术的发展，直接关乎着人们认知生命微观世界的深度。荧光染料、量子点，稀土荧光材料的发展，为人们提供了不同的标记手段，促使了该领域的迅速发展。对生物组织而言，毒副性问题一直是一个不容忽视的问题，无疑具有生物相容性的荧光标记材料具有独特的优势。
[0003]
白磷钙石（ca
18
mg
2
(hpo
4
)
2
(po
4
)
12
）是一种由钙离子、镁离子和磷酸根离子构成的，存在于生物体的硬组织中，为机体硬组织的基元材料，具有优异的生物相容性、骨诱导性、非免疫原性、可降解性等性能，可广泛应用于组织工程、靶向药物传递载体等。


技术实现要素：

[0004]
本发明的目的是提供一种具有鲜亮绿色荧光、形貌尺寸可控并具有良好生物相容性的铽掺杂白磷钙石纳米荧光探针的制备方法。
[0005]
本发明的实现过程如下：一种铽掺杂白磷钙石纳米晶的制备方法，包括如下步骤：将油酸、油酸钙和油酸镁溶于乙醇中，再加入磷酸氢钠或磷酸氢二钠水溶液，在100~180
˚
c充分密闭反应后，向其中再加入硝酸铽溶液，继续充分反应，冷却、收集沉淀，将沉淀分散于环己烷中，用乙醇助沉离心，即获得具有绿色荧光的铽掺杂白磷钙石纳米晶。
[0006]
上述步骤中，油酸钙、油酸镁与磷酸盐的摩尔比为9:1:7，所述磷酸盐为磷酸氢钠或磷酸氢二钠。
[0007]
上述步骤中，油酸、乙醇和与磷酸盐水溶液的体积比为（1
ꢀ-ꢀ
3）:（3
ꢀ-ꢀ
10）:（3
ꢀ-ꢀ
10）。
[0008]
上述步骤中，反应温度为100℃、120℃、150℃或180℃。
[0009]
上述步骤中，在100~180
˚
c密闭反应5-20h后，向其中再加入硝酸铽溶液，继续反应5~10h。
[0010]
上述步骤中，所述硝酸铽与油酸钙和油酸镁之和的摩尔比为（0.02 ~ 0.2）:1。
[0011]
上述步骤中，制备得到的铽掺杂白磷钙石纳米晶的粒径为5~ 35 nm。
[0012]
上述方法制备得到的铽掺杂白磷钙石纳米晶作为绿色纳米荧光探针应用于活体细胞荧光标记。
[0013]
本发明在制备白磷钙石纳米晶的过程中，利用后加入反应体系中的稀土离子对纳米晶表面的钙、镁阳离子置换，从而实现稀土离子在纳米晶表面的有效掺杂，并因掺杂离子与被置换的离子间化合价和离子半径的差异而使纳米晶表面形成晶格缺陷，进而促使目标材料具有鲜艳的荧光特性。若在反应起始加入硝酸铽溶液，则无法得到绿色荧光的铽掺杂白磷钙石纳米晶。
[0014]
本发明的积极效果：本发明制备方法原料廉价易得，成本低，合成工艺简易，反应环境友好，工艺放大容易且重现性能好；本方法所制备的具有绿色荧光特性的纳米晶可应用于活体细胞的荧光标记，亦可作为无机原料可用于制备可降解的人工骨、骨水泥等生物医用材料，应用前景广阔。
附图说明
[0015]
图1 是实施例 1 制备的铽掺杂白磷钙石纳米晶的tem图。
[0016]
图2 是实施例 1 制备的铽掺杂白磷钙石纳米晶的xrd图。
[0017]
图3 是实施例 1制备的铽掺杂白磷钙石纳米晶的荧光扫描图。
[0018]
图4 是实施例 5 制备的铽掺杂白磷钙石纳米晶的tem图。
[0019]
图5 是实施例6制备的绿色荧光特性的铽掺杂白磷钙石纳米晶用于细胞标记的荧光照片图。
具体实施方式
[0020]
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0021]
实施例1绿色荧光特性的铽掺杂白磷钙石纳米晶的制备将4ml油酸和16ml乙醇加入50ml的聚四氟乙烯水热釜中，再向其中加入0.93g的油酸钙和0.10g的油酸镁，搅拌溶解后，向其中加入0.15m的磷酸氢钠溶液8ml，并加入12ml的蒸馏水，搅拌均匀后密封，放于烘箱中于120
ꢀ˚
c反应15h后，向其中再次加入0.15m的硝酸铽溶液0.57ml（铽离子与钙和镁离子之和的摩尔比为0.05:1），继续在120
ꢀ˚
c下反应10h后，自然冷却至室温，离心收集沉淀，将沉淀分散于环己烷中，用乙醇助沉离心，反复2-3次，即获得终产物。
[0022]
通过透射电镜检测产物为粒径约15-25nm的纳米颗粒，如图1所示；经x射线粉末衍射鉴定产物为白磷钙石，如图2所示；对样品进行荧光扫描知其具有良好的绿色荧光特性，如图3所示。
[0023]
实施例2绿色荧光特性的铽掺杂白磷钙石纳米晶的制备将4ml油酸和16ml乙醇加入50ml的聚四氟乙烯水热釜中，再向其中加入0.93g的油酸钙和0.10g的油酸镁，搅拌溶解后，向其中加入0.15m的磷酸二氢钠溶液8ml，并加入12ml的蒸馏水，搅拌均匀后密封，放于烘箱中于150
ꢀ˚
c反应10h后，向其中再次加入0.15m的硝酸铽溶液0.57ml（铽离子与钙和镁离子之和的摩尔比为0.05:1），继续在150
˚
c反应10h后，自然冷却至室温，离心收集沉淀，将沉淀分散于环己烷中，用乙醇助沉离心，反复2-3次，即获得终产物，其理化性质与实施例1相似。
[0024]
实施例3绿色荧光特性的铽掺杂白磷钙石纳米晶的制备将4ml油酸和16ml乙醇加入50ml的聚四氟乙烯水热釜中，再向其中加入0.93g的油酸钙和0.10g的油酸镁，搅拌溶解后，向其中加入0.15m的磷酸氢钠溶液8ml，并加入12ml的蒸馏水，搅拌均匀后密封，放于烘箱中于180
ꢀ˚
c反应5h后，向其中再次加入0.15m的硝酸铽溶液1.14ml（铽离子与钙和镁离子之和的摩尔比为0.1:1），继续于180
˚
c 进行反应5h后，自然冷却至室温，离心收集沉淀，将沉淀分散于环己烷中，用乙醇助沉离心，反复2-3次，即获得终
产物，其理化性质与实施例1相似。
[0025]
实施例4绿色荧光特性的铽掺杂白磷钙石纳米晶的制备将40ml油酸和160ml乙醇加入500ml的聚四氟乙烯水热釜中，再向其中加入9.30g的油酸钙和1.00g的油酸镁，搅拌溶解后，向其中加入0.15m的磷酸氢钠溶液80ml，并加入120ml的蒸馏水，搅拌均匀后密封，放于烘箱中于120
ꢀ˚
c反应15h后，向其中再次加入0.15m的硝酸铽溶液5.71ml（铽离子与钙和镁离子之和的摩尔比为0.05:1），继续于120
˚
c 进行反应10h后，自然冷却至室温，离心收集沉淀，将沉淀分散于环己烷中，用乙醇助沉离心，反复2-3次，即获得终产物，其理化性质与实施例1相似。
[0026]
实施例5与实施例1对比实验将4ml油酸和16ml乙醇加入50ml的聚四氟乙烯水热釜中，再向其中加入0.93g的油酸钙和0.10g的油酸镁，搅拌溶解后，向其中加入0.15m的磷酸氢钠溶液8ml和0.15m的硝酸铽溶液0.57ml（铽离子与钙和镁离子之和的摩尔比为0.05:1），并加入12ml的蒸馏水，搅拌均匀后密封，放于烘箱中于120
ꢀ˚
c反应15h后，冷却至室温，离心收集沉淀，将沉淀分散于环己烷中，用乙醇助沉离心，反复2-3次，即获得终产物。
[0027]
通过透射电镜检测产物为粒径约1nm的纳米线（如图4所示），对样品进行荧光检测显示无荧光特性。该实验结果说明在反应起始加入硝酸铽溶液，则无法得到绿色荧光的铽掺杂白磷钙石纳米晶。
[0028]
实施例6绿色荧光特性的铽掺杂白磷钙石纳米晶的细胞标记第一步，纳米晶表面的亲疏水性转换。取10 mg的铽掺杂的白磷钙石纳米晶分散于2ml的环己烷中，并加入到溶有葡聚糖的10ml水溶液中，剧烈搅拌2-4h，挥发掉环己烷得浑浊的悬浮液。然后离心收集沉淀，用乙醇和水混合液洗涤沉淀，即得具有绿色荧光的亲水性的铽掺杂白磷钙石纳米晶。
[0029]
第二步，绿色荧光特性的铽掺杂白磷钙石纳米晶的细胞标记。
[0030]
在37℃的co
2
含量为5%的细胞培养箱中，用含有10%胎牛血清、2 mm谷氨酰胺、100 u/ml的青霉素、100 μg/ml链霉素的dmem培养液培养a549细胞，维持在指数生长状态。在灭菌的激光共聚焦皿上加入已经计数的a549细胞悬浮液1
×
10
5
的细胞数，培养24h, 再加入150
ꢀµ
g/ml荧光纳米粒子溶液在 37℃培养4 h，再用灭菌的pbs洗去未摄取的纳米粒子，取出激光共聚焦皿立刻用4%多聚甲醛在室温下固定10min, 固定好的细胞用激光扫描共焦显微镜观察形貌，结果如图5所示，可看见黑色衬底上有中心暗周边亮的绿色细胞图像，说明铽掺杂白磷钙石纳米晶对a549细胞成功进行了荧光标记。

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