一种具有红色荧光的白磷钙石纳米探针的合成方法与流程

[0001]
本发明涉及一种具有红色荧光的白磷钙石纳米探针的合成方法。


背景技术：

[0002]
白磷钙石（ca
18
mg2(hpo4)2(po4)
12，
whitlockite，wh）是人骨骼中一种重要的矿物质，具有优异的生物相容性，可用于制备性能优异的生物医用材料。近年来，关于白磷钙石的报道较多，其合成方法主要是采用水热法，水相合成的颗粒尺寸为微米级，限制了其应用性能。最近，c. wang et al采用溶剂热法在碱性环境下有效控制了白磷钙石的尺寸，合成了大约20nm的纳米晶用于促细胞生长。如何简单有效地制备出形貌尺寸均一的小尺寸白磷钙石纳米晶，是发挥其应用潜力的关键所在。


技术实现要素：

[0003]
本发明目的在于提供一种具有红色荧光的白磷钙石纳米探针的合成方法。
[0004]
为达到上述目的，本发明实现过程如下：一种具有红色荧光的白磷钙石纳米探针的合成方法，其合成步骤如下：在油酸和乙醇的混合溶液中，依次加入硝酸钙溶液、硝酸镁溶液和可溶性磷酸盐溶液，搅拌均匀后，将混合液转入密闭反应釜中，在120-200 ℃充分反应，自然冷却后收集沉淀，并用环己烷和乙醇洗涤，重新分散于油酸和乙醇的混合体系中，在磁力搅拌下加入硝酸铕水溶液，搅拌均匀后，再次转入密闭反应釜中，在120-200 ℃充分反应，自然冷却离心获得沉淀，用环己烷和乙醇洗涤2-3次，得到铕离子掺杂的白磷钙石纳米探针。
[0005]
上述步骤中，所述油酸、乙醇和盐溶液的体积比为1：（2-6）：（2-6），所述盐溶液为硝酸钙溶液、硝酸镁溶液和可溶性磷酸盐溶液。
[0006]
上述步骤中，所述硝酸钙和硝酸镁的摩尔比为9:1，硝酸钙和硝酸镁之和与磷酸钠的摩尔比为1.43:1。
[0007]
上述步骤中，可溶性磷酸盐选自磷酸钠、磷酸氢钠和磷酸二氢钠。
[0008]
上述步骤中，硝酸铕与硝酸钙和硝酸镁之和的摩尔比为（0.05-0.2）：1。
[0009]
上述步骤中，反应温度为120-200℃，反应时间为12-20h。
[0010]
上述步骤中，铕离子掺杂白磷钙石纳米晶的粒径为5-40nm。
[0011]
上述步骤中，制备的铕离子掺杂白磷钙石纳米颗粒具有鲜亮的红色荧光，可用于细胞荧光标记。
[0012]
本发明以油酸、乙醇为溶剂，以可溶性的钙盐、镁盐和磷酸盐水溶液为原料，可控合成了白磷钙石纳米晶，所合成的纳米颗粒具有尺寸小，形貌均一，分散性好。在白磷钙石晶体中掺杂稀土铕离子，具有鲜亮红色荧光的铕离子掺杂白磷钙石纳米晶，可应用于生物细胞成像。本发明反应溶剂体系中不涉及酸、碱试剂，反应环境友好，原料价格低廉，所制备的白磷钙石纳米颗粒方法简单，重现性好，可用于细胞成像、生物支架材料的制备等。
附图说明
[0013]
图1为实施例1制备白磷钙石纳米颗粒的tem图；图2为实施例1制备的铕离子掺杂的白磷钙石纳米探针的荧光扫描图；图3为实施例1制备的白磷钙石纳米颗粒和铕离子掺杂白磷钙石纳米探针的xrd图；图4为实施例4制备的铕离子掺杂的白磷钙石纳米探针的细胞荧光标记图。
[0014]
具体实施实例下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明均为常规方法；所用的材料试剂，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0015]
实施例1步骤1，白磷钙石纳米颗粒的合成。
[0016]
在50ml的反应釜中，依次加入油酸5ml、无水乙醇16ml、0.25m的硝酸钙溶液4.5ml、0.25m的硝酸镁溶液0.5ml，和0.15m的磷酸钠溶液5ml，搅拌均匀后，密封反应釜，并转移至150
°
c烘箱中反应15h，待反应完成后，冷却至室温，离心收集沉淀，用环己烷和乙醇洗涤沉淀3次得样品。
[0017]
对所得样品进行检测，相关的tem（图1）和xrd（图2）数据显示产物为粒径约20 nm的白磷钙石纳米颗粒，其xrd衍射峰与白磷钙石标准卡片吻合，无杂峰出现，说明制备的为纯相的白磷钙石纳米晶。
[0018]
步骤2，铕离子掺杂白磷钙石纳米探针的合成。
[0019]
在50ml的反应釜中，依次加入油酸5ml，无水乙醇16ml，本实施例步中骤1合成的白磷钙石纳米颗粒，0.25m的硝酸铕溶液250μl和10ml去离子水，搅拌均匀后，密封反应釜，放置于150
°
c烘箱中反应15h，待反应完成后，自然冷却至室温，离心收集沉淀，用环己烷和乙醇洗涤沉淀3次，得到目标终产物。
[0020]
对目标终产物进行xrd衍射分析（图2）结果显示，铕离子掺杂白磷钙石纳米颗粒与白磷钙石标准卡片吻合，亦为纯相白磷钙石纳米晶；通过在紫外灯下观察铕离子掺杂白磷钙石纳米颗粒具有鲜艳的红色荧光，荧光扫描图如图3所示（其中插图为荧光照片图）。
[0021]
实施例2步骤1，白磷钙石纳米颗粒的合成。
[0022]
在50ml的反应釜中，依次加入油酸5ml、无水乙醇10ml、0.25m的硝酸钙溶液4.5ml、0.25m的硝酸镁溶液0.5ml，和0.15m的磷酸氢钠溶液5ml，搅拌均匀后，密封反应釜，并转移至120
°
c烘箱中反应20h，待反应完成后，冷却至室温，离心收集沉淀，用环己烷和乙醇洗涤沉淀3次，获得与实施例1中步骤1相似的样品。
[0023]
步骤2，铕离子掺杂白磷钙石纳米探针的合成。
[0024]
在50ml的反应釜中，依次加入油酸5ml、无水乙醇10ml，本实施例步骤1合成的白磷钙石纳米颗粒，0.25m的硝酸铕溶液500μl和10ml去离子水，搅拌均匀后，密封反应釜，放置于120
°
c烘箱中反应20h，待反应完成后，自然冷却至室温，离心收集沉淀，用环己烷和乙醇洗涤沉淀3次，得到目标终产物。该目标产物与与实施例1步骤2所得纳米晶形貌相似，且同样具有鲜艳的红色荧光。
[0025]
实施例3步骤1，白磷钙石纳米颗粒的合成。
[0026]
在500ml的反应釜中，依次加入油酸50ml、无水乙醇100ml、0.25m的硝酸钙溶液45ml、0.25m的硝酸镁溶液5ml，和0.15m的磷酸二氢钠溶液50ml，搅拌均匀后，密封反应釜，并转移至180
°
c烘箱中反应12h，待反应完成后，冷却至室温，离心收集沉淀，用环己烷和乙醇洗涤沉淀3次，获得与实施例1中步骤1相似的样品。
[0027]
步骤2，铕离子掺杂白磷钙石纳米探针的合成。
[0028]
在500ml的反应釜中，依次加入油酸50ml、无水乙醇100ml，本实施例步骤1合成的白磷钙石纳米颗粒，0.25m的硝酸铕溶液5.0ml和100ml去离子水，搅拌均匀后，密封反应釜，放置于180
°
c烘箱中反应12h，待反应完成后，自然冷却至室温，离心收集沉淀，用环己烷和乙醇洗涤沉淀3次，得到目标终产物。该目标产物与与实施例1步骤2所得纳米晶形貌相似，且同样具有鲜艳的红色荧光。
[0029]
实施例4铕离子掺杂白磷钙石纳米探针的细胞荧光标记将合成的铕离子掺杂纳米晶进行亲水性改性，并对细胞进行荧光标记，具体如下所述：步骤1，铕离子掺杂白磷钙石纳米探针的亲水性改性在50ml烧杯加入适量环己烷，再向其中加入实施例1中步骤2制备的铕离子掺杂白磷钙石纳米晶适量，分散均匀，然后加入葡聚糖水溶液，剧烈搅拌2-4h后，离心获得沉淀，使用乙醇和水洗涤沉淀3次，最终得到亲水性的铕离子掺杂白磷钙石纳米颗粒。
[0030]
步骤2，铕离子掺杂白磷钙石纳米探针的细胞荧光标记（1）相关试剂配制dmem细胞完全培养液：在dmem基础培养基中加入10%胎牛血清，100μg/ml的链霉素，100u/ml的青霉素，混和均匀，放入4
°
c冰箱，备用。
[0031]
pbs溶液的配制：分别称取氯化钾0.01g，氯化钠0.40g，磷酸氢二钾0.01g，磷酸氢二钠0.17g，加入1000ml双重蒸馏水，超声溶解后，调节ph至7.40，121
°
c灭菌30min，保存在4
°
c冰箱待用。
[0032]
0.25%胰酶的配制：称取胰酶100mg，加入40mlpbs，用0.22μm滤膜将其过滤，放于4
°
c冰箱，保存待用。
[0033]
160μg/ml的铕离子掺杂白磷钙石纳米颗粒溶液配制：将纳米颗粒经过钴60照射后，称取1.6mg的纳米颗粒分散在10ml的dmem培养液中，混合均匀，保存在4
°
c冰箱待用。
[0034]
（2）细胞的荧光标记
①
细胞复苏在液氮罐中取出冻存的mcf-7细胞，放入37
ꢀ°
c水中至冰块融化，将其加入离心管中，加入2ml培养液，吹匀，然后在1000转的转速下，离心5 min，离心完成后，吸出上清液，然后加入2 ml培养液，吹匀沉淀在离心管底的细胞，培养皿中加入约10 ml培养液，然后将离心管中的细胞加入培养皿中，混匀，最后放入37
ꢀ°
c、5% co2培养箱中复苏细胞。
[0035]
②
细胞传代观察步骤
①
中复苏的mcf-7细胞贴壁生长至90%后，吸出培养液，再加入2mlpbs清洗细胞2次后，向培养皿中加入2 ml胰酶，放入培养箱消化2 min，在显微镜下观察消化情况；待消化完成后，加入3 ml培养液，吹打细胞数次，将其移入15 ml离心管中，在1000转的转速下，离心5 min，移除上清液，再向其中加入2 ml培养液，吹匀；取新的培养皿中加入10 ml培养液，把上述离心管中的细胞分成两份加入培养皿中，混匀，最后放入37
ꢀ°
c、5%co2培养箱
中培养。
[0036]
③ꢀ
布板将步骤
②
中细胞培养皿从培养箱中取出，在显微镜下观察，细胞贴壁生长至90%后，移除培养液，再加入2 ml pbs清洗细胞2次，向培养皿中加入2 ml胰酶，放入培养箱消化2 min，在显微镜下观察消化情况，待消化完成后，加入5-8 ml培养液，吹打细胞数次，然后打入50μl至细胞计数板，计数后，按一定比例稀释细胞，然后在激光共聚焦皿中布入细胞，细胞密度约为5
×
104个/孔，放入37
ꢀ°
c，5%co2培养箱中培养24h。
[0037]
④
激光共聚焦测试待步骤
③
中细胞贴壁后，加入含有铕离子掺杂的白磷钙石纳米颗粒培养液至激光共聚焦皿中，共培养24h后，吸出培养液，用pbs清洗没有被细胞吞噬的纳米颗粒，然后加入一定量的4%多聚甲醛固定液，固定15min，吸出固定液，用pbs清洗细胞表面后，在尼康a1型激光共聚焦显微镜下观察，结果如图4所示，细胞因吞噬了纳米晶成鲜红的像，细胞中间部位有椭圆形暗影，为细胞核的部位，说明纳米颗粒因尺寸较大未能进入细胞核中，仅存在于细胞质中。

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