一种抗万古霉素单克隆抗体及其应用的制作方法

[0001]
本发明涉及一种抗万古霉素单克隆抗体、产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，以及该抗体在检测万古霉素上的应用。属于免疫学技术领域和兽药残留分析技术领域。


背景技术：

[0002]
万古霉素(vancomycin,vcm)属于糖肽类抗生素，分子式为c
66
h
75
c
l2
n
9
o
24
，带有弱碱性，易溶于水，微溶于甲醇，不溶于丙酮，丁醇与乙醚等有机试剂。万古霉素可以抑制细菌的生长和繁殖，对各种革兰氏阳性球菌与杆菌均具有强大的抗菌作用，在治疗超级细菌如超级病菌具有良好效果，是目前已知的最好的一类抗生素，即所谓的最后一线药物。国家对此类药的使用有严格的规定，但一些不法分子利用万古霉素强大抗菌作用，开始在医疗领域及畜牧业中滥用，过量使用万古霉素药物使可抵抗万古霉素的细菌不断增长，目前已出现了可抵抗万古霉素的细菌，如万古霉素抗药性肠球菌(vre)，造成超级细菌的出现及传染病防治的隐患，而且动物体内残留的药物经人类食用将会产生二次危害。鉴于此，美国从1997年起禁止在畜禽养殖中使用万古霉素。2005年10月我国农业部第560号公告《兽药地方标准废止目录》中规定万古霉素为禁用兽药，禁止生产、经营,并且提出需要建立万古霉素的检测方法。2010年万古霉素被列在由全国食品安全整顿工作办公室专家组提出的《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单(第四批)》名单中。针对此现状，目前迫切需要建立动物源性食品中万古霉素等糖肽类抗生素残留量的快速检测方法
[0003]
国内外关于万古霉素等糖肽类抗生素的含量测定研究多集中在医药卫生领域，研究对象涉及血清、血浆、尿液及药物制剂，检测方法主要为高效液相色谱法(hplc)、液相色谱-质谱联用法(lc-ms)、液相色谱串联质谱法(lc-ms/ms)等仪器方法和免疫学快速检测方法，但关于动物源性食品中万古霉素的分析方法报道较少。仪器方法灵敏、准确，但操作繁琐，对实验设备和技术要求较高，不适合大批量样品的快速检测。免疫分析方法包括酶联免疫吸附法(elisa)和胶体金免疫层析法(gica)，具有灵敏度高、特异性好、成本低、操作方便快速等特点，适于大批量样品筛选。因此，制备抗万古霉素单克隆抗体、建立动物源性食品中万古霉素免疫快速检测方法，对于促进食品行业健康发展和保障人类身体健康具有重要意义。


技术实现要素：

[0004]
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术之缺陷提供一种抗万古霉素单克隆抗体，所述单克隆抗体对万古霉素药物有特异性，所述抗单克隆抗体由保藏编号为cctcc no:c2020117的杂交瘤细胞株vcm-3a10产生。进一步的，本发明将该单克隆抗体应用于检测动物源性食品中万古霉素药物残留。
[0005]
本发明所述技术问题是由以下技术方案实现的。
[0006]
一种抗万古霉素单克隆抗体，该单克隆抗体由保藏号为cctcc no:c2020117的杂交瘤细胞株产生。该杂交瘤细胞株被命名为杂交瘤细胞株aoz-3a10，其保藏于中国典型培
养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，保藏编号cctcc no:c2020117，保藏日期为2020年8月28日。
[0007]
上述抗万古霉素单克隆抗体效价为1:256000，亚型为igg
1
，亲和力常数ka＝4.23
×
10
8
l/mol，对万古霉素抑制率ic
50
为1.14μg/l，与万古霉素的交叉反应率为100.00％，与其它几种相似物(杆菌肽a、维吉尼霉素和粘杆菌素等)无交叉反应；
[0008]
上述抗万古霉素单克隆抗体在用于配制检测生物样品中的万古霉素的非诊断目的检测产品中的应用。
[0009]
上述应用，所述非诊断的检测产品为酶联免疫试剂盒或胶体金层析试纸条。
[0010]
进一步的，一种检测万古霉素的酶联免疫试剂盒，该试剂盒中含有如权利要求1或2所述的抗万古霉素的单克隆抗体。
[0011]
一种检测万古霉素的胶体金层析试纸条，该试纸条中含有如权利要求1或2所述的抗万古霉素的单克隆抗体。
[0012]
一种制备上述抗万古霉素单克隆抗体的方法，包括如下步骤：
[0013]
1.万古霉素人工抗原的制备方法包括如下步骤
[0014]
(1)半抗原的制备
[0015]
称取万古霉素25mg、琥珀酸酐20mg，用二甲基亚砜0.6ml溶解，加入吡啶0.2ml，80℃搅拌反应4h，37℃烘干，固体为半抗原。
[0016]
(2)免疫原的制备
[0017]
取20mg半抗原，溶于2ml n,n-二甲基甲酰胺中，取碳二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺各30mg，用0.2ml 0.01m的pbs溶解后加入半抗原溶液中，室温搅拌24h，得到反应液-。称取牛血清白蛋白50mg，溶解在3ml 0.01m的pbs中，然后滴加入反应液-中，室温搅拌24h，用0.01m的pbs 4℃透析3d，分装，-20℃保存。得到免疫原vcm-bsa。
[0018]
(3)包被原的制备
[0019]
用卵清白蛋白40mg代替牛血清白蛋白，其他步骤同免疫原制备。得到包被原vcm-ova。
[0020]
2.万古霉素单克隆抗体的制备方法包括如下步骤：
[0021]
(1)动物免疫：选择载体蛋白为牛血清白蛋白的免疫原，免疫6-8周龄的雌性blab/c小鼠，间隔2周免疫1次，三次免疫后断尾取血测定效价和抑制率，选择结果最佳的小鼠加强免疫，准备融合；
[0022]
(2)细胞融合：取步骤(1)选定的小鼠的脾细胞和本实验室保存的sp2/o细胞进行融合，间接elisa法测定上清液选取阳性高的孔，通过有限稀释法对阳性孔进行亚克隆，直至建立产生单一抗万古霉素的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
[0023]
(3)单克隆抗体的大量制备：选取个体较大的雌性blab/c小鼠，采用体内诱生腹水法，大量制备腹水，并通过辛酸-硫酸铵沉淀纯化腹水，分成小管，-20℃保存；
[0024]
3.万古霉素单克隆抗体特性鉴定包括如下步骤：
[0025]
(1)效价测定
[0026]
以1：40000稀释包被原包被检测板，将纯化后的单克隆抗体进行1:200，1:400，1:800，
……
1:800000稀释，加入到酶标板孔内，反应后加入hrp标记的羊抗鼠二抗，最后用tmb显色，结果显示纯化后的万古霉素单克隆抗体浓度为1mg/ml时的效价达1：256000。
[0027]
(2)亚型测定
[0028]
采用购自sigma公司的鼠源单抗亚型鉴定试剂盒进行亚型测定，结果显示万古霉素单克隆抗体亚型为igg1。
[0029]
(3)亲和力测定
[0030]
采用非竞争酶联免疫法测定万古霉素单克隆抗体的亲和常数，结果显示亲和常数ka＝4.23
×
10
8
l/mol。
[0031]
(4)抑制率测定
[0032]
采用间接竞争elisa测定抑制率，以吸光度百分比b/b0％(b代表不同浓度标准液的a450，b0代表零浓度标准液的a450)为纵坐标，以不同浓度标准液的对数[lg(vcm)]为横坐标，绘制抗体的抑制曲线。结果显示该抗体对万古霉素抑制率ic
50
为1.14μg/l。
[0033]
(5)特异性测定
[0034]
用竞争elisa法测定该抗体与万古霉素及其类似物(杆菌肽a、维吉尼霉素和粘杆菌素)的交叉反应率，结果该抗体与万古霉素cr(％)为100％，与其类似物cr(％)均小于0.1％。
[0035]
本发明提供的单克隆抗体可应用于检测样品中万古霉素，主要是将其应用于制备万古霉素检测的酶联免疫试剂盒和胶体金试条纸。
[0036]
本发明提供的抗万古霉素单克隆抗体的质量具有很强的可控性和可重复性，并通过对所得抗体特性的初步分析及鉴定，为特异、灵敏的免疫测定方法的进一步建立和应用提供了实验依据。
附图说明
[0037]
图1本发明所述万古霉素人工免疫抗原紫外扫描鉴定图
[0038]
图2本发明所述万古霉素人工免疫抗原凝胶电泳鉴定图
[0039]
图3本发明所述万古霉素单克隆抗体亚型测定图
[0040]
图4本发明所述万古霉素单克隆抗体亲和力测定图
[0041]
图5本发明所述万古霉素单克隆抗体抑制率测定图
[0042]
本发明产生抗万古霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株被命名为杂交瘤细胞株aoz-3a10，，其保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，保藏编号cctcc no:c2020117，保藏日期为2020年8月28日。
具体实施方式
[0043]
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，所列举的实施例不对本发明的内容和保护范围构成任何限制。
[0044]
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0045]
实施例一 本发明所述万古霉素人工抗原的制备与鉴定
[0046]
1.万古霉素人工抗原的制备
[0047]
(1)万古霉素半抗原的制备
[0048]
称取25mg万古霉素、20mg琥珀酸酐，加入0.2ml吡啶、0.6ml二甲基亚砜(dmso),在80℃下搅拌反应4h，37℃烘干溶剂，固体为半抗原。
[0049]
(2)万古霉素免疫原的制备
[0050]
取20mg半抗原，溶于2ml n,n-二甲基甲酰胺中，取碳二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺各30mg，用0.2ml 0.01m的pbs溶解后加入半抗原溶液中，室温搅拌24h，得到反应液-。称取牛血清白蛋白50mg，溶解在3ml 0.01m的pbs中，然后滴加入反应液-中，室温搅拌24h，用0.01m的pbs 4℃透析3d，分装，-20℃保存。
[0051]
(3)万古霉素包被原的制备
[0052]
取20mg半抗原，溶于2ml n,n-二甲基甲酰胺中，取碳二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺各30mg，用0.2ml 0.01m的pbs溶解后加入半抗原溶液中，室温搅拌24h，得到反应液-。称取卵清白蛋白40mg，溶解在3ml 0.01m的pbs中，然后滴加入反应液-中，室温搅拌24h，用0.01m的pbs 4℃透析3d，分装，-20℃保存。
[0053]
2.万古霉素人工抗原的鉴定
[0054]
(1)紫外分光光度法鉴定
[0055]
用pbs对万古霉素和bsa进行适当稀释，测定bsa的蛋白浓度，把vcm-bsa稀释到与bsa相同浓度，在220-700nm波长下进行紫外扫描。结果见图1，bsa的特征吸收峰在278nm处，vcm的特征吸收峰在282nm处，二者合成产物的吸收峰在278～280nm之间，且峰形与bsa更接近，判定免疫原vcm-bsa合成成功。
[0056]
(2)sds-page鉴定
[0057]
按照常规sds-page方法，配制12﹪分离胶，5％浓缩胶，电压30v至蛋白条带进入分离胶后，调节电压90v继续电泳约2h。经染色、脱色处理。结果见图2，偶联产物与bsa有明显差别，带宽且有拖尾，判定vcm-bsa偶联成功。
[0058]
实施例二 本发明所述万古霉素单克隆抗体的制备
[0059]
1.动物免疫：载体蛋白为牛血清白蛋白的免疫原免疫6-8周龄的雌性blab/c小鼠，间隔2周免疫1次，免疫流程见表1，三免后断尾取血测定效价和抑制率，选择结果最佳的小鼠准备融合；
[0060]
表1 免疫流程图
[0061][0062]
2.细胞融合：融合小鼠摘眼球放血，将血清作为阳性对照，脱颈处死后无菌条件下取出脾脏，制备脾细胞，与sp2/0细胞按5:1的比例通过peg融合，将融合后的细胞悬液加入已铺有饲养细胞的96孔板，放入37℃、5％co
2
的培养箱中培养；
[0063]
3.阳性杂交瘤细胞株的筛选：融合后的细胞，次日检查有无污染，融合后第10d换用ht培养基。换液后2-3d用间接elisa和间接竞争elisa进行阳性孔筛选，尽量挑选出强阳性、抑制率高、单个克隆、细胞状态好的孔，通过有限稀释法进行亚克隆，同时进行扩大培养、冻存，直至建立单一分泌抗万古霉素的单克隆细胞株。
[0064]
4.单克隆抗体的大量制备：采用小鼠体内诱生腹水的方法，取健康的balb/c雌性
小鼠，每只小鼠体内注射石蜡油0.5ml，7d后调整克隆化阳性杂交瘤细胞10
6
/ml，每只小鼠腹腔注射1ml，7-9d取腹水，离心弃脂肪，先后经辛酸-硫酸铵、protein a亲和层析柱纯化，冻干后-20℃保存。
[0065]
实施例三 本发明所述万古霉素单克隆抗体特性鉴定
[0066]
(1)效价测定
[0067]
采用间接elisa法，具体步骤如下：包被：用碳酸盐缓冲液稀释包被原至浓度为2μg/ml，96孔酶标板100μl/孔，4℃过夜；洗涤：包被板恢复至室温，倾去包被液，每孔加洗液300μl，每次静置1min，洗涤3次，最后一次拍干；封闭：每孔加200μl含10％小牛血清的洗液，37℃1h；倾去封闭液，洗涤3次，拍干；加一抗：用洗液将单抗以1:2000倍开始倍比稀释，每孔加入100μl，并设置空白对照孔(pbs)和阴性对照(阴性血清)，37℃放置45min；倾去一抗，洗涤3次，拍干；加酶标二抗：每孔加入100μl的l:10000倍稀释的hrp酶标记的山羊抗鼠igg，37℃放置30min；倾去二抗，洗涤3次，拍干；显色：每孔加底物显色液100μl，37℃避光反应15min；终止：每孔加入50μl终止液，终止反应；检测：测定波长为450nm处的吸光度值(a450nm)。
[0068]
结果判定：(a样品孔－a空白对照)/(a阴性对照－a空白对照)≧2.1，且阴性对照的a450nm小于0.2时，此时抗体的稀释倍数即为抗体效价。抗万古霉素单克隆抗体3a10浓度为1mg/ml时的效价达1：256000。
[0069]
(2)亚型测定
[0070]
采用购自sigma公司的鼠源单抗亚型鉴定试剂盒进行亚型测定。杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体与不同亚类的二抗显色有明显差异，其中与igg1二抗的a450 nm值最高，与igm的二抗显色微弱，而与igg2a、igg2b、igg3和iga二抗几乎不显色，该细胞分泌的抗体类型以igg1为主。结果见图3所示，万古霉素单克隆抗体亚型为igg1。
[0071]
(3)亲和力测定
[0072]
采用非竞争elisa法测定亲和常数(ka)。具体步骤如下：包被：用碳酸盐缓冲液稀释包被原至浓度为0.8、0.1、0.05、0.01μg/ml，96孔酶标板100μl/孔分别包被，4℃过夜；倾去包被液，洗涤3次，拍干；封闭：每孔加200μl含10％小牛血清的洗液，37℃1h；倾去封闭液，洗涤3次，拍干；加单抗：用洗液将单抗以100μg/ml开始倍比稀释，每孔加入100μl，37℃保温保湿45min；倾去一抗，洗涤3次，拍干；加酶标二抗：每孔加入100ul的l:10000倍稀释的hrp酶标记的山羊抗鼠igg，37℃放置30min；倾去二抗，洗涤3次，拍干；显色：每孔加底物显色液100μl，37℃避光反应15min；终止：每孔加入50μl终止液，终止反应；检测：测定波长为450nm处的吸光度值(a450nm)。按下列公式计算ka
[0073]
ka＝(n-1)/2(n ab
’-
ab)
[0074]
式中：ab为抗原浓度为ag时，产生半数吸光度值的抗体浓度；ab
’
为抗原浓度为ag
’
时，产生半数吸光度值的抗体浓度；n为ag和ag
’
之间的稀释倍数采用非竞争酶联免疫法测定万古霉素单克隆抗体的亲和常数，结果如图5所示，亲和常数ka＝4.23
×
10
8
l/mol。
[0075]
(4)抑制率测定
[0076]
采用间接竞争elisa法，具体步骤如下：包被：用碳酸盐缓冲液稀释包被原至浓度为2μg/ml，96孔酶标板100μl/孔，4℃过夜；倾去包被液，洗涤3次，拍干；封闭：每孔加200μl含10％小牛血清的洗液，37℃1h；倾去封闭液，洗涤3次，拍干；加单抗和标准品：将标准品母
液用pbs稀释成8.1、2.7、0.9、0.3、0.1、0μg/l，每孔加入50μl，再加入一定稀释倍数的单抗，每孔50μl，同时设置空白对照孔(pbs)和阴性对照(50μl单抗+50μl洗液)，37℃保温保湿45min；倾去一抗，洗涤3次，拍干；加酶标二抗：每孔加入100ul的l:10000稀释的hrp酶标记的山羊抗鼠igg，37℃放置30min；倾去二抗，洗涤3次，拍干；显色：每孔加底物显色液100μl，37℃避光反应15min；终止：每孔加入50μl终止液，终止反应；检测：测定波长为450nm处的吸光度值(a450nm)。
[0077]
以吸光度百分比b/b0％(b代表不同浓度标准液的a450，b0代表零浓度标准液的a450)为纵坐标，以不同浓度标准液的对数[lg(vcm)]为横坐标，绘制抗体的抑制曲线。结果见图3，该抗体对万古霉素抑制率ic
50
为1.14μg/l。
[0078]
(5)特异性测定
[0079]
用竞争elisa法检测抗vcm单克隆抗体与杆菌肽a、维吉尼霉素、粘杆菌素等物质的交叉反应性，根据交叉反应率(cross reaction，cr)判定抗vcm单克隆抗体的特异性。cr＝(vcm的ic
50
/各结构类似物的ic
50
)
×
100
℅
，见表2，该抗体与万古霉素cr(％)为100％，与其类似物cr(％)均小于0.01％。
[0080]
表2 vcm抗体交叉反应结果
[0081][0082]
实施例四 本发明所述万古霉素单克隆抗体的应用
[0083]
本实施例是本发明中单克隆抗体3a10在建立检测万古霉素残留的酶联免疫检测试剂盒和胶体金层析试纸条方法的应用举例，可以用于动物组织和牛奶中万古霉素的检测。
[0084]
1.样品前处理
[0085]
(1)组织(肉类、肝脏、水产品)样品组织的前处理
[0086]
组织匀浆后，准确称取样品5.0g(精确至0.01g)于50ml离心管中，加入10ml甲醇-水溶液(5:5，v/v)，400μl甲酸溶液，均质提取2min，涡旋，超声提取30min，以8000r/min冷冻离心2min，上清液转移至另一离心管中，残渣再按上述步骤重复提取一次，离心，合并提取液，待检测。
[0087]
(2)尿样前处理
[0088]
准确称取样品5.0g(精确至0.01g)于50ml离心管中，加入10ml乙腈，0.1ml三氯乙酸(质量分数8％)，以8000r/min冷冻离心2min，上清液转移至另一离心管中，残渣再按上述步骤重复提取一次，离心，合并提取液，待检测。
[0089]
2.该抗体应用于酶联免疫检测试剂盒方法检测
[0090]
本发明中试剂盒的检测原理是间接竞争elisa方法。
[0091]
检测：将万古霉素包被原包被于微孔板上，按需要取出板条，放置在酶标板上；按需要的量将万古霉素单克隆抗体工作液和酶标记抗抗体工作液按5:1比例混合；向孔内依次加入标准品或待测样品50ul、万古霉素单克隆抗体工作液和酶标记抗抗体工作液的混合液50ul，轻轻振荡混匀，25℃避光孵育30min；将孔内液体甩干，用洗涤工作液(用去离子水将20
×
浓缩洗涤液20倍稀释)250ul/孔，洗涤4次，拍干；将显色液a和显色液b按1:1比例混合，100ul/孔加入显色，25℃避光孵育15min；加终止液50ul终止反应，酶标仪450nm下采用双波长450nm/630nm测定，根据标准曲线进行定量或定性。
[0092]
结果判定：(a)定量分析：分别计算标准品和待测样品的平均吸光度值，标准品或样品的吸光度值(b)除以0标准品的吸光度值再乘以100％，即为百分吸光度值，百分吸光度值＝(b/b
0
)
×
100％。以百分吸光度值为纵坐标，标准浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线。将待测样本的百分吸光度值代入标准曲线，即可求出对应的浓度，再乘以稀释倍数即为样本的实际含量。(b)定性分析：用待测样本的平均吸光度值和标准品的吸光度值相比较，即可得出待测样本的浓度范围，测试范围为0.1ug/ml-8.1ug/ml。
[0093]
(3)该抗体应用于胶体金层析试纸条方法检测
[0094]
反应原理采用竞争法对万古霉素进行半定量检测，样品中存在的万古霉素在沿试纸条上移过程中先与金颗粒标记的抗体3a10结合，固定在nc膜上的包被原与万古霉素同时竞争结合金标抗体，t位置(检测线)的显色强弱与样品中残留万古霉素的含量成反比，若样品中无万古霉素残留，则金标抗体全部与包被原反应，试纸条的t线显色。
[0095]
检测：取出vcm胶体金层析试纸条，将样品端插入待测样品液中，插入深度不超过标记线，约10-20秒钟取出检测试纸条，水平放置，3-5分钟观察判定检测结果，10分钟以后结果无效。
[0096]
结果判定：包被膜上对应的质控区c位置(质控线)显示一条棕红色线，检测区t位置不显示棕红色线，表示检测结果为阳性，说明在待测样品中含有vcm；在包被膜上t、c位置显示有两天棕红色线，表示结果为阴性，说明在待测样品中不含vcm；当质控区c不显示出棕红色条带，则无论检测区t显示出棕红色条带与否该试纸均判为无效。
[0097]
上述实施例只为说明本发明的技术构思和优点，本发明也可以具有其它的形式变化，如本领域技术人员所熟知，上述实施例仅仅起到对上述发明保护范围内的示范作用，对本领域普通技术人员来说，在本发明所限定的保护范围内还有很多常规变形和其它实施例，这些变形和实施例都将在本发明待批的保护范围之内。

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