一种降解菌剂及其制备方法和应用与流程

[0001]
本发明属于污染土壤微生物修复技术领域，具体涉及一种用于多环芳烃污染土壤修复的降解菌剂及其制备方法和应用。


背景技术：

[0002]
随着工业的发展和城市化进程的加剧，环境问题受到越来越多的关注，持久性有机污染物多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons，pahs)主要通过人类活动排放到环境中，如石油化工业、汽车尾气排放等。我国不同地区土壤中pahs的种类和数量不同，污染呈现面积大、多组分复合等特点，严重危及农产品质量和生态环境安全。污染土壤的修复方法主要有物理、化学、生物几大类，由于微生物修复具有安全、环保、经济等方面的优点，因此被广泛用于野外污染土壤的修复。目前，已报道的具有多环芳烃降解能力的细菌菌属有47个，其中常见的主要有：分枝杆菌、红球菌、鞘氨醇单胞菌、假单胞菌、分支杆菌属、芽孢杆菌、红球菌、诺卡氏菌等。
[0003]
然而微生物进入土壤后受到复杂环境的影响，其存活率、繁殖能力以及降解能力极易受到生物、非生物因素的影响，因此越来越多的研究者将高效降解菌制成菌剂，增强其在不利环境中的生存能力以及竞争力。此外，土壤环境十分复杂，其中不仅包含各种各样土壤生物，还包括多种类型的无机矿物组分和有机组分，直接影响有机污染物的迁移转化过程。因此，在环境修复领域亟需适应能力强、且对环境友好的高效降解菌剂。
[0004]
噬氨副球菌(paracoccus aminovorans)hpd-2属于现有技术中已经披露的微生物，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，菌种保藏号为cgmccno.2568。
[0005]
以土壤组分为材料制备高效降解菌剂不仅能够为微生物提供良好的生存条件，降低外界环境对微生物的损伤，还避免在微生物修复过程中产生其他污染，在pahs土壤修复中具有现实意义。


技术实现要素：

[0006]
解决的技术问题：本发明提供一种降解菌剂及其制备方法和应用，该发明可以克服实际污染土壤中添加游离微生物修复效率偏低等问题，有助于降解微生物在污染土壤中的存活，且所采用的菌剂材料为土壤组分，能够实现pahs污染土壤高效、绿色、经济的可持续修复，在pahs污染农田及场地土壤生物修复领域具有良好的发展应用潜力。
[0007]
技术方案：一种降解菌剂，包括胡敏酸和蒙脱石中的至少一种和苯并[a]芘降解菌噬氨副球菌(paracoccus aminovorans)hpd-2，施加于土壤后胡敏酸质量含量为土壤质量的0.2％-0.5％的，蒙脱石质量含量为1％-2％，苯并[a]芘降解菌噬氨副球菌(paracoccus aminovorans)hpd-2的含量按土壤干重计为10
7-108cfu/g。
[0008]
优选的，所述胡敏酸质量含量为0.5％，蒙脱石质量含量为2％。
[0009]
上述降解菌剂的制备方法，包括如下步骤：(1)噬氨副球菌hpd-2的培养及菌悬液的制备：将保存于-80℃的噬氨副球菌菌株取出，接种于液体lb培养基中，在30℃、150r/min
条件下培养16h，按5vol.％接种到含有5mg/l苯并[a]芘的无机盐培养基中继续培养24h；随后按5vol.％再次接种到lb培养基中培养16-20h，离心获得上述菌体的对数生长期细胞；用生理盐水洗涤2次后重新悬浮于无菌水中，菌体数量约为109cfu/ml，记为菌悬液a；(2)降解菌剂的制备：将菌悬液a分别添加到蒙脱石粉末、胡敏酸粉末中制成蒙脱石菌剂和胡敏酸菌剂；将菌悬液a按比例添加到由蒙脱石和胡敏酸组成的混合物中，制备成复合菌剂。
[0010]
上述液体lb培养基成分及用量：酵母提取物5.0g/l，蛋白胨10.0g/l，nacl 10.0g/l，其余为去离子水，调节ph为7.0，在0.12mpa、121℃下灭菌20min备用。
[0011]
上述含有苯并[a]芘的无机盐培养基成分及用量：每升去离子水含k2hpo
4 6.0g，kh2po
4 5.5g，na2so
4 2.0g，kcl 2.0g，nh4no
3 2.0g，mgso4·
7h2o 0.2g，微量元素溶液1.0ml，调节ph为7.2，在0.12mpa、121℃下灭菌20min备用。随后加入过滤除菌的苯并[a]芘贮存液，使其浓度为5mg/l。
[0012]
优选的，上述步骤(1)中所述生理盐水为0.85％的nacl溶液。
[0013]
优选的，上述步骤(1)中所述离心处理为以10000r/min的速度离心2min。
[0014]
上述降解菌剂在多环芳烃污染土壤修复中的应用。
[0015]
有益效果：本发明制备的蒙脱石菌剂和胡敏酸菌剂可以促进某些pahs降解微生物的生长繁殖，同时能够吸附土壤中的pahs供给微生物利用，从而促进pahs的去除；制备方法操作简单、成本低、效果好，具有大规模工业化生产的前景，适合pahs污染土壤的原位修复且无二次污染。
附图说明
[0016]
图1为游离菌及不同材料菌剂对土壤中pahs的去除效果(每处理中降解菌含量一致，为10
7-108cfu/g；hpd代表接种游离菌hpd-2的处理；1％mont代表接种蒙脱石菌剂且蒙脱石含量为1wt.％；2％mont代表接种蒙脱石菌剂且蒙脱石含量为2wt.％；0.2％ha代表接种胡敏酸菌剂且胡敏酸含量为0.2wt.％；0.5％ha代表接种胡敏酸菌剂且胡敏酸含量为0.5wt.％；1％mont+0.2％ha代表接种复合菌剂，其中蒙脱石含量为1wt.％，胡敏酸含量为0.2wt.％)；
[0017]
图2为游离菌及不同材料菌剂对土壤中不同环数pahs的去除效果(3环pahs包括芴、菲、蒽；4环pahs包括荧蒽、芘、苯并[a]蒽、5环pahs包括苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、苯并[a]芘、苯并[a,h]蒽；6环pahs包括苯并[g,h,i]芘，茚并[1,2,3]芘)。
具体实施方式
[0018]
为更好的理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。
[0019]
对比例1：接种游离hpd-2对土壤中pahs的去除效果
[0020]
将保存于-80℃的噬氨副球菌菌株取出，接种于液体lb培养基中，在30℃、150r/min条件下培养16h，按5vol.％接种到含有5mg/l苯并[a]芘的无机盐培养基中继续培养24h；随后按5vol.％再次接种到lb培养基中培养16-20h，离心获得上述菌体的对数生长期细胞；用生理盐水洗涤2次后重新悬浮于无菌水中，用于pahs污染土壤的微生物修复。
[0021]
以南京某焦化厂污染场地采集的土壤为供试土壤，土壤中pahs含量为452.76mg/
kg，其中以3环的菲、4环的荧蒽、芘以及5环的苯并[a]芘含量较高，分别为42.96、69.03、100.59、45.13mg/kg(表1)。将上述制备的hpd-2菌悬液按照10
7-108cfu/g的投加比投加到土壤中。由图1可见，修复42天后，对照处理组中pahs的去除效率为9.4％，其中低分子量多环芳烃的去除效率为14.8％(图2)，这表明在适宜的培养条件能够刺激pahs污染土壤的自然消减能力，从而使得pahs含量有所降低。添加游离hpd-2的土壤中pahs的去除率为27.5％(图1)，显著高于ck，这表明高效降解菌的添加能够促进土壤中pahs的去除，其中低分子量多环芳烃的去除效率为45.0％，4环及5环的去除效率分别为24.9％和34.0％，6环的去除效率最低，为18.2％(图2)。
[0022]
表1原始土壤及不同处理土壤中多环芳烃的含量(mg/kg)
[0023][0024]
实施例1：不同材料制成的高效降解菌剂对土壤中pahs的去除效果
[0025]
将保存于-80℃的噬氨副球菌菌株取出，接种于液体lb培养基中，在30℃、150r/min条件下培养16h，按5vol.％接种到含有5mg/l苯并[a]芘的无机盐培养基中继续培养24h；随后按5vol.％再次接种到lb培养基中培养16-20h，离心获得上述菌体的对数生长期细胞；用生理盐水洗涤2次后重新悬浮于无菌水中，制成菌体数量约为109cfu/ml的菌悬液。随后将适量的菌悬液添加到蒙脱石、胡敏酸中制成高效降解菌剂，用于pahs污染土壤的微生物修复。
[0026]
以南京某焦化厂污染场地采集的土壤为供试土壤，土壤中pahs含量为452.76mg/kg，将上述高效降解菌剂投加到土壤中，土壤中降解菌的含量为10
7-108cfu/g，蒙脱石含量分别为1wt.％、2wt.％，胡敏酸含量分别为0.2wt.％、0.5wt.％，添加复合菌剂的土壤中蒙脱石含量为1wt.％，胡敏酸含量为0.2wt.％。由图1可见，修复42天后，使用不同质量含量蒙脱石菌剂和胡敏酸菌剂的处理中pahs的去除率有不同程度的提高，其中以2wt.％蒙脱石菌剂和0.2wt.％ha菌剂的处理中pahs去除效率最高，分别为41.6％和42.8％。其次为1wt.％mont菌剂和0.5wt.％ha菌剂的处理中pahs的去除效率30.4％和29.0％，二者无显著性差异。由表1及图1可见，添加不同质量含量的蒙脱石菌剂、胡敏酸菌剂都能够提高pahs的修复效果，且其去除效率高于单独添加hpd-2的处理。由此可见，添加高效降解菌剂能显著提高土壤中pahs的去除效率。然而添加1％mont+0.2％ha复合菌剂的处理中，pahs的去除率与hpd处理之间无显著性差异，需进一步对蒙脱石与胡敏酸的含量进行调整。添加菌剂的处理中3环pahs的去除效率在41.6％-56.8％之间，其中菲含量变化最为明显，在2％mont及0.2％ha中菲的浓度分别为18.93mg/kg和17.86mg/kg，显著低于hpd及ck中的菲含量(表1)。4环pahs的去除效率为23.8％-41.3％，其中2％mont和0.2％ha中芘含量分别为59.32mg/kg和58.18mg/kg，显著低于hpd(74.96mg/kg)及ck(91.18mg/kg)中的芘含量。5环pahs的去除效率在32.0％-51.5％之间，2％mont及0.2％ha中苯并[a]芘的含量分别为23.82mg/kg和22.10mg/kg，显著低于hpd(30.04mg/kg)及ck(35.76mg/kg)。6环pahs为所有pahs中去除效
率较差的一种，ck中自然消减效率为7.4％，接游离菌的处理hpd中其去除效率为18.2％，而0.2％ha和2％mont处理中6环pahs的去除效率显著高于其他处理组，分别为29.1％、30.8％。由以上结果可见，1％、2％mont菌剂和0.2％、0.5％ha菌剂都能显著促进土壤中pahs的消减，其中以2％mont菌剂和0.5％ha菌剂效果最为显著，特别是能够显著促进5环pahs的去除。
[0027]
本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

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