检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物对、探针、试剂盒及其应用的制作方法

2021-02-02 14:02:20|

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检测新型冠状病毒sars-cov-2的引物对、探针、试剂盒及其应用
技术领域
[0001]
本发明涉及病毒检测技术领域，特别涉及检测新型冠状病毒sars-cov-2的引物对、探针、试剂盒及其应用。

背景技术：

[0002]
冠状病毒属(coronavirus)病毒是具外套膜(envelope)的单股正链rna病毒，直径约 80～120nm，其遗传物质是所有rna病毒中最大的，是许多家畜、宠物包括人类疾病的重要病原，可引起多种急慢性疾病。第九次国际病毒学分类委员会报告将冠状病毒科分为三个属，即α、β和γ属。其中α属冠状病毒的人冠状病毒229e、人冠状病毒nl63以及β属冠状病毒的人冠状病毒hku1、人冠状病毒oc43、严重急性呼吸综合征(severe acute respiratorysyndromes，sars)相关病毒等5种病毒可引起人不同程度疾病。
[0003]
核酸检测是现阶段用于确诊新型冠状病毒肺炎的主要手段之一。目前对新型冠状病毒的核酸检测手段主要是rt-pcr法，此方法以其较高的特异性及敏感性在新型冠状病毒检测方面发挥着重大作用。但是rt-pcr方法由于其变温的特点需要相关的昂贵复杂仪器设备，且需要有专业的实验室和技术人员，因此无法应用于基层和现场的检测。而且，rt-pcr方法根据不同的试剂盒，整个检测时间需要1.5-3小时，受检测速度的限制，会导致大量疑似病例的样本积压，不能快速得到结果。
[0004]

技术实现要素：

[0005]
本发明要解决目前缺乏快速、准确检测sars-cov-2试剂盒的技术问题，提供一种基于 rpa技术检测新型冠状病毒sars-cov-2的引物对、探针、试剂盒，该试剂盒操作简单、耗时短，能快速、准确、特异地对sars-cov-2进行检测。
[0006]
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:
[0007]
在本发明的一个方面，提供了一种用于检测新型冠状病毒sars-cov-2的引物对，所述引物对选自：上游引物seq id no.1和下游引物seq id no.3，或上游引物seq id no.2和下游引物seq id no.4。
[0008]
在本发明的另一方面，还提供了一种用于检测新型冠状病毒sars-cov-2的探针，所述探针为seq id no.5或seq id no.6所示的核苷酸序列。
[0009]
优选的，所述探针在其核苷酸序列的第29位碱基修饰荧光报告基团、第31位碱基替换为四氢呋喃残基和第33位碱基修饰荧光淬灭基团的物质。
[0010]
所述荧光报告基团包括fam、hex、tet、joe、vic、rox、cy3或cy5；所述荧光淬灭基团包括tamra、eclipse、bhq1、bhq2、bhq3或dabcyl。
[0011]
在本发明的另一方面，还提供了一种检测新型冠状病毒的sars-cov-2的试剂盒，所述试剂盒包含上述的引物对。
[0012]
优选的，所述试剂盒包含上游引物seq id no.1、下游引物seq id no.3、和探针seq idno.5。
[0013]
优选的，所述试剂盒包含上游引物seq id no.2、下游引物seq id no.4、和探针seq idno.6。
[0014]
所述引物的浓度为0.4-1μm，所述探针的浓度为0.2-0.6μm。优选的，所述引物的浓度为 0.6μm，所述探针的浓度为0.4μm。
[0015]
在本发明的另一方面，还提供了上述试剂盒在制备检测新型冠状病毒sars-cov-2的产品中的应用。
[0016]
本发明检测新型冠状病毒sars-cov-2的试剂盒，灵敏度高、特异性强，最短只需10min 即可实现对新型冠状病毒的恒温检测，克服了现有rt-pcr检测新型冠状病毒sars-cov-2 rna检测时间长，需要反转录，操作繁琐的缺点，适合基层和现场检测，对新型冠状病毒的快速诊断具有非常重要的意义，具有很大的应用前景。
附图说明
[0017]
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
[0018]
图1是本发明实施例1的n、s基因引物探针组在28℃、37℃扩增产物电泳图；
[0019]
图2是本发明实施例1的n、s基因引物探针组在37℃扩增不同时间的产物电泳图；
[0020]
图3是本发明实施例3的n基因引物探针组的引物浓度优化图；
[0021]
图4是本发明实施例4的n基因引物探针组的探针浓度优化图；
[0022]
图5是本发明实施例5的n基因引物探针组的灵敏度检测结果图；
[0023]
图6是本发明实施例5的s基因引物探针组的灵敏度检测结果图；
[0024]
图7是本发明实施例6的n基因引物探针组的特异性检测结果图；
[0025]
图8是本发明实施例6的s基因引物探针组的特异性检测结果图。
具体实施方式
[0026]
实施例1检测新型冠状病毒sars-cov-2的引物和探针设计及rpa检测方法
[0027]
1.引物和探针的设计
[0028]
通过对已公布的新型冠状病毒sars-cov-2的全序列共包含10个基因进行综合分析比较，选取n、s基因序列进行引物探针设计。通过筛选，优选出下述表1所列的2组引物探针组，其中，第一组是针对n基因序列设计的seq id no.1所示上游引物、seq id no.3 所示下游引物、和seq id no.5所示探针；第二组是针对s基因序列设计的seq id no.2 所示上游引物、seq id no.4所示下游引物、和seq id no.6所示探针。
[0029]
表1检测新型冠状病毒sars-cov-2的引物和探针序列
[0030][0031]
优选地，探针seq id no.5和seq id no.6所示核苷酸序列的第29位碱基修饰荧光
报告基团、第31位碱基替换为四氢呋喃残基和第33位碱基修饰荧光淬灭基团的物质。探针修饰的荧光报告基团包括fam、hex、tet、joe、vic、rox、cy3或cy5；优选为fam或 hex。荧光淬灭基团包括tamra、eclipse、bhq1、bhq2、bhq3或dabcyl；优选为bhq1 或bhq2。
[0032]
2.检测新型冠状病毒sars-cov-2的rpa检测方法(非荧光法)
[0033]
1)提前30分钟将tabas03kit试剂盒所需组分取出，室温融化，震荡混匀。
[0034]
2)引物加水溶解，终浓度为10μm。
[0035]
3)每个干粉反应管加入29.4μl a buffer，3μl上游引物、3μl下游引物、7.1μl rnase freeh
2
o，上下颠倒反应管8-10次，充分混合。
[0036]
4)在反应管中加入5μl rna模板和2.5μl b buffer，上下颠倒8-10次混匀，之后将反应液瞬时离心至管子底部，然后立即将反应管放入扩增设备中(如金属浴、pcr仪、恒温扩增仪、实时定量pcr仪等)。
[0037]
5)反应温度28-37℃，反应时间10-30min。
[0038]
6)琼脂糖凝胶电泳检测产物，结果如图1-2所示，从图1可以看出，28℃、37℃都有扩增，但37℃扩增效率更高。图2是n、s基因引物探针组在37℃扩增不同时间的产物电泳图，从图2可以看出，n、s基因扩增10min就可以获得扩增产物，n基因在30min时扩增产物最多，s基因在20min时扩增产物最多。
[0039]
实施例2检测新型冠状病毒sars-cov-2的rt-rpa检测方法
[0040]
1)提前30分钟将taexo02kit试剂盒所需组分取出，室温融化，震荡混匀。
[0041]
2)引物、探针加水溶解，终浓度为10μm。
[0042]
3)每个干粉反应管加入29.4μl a buffer，3μl上游引物、3μl下游引物、2μl探针、5.1μlrnase free h
2
o，上下颠倒反应管8-10次，充分混合。
[0043]
4)在反应管中加入5μl rna模板和2.5μl b buffer，上下颠倒8-10次混匀，之后将反应液瞬时离心至管子底部，然后立即将反应管放入荧光检测设备中(如恒温扩增仪、实时定量 pcr仪等)。
[0044]
5)恒温37℃；每30s采集一次荧光信号(信号采集通道的选择与荧光探针设计一致)荧光值；反应时间30min。
[0045]
6)有扩增曲线为阳性，没有荧光增长为阴性。
[0046]
实施例3引物浓度的优化
[0047]
用10
3
copie/μl质粒标准品进行引物浓度的优化，具体实施方式为：
[0048]
1)提前30分钟将taexo02kit试剂盒所需组分取出，室温融化，震荡混匀。
[0049]
2)引物、探针加水溶解，终浓度为10μm。
[0050]
3)设置四个实验管，每个干粉反应管加入29.4μl a buffer、2μl探针，0.4μm组中加入2μl 上游引物、2μl下游引物，0.6μm组中加入3μl上游引物、3μl下游引物，1.0μm组中加入5μl 上游引物、5μl下游引物，nc组为阴性对照，用适量rnase free h
2
o将体系补足至42.5μl，上下颠倒反应管8-10次，充分混合。
[0051]
4)在反应管中加入5μl rna模板和2.5μl b buffer，上下颠倒8-10次混匀，之后将反应液瞬时离心至管子底部，然后立即将反应管放入荧光检测设备中(如恒温扩增仪、实时定量 pcr仪等)。
[0052]
5)恒温37℃；每30s采集一次荧光信号(信号采集通道的选择与荧光探针设计一
致)荧光值；反应时间30min。
[0053]
结果如图3所示，图3是n基因引物探针组的引物浓度优化图，从图3可以看出，上游引物和下游引物浓度为0.6μm时，扩增效率更高。s基因引物探针组结果类似。
[0054]
实施例4探针浓度的优化
[0055]
用10
3
copie/μl质粒标准品进行探针浓度的优化，具体实施方式为：
[0056]
1)提前30分钟将taexo02kit试剂盒所需组分取出，室温融化，震荡混匀。
[0057]
2)引物、探针加水溶解，终浓度为10μm。
[0058]
3)设置四个实验管，每个干粉反应管加入29.4μl a buffer、3μl上游引物、3μl下游引物，0.2μm组中加入1μl探针，0.4μm组中加入2μl探针，0.6μm组中加入3μl探针，nc 组为阴性对照，用适量rnase free h
2
o将体系补足至42.5μl，上下颠倒反应管8-10次，充分混合。
[0059]
4)在反应管中加入5μl rna模板和2.5μl b buffer，上下颠倒8-10次混匀，之后将反应液瞬时离心至管子底部，然后立即将反应管放入荧光检测设备中(如恒温扩增仪、实时定量 pcr仪等)。
[0060]
5)恒温37℃；每30s采集一次荧光信号(信号采集通道的选择与荧光探针设计一致)荧光值；反应时间30min。
[0061]
结果如图4所示，图4是n基因引物探针组的探针浓度优化图，从图4可以看出，探针浓度为0.4μm时，扩增效率更高。s基因引物探针组结果类似。
[0062]
实施例5检测新型冠状病毒sars-cov-2的灵敏度实验
[0063]
用250copies/ml、500copies/ml、1000copies/ml和2500copies/ml质粒标准品进行检测灵敏度实验，具体实施方式为：
[0064]
1)提前30分钟将taexo02kit试剂盒所需组分取出，室温融化，震荡混匀。
[0065]
2)引物、探针加水溶解，终浓度为10μm。
[0066]
3)每个干粉反应管加入29.4μl a buffer，3μl上游引物、3μl下游引物、2μl探针、5.1μlrnase free h
2
o，上下颠倒反应管8-10次，充分混合。
[0067]
4)在各个反应管分别加入5μl不同浓度的rna模板和2.5μl b buffer，阴性对照中加入 5μl rnase free h
2
o，上下颠倒8-10次混匀，之后将反应液瞬时离心至管子底部，然后立即将反应管放入荧光检测设备中(如恒温扩增仪、实时定量pcr仪等)。
[0068]
5)恒温37℃；每30s采集一次荧光信号(信号采集通道的选择与荧光探针设计一致)荧光值；反应时间30min。
[0069]
检测结果如图5和图6所示，其中图5表示n基因的引物探针组的灵敏度检测结果，图 6表示s基因引物探针组的灵敏度检测结果。结果显示最快5分钟明显有扩增，10分钟内所有标准工作品均有扩增，最低灵敏度可以达到250copies/ml，表明本发明灵敏度高，检测时间短。
[0070]
实施例6检测新型冠状病毒sars-cov-2的特异性实验
[0071]
特异性实验中样本选择为常见的呼吸道病毒及细菌和人类冠状病毒，具体为：冠状病毒 hku1，oc43，nl63和229e、人鼻病毒、合胞病毒及新型冠状病毒sars-cov-2。其中冠状病毒hku1，oc43，nl63和229e、人鼻病毒、合胞病毒以及新型冠状病毒sars-cov-2 样本核酸由中国疾病预防控制中心提供。具体实验中采用的样本为含新型冠状病毒目的基因片
段的标准阳性质粒，其它为分别含冠状病毒hku1，oc43，nl63和229e、人鼻病毒、合胞病毒特征基因片段的标准物质，实验步骤如下：
[0072]
1)提前30分钟将taexo02kit试剂盒所需组分取出，室温融化，震荡混匀。
[0073]
2)引物、探针加水溶解，终浓度为10μm。
[0074]
3)每个干粉反应管加入29.4μl a buffer，3μl上游引物、3μl下游引物、2μl探针、5.1μlrnase free h
2
o，上下颠倒反应管8-10次，充分混合。
[0075]
4)在各个反应管分别加入5μl不同浓度的rna模板和2.5μl b buffer，阴性对照中加入 5μl rnase free h
2
o，上下颠倒8-10次混匀，之后将反应液瞬时离心至管子底部，然后立即将反应管放入荧光检测设备中(如恒温扩增仪、实时定量pcr仪等)。
[0076]
5)恒温37℃；每30s采集一次荧光信号(信号采集通道的选择与荧光探针设计一致)荧光值；反应时间30min。
[0077]
检测结果如图7和图8所示，其中图7表示n基因的引物探针组的特异性检测结果，图 8表示s基因引物探针组的特异性检测结果。结果显示出现扩增曲线的为含新型冠状病毒目的基因片段的标准阳性质粒，其余特异性参考品均无扩增曲线，表明该检测方法的特异性良好。
[0078]
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

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