益生菌组合物及其制造方法和用途与流程

[0001]
本发明涉及一种繁殖，维持或保存微生物或其组合物的方法，尤其是一种保存或维持活的微生物；另涉及一种动物饲料的成型或建立，尤其是通过聚结成型；通过制粒成型。


背景技术：

[0002]
一种乳酸菌及其用途，可以于养殖环境中维持生长、有助于鱼类的生长及免疫力提升及提供一种乳酸益生菌于水产养殖的用途，其将乳酸益生菌用于提升养殖生物的生长及免疫力，以提升养殖鱼类的收成，唯仍有实际使用上的限制，由于益生菌无法耐高温，无法将益生菌菌株直接放入饲料的制程，而须待饲料制造后再进行后喷，将益生菌喷洒于饲料的表面上，但这是费时又费工，且会增加饲料的成本，且也需要考虑当饲料一但碰到水时，其喷洒在表面的益生菌会有多少保留在饲料上面，及室外酷热环境等因素，正是目前需要解决的重要问题。
[0003]
于养殖环境中，抗生素滥用会使致病菌的耐药性增加，严重破坏了养殖水体中正常细菌相的平衡，无论是在水产养殖生产和水产质量安全上皆带来极大的忧虑。若为了减少因氨氮及亚硝氮等危害，在养殖过程中而采用的方式有换水、曝气等来处理，不过由于这些方法的作用效果持续时间短且成本高，具有很大的局限性。
[0004]
若要长期室温保存益生菌，目前有2种方法，一是可形成内孢子的细菌，只有少数菌种可以，二是冷冻干燥，此种方法需要保护剂，但不是所有的细菌都有适合的冷冻保护剂可以使用。
[0005]
一般饲料在制作过程中，至少要加热至80℃以上，甚至到120℃以上，益生菌无法耐高温，可将益生菌诱导形成内孢子，再进入制作过程中，但只有少数菌种可以达到。
[0006]
通过益生菌与藻酸盐基质，再利用植物油和聚山梨醇酯80(tween-80)将此混合液微胶囊化，此微胶囊仅可用于增强在酸和胆汁中以及短暂加热的存活。


技术实现要素：

[0007]
本发明所欲解决的问题：
[0008]
1.益生菌长期保存的问题：若要室温长期保存益生菌，目前有2种方法，一是可形成内孢子的细菌，只有少数菌种可以，二是冷冻干燥，此种方法需要保护剂，但不是所有的细菌，都有适合的保护剂可以使用。
[0009]
2.益生菌耐高温的问题：饲料在制作过程，至少要加热至80℃以上，甚至到120℃以上，因此若要在饲料中加入益生菌，目前有2种方法，一是将益生菌诱导形成内孢子，再进入制程，但只有少数菌种可以达到，二是饲料制作完成后，才再将益生菌喷在饲料上面，但这是费时又费工，并且会增加饲料的成本。
[0010]
3.在水产养殖方面的问题，影响水产养殖产量的重要因素为疾病，此原因使得造成大量损失，因此当养殖业面临疾病问题时，养殖业常使用抗生素加以治疗，但可能会导致
具有抗药性的菌株出现，来自养殖生物的特定抗药性的基因能够以特殊方式进入与人体健康有关的细菌中，后续并通过食物链的方式，具有抗药性的细菌也会危害到食物链后端的人类们，因此进而造成人类的健康问题，故必须寻求其他方式以维持养殖生物的健康，而益生菌是一项值得关注的方向。
[0011]
为达成上述的目的，本发明公开了一种益生菌组合物的制造方法，包括：一菌液，其为细菌或布拉酵母菌中的一种或一种以上菌液，该菌液与该海藻酸钠溶液或海藻酸溶液以5：1至1：10之间的重量百分比混合；及加入一钙离子溶液中，直至使其固定成形。
[0012]
如上所述，其中该海藻酸钠或海藻酸占该溶液的重量比例为1％～10％。
[0013]
如上所述，其中钙离子固形物占该钙离子溶液的重量比例为0.5％～5％。
[0014]
如上所述，其中该细菌为希瓦氏菌(shewanella sp.)、潘朵拉菌(pantoea sp.)、假单胞菌(pseudomonas sp.)、光合菌、硝化菌、乳酸菌(lactic acid bacteria)、双歧杆菌(bifidobacterium sp.)或芽孢杆菌(bacillus sp.)。
[0015]
如上所述，其中该钙离子溶液为氯化钙溶液、乳酸钙溶液、碳酸钙溶液、醋酸钙溶液、柠檬酸钙溶液或草酸钙溶液其中一种以上的任意组合。
[0016]
为达成上述的目的，本发明另公开了一种益生菌组合物，其由上述益生菌组合物的制造方法所制得。
[0017]
如上所述，一种益生菌组合物在用于饲料制造中的用途，经制造为粒状物后加入一般饲料制程中制作成为饲料。
[0018]
如上所述，一种益生菌组合物在用于口服益生菌制造中的用途，经制造成形为粒状物供人类食用。
[0019]
如上所述，一种益生菌组合物在常温下保存菌株中的用途，其中益生菌组合物菌株于常温15～35℃下保存36个月，仍有菌株存活。
[0020]
如上所述，一种益生菌组合物在高温处理下保存菌株中的用途，经121℃处理6分钟、95℃处理10分钟或65℃处理24小时，其中益生菌组合物菌株经高温处理后仍有菌株存活。
[0021]
本发明的功效主要显现在于：在现有技术中，仅能让可形成内孢子的少数菌种的益生菌具有在室温下长期保存和耐高温的特性，其他一般菌株皆须以冷冻并辅以抗冻剂做保存其菌株存活。而本发明克服现有技术中存在的问题点或困难性，可以让所有细菌菌株及布拉酵母菌具有可在室温下长期保存和耐高温的特性。
[0022]
水产养殖环境大多高温，夏季温度有可能高到40度，许多菌株放在室温后，菌种就会死亡，通过本发明的益生菌组合物除了应用于可形成内孢子的细菌外，亦可使用于不具内孢子的细菌，并且经由本发明的益生菌组合物的制造方法使得益生菌不仅可在常温保存36个月，亦可克服在饲料制作需80℃以上，更甚至到120℃以上的加热程序，又或者是酷热的室外环境，亦不需使用冷冻保存。因此，应用本发明将益生菌组合物混入饲料作为活微生物饲料的添加物，或经由水产动物通过食入带有益生菌的活微生物饲料的添加物，比用来增强动物或人们的免疫力、调整肠道机能、减少抗生素及药物使用的现有方式可更有效。
附图说明
[0023]
图1为本发明益生菌组合物的制造方法流程图，其中步骤-s100～s400。
具体实施方式
[0024]
饲料营养是增进水中生物成长及维持其健康的重要因素，必须营养素如产能营养素(如蛋白质与氨基酸、碳水化合物、脂质与必需脂肪酸)、维生素(维生素a、维生素c、维生素e)、矿物质(磷、铁、硒)，另有其他非营养物质如免疫赋活剂(疫苗、佐剂、葡萄聚醣、核苷酸、动物性萃取物、植物性萃取物、左美素)及益生菌。
[0025]
微生物制剂由单一或复合式的益生菌组成，益生菌(probiotics)，是可以促进肠道菌种的平衡，增加宿主健康的活的微生物，目前广泛的定义为应用到人类或其他动物，通过改善肠内微生物相平衡而有益于宿主的活菌，不论是单一或混合菌株，都可视为益生菌。
[0026]
益生菌可用作为一种生物制剂，通过投喂方式来改善肠胃道的菌相、酵素消化作用、病源微生物的抑制、抗突变和抗癌的活化、增加免疫反应等。
[0027]
表1中列出水中的益生菌(martnez cruz et al.，2012)，定义为能分泌有利于宿主的抗菌物质、与病原菌互相竞争排斥、并且能改善饲料利用率及提供营养价值，也运用在改善水质及增加抗病能力等方面。目前可用在水产养殖上的益生菌种类有许多，并有研究表示特定的益生菌株甚至可稳定水质，让养殖生物可以增加其换肉率，或提高抗病能力等效果。
[0028]
表1益生菌在水产养殖中的应用
[0029]
t
abif 1：different applications of probiotics in aqnaculture.
[0030][0031]
在大面积养殖环境中，饲料中添加抗生素是一种控制疾病最有效的策略，施以药物可用于诊断、预防或治疗疾病。
[0032]
如图1所示，本发明提供一种益生菌组合物的制造方法，将细菌或布拉酵母菌中的一种或一种以上菌液与一海藻酸钠或海藻酸溶液，菌液与海藻酸钠溶液或海藻酸溶液以5∶1至1∶10之间的重量百分比混合(s100)，及加入一钙离子溶液(s200)，持续滴加至钙离子溶液中直至使其固定成形(s300)，亦可进一步进行干燥程序(s400)。
[0033]
实施例1
[0034]
本发明提供一种益生菌组合物的制造方法，将布拉酵母菌菌液与一海藻酸钠溶液，其中海藻酸钠占该海藻酸钠溶液的重量比例为1％～10％，钙离子固形物占该钙离子溶
液的重量比例为0.5％～5％，该菌液与该海藻酸钠溶液以2∶1的重量百分比混合，持续滴加至钙离子溶液中直至使其固定成形，并进行干燥程序。
[0035]
实施例2
[0036]
本发明提供一种益生菌组合物的制造方法，将潘朵拉菌、乳酸菌及酵母菌布拉酵母菌菌液与一海藻酸钠溶液，该三种菌液混合后与该海藻酸溶液以1∶3的重量百分比混合，另外添加养殖所需的产能营养素(矿物质磷)及其他非营养物质(动物性萃取物，如鱼粉、肉骨粉、扇贝萃取物)，持续滴加至钙离子溶液中直至使其固定成形，亦可进一步进行干燥程序。
[0037]
本发明的益生菌组合物的制造方法，其中海藻酸钠或海藻酸占该溶液的重量比例为1％～10％，较佳为1％～6％，最佳为1％～5％。
[0038]
本发明的益生菌组合物的制造方法，其中钙离子固形物占该钙离子溶液的重量比例为0.5％～5％，较佳为1～3％，最佳为1.5～2.5％。
[0039]
目前商业用途较常使用的益生菌，包含细菌类有二种，即嗜酸性乳酸菌(lactobacillus acidophilus)及比菲德氏菌(bifidobacterium，即bifidus，又称双叉杆菌或是双歧杆菌)；另外，酵母菌(yeast)则有一种有益的酵母菌属的布拉酵母菌(学名：saccharomyces boulardii)可以用来治疗一些由细菌所导致的腹泻和感染性肠炎。
[0040]
本发明所述的菌液包含适用于所有的细菌，另适用于布拉酵母菌，因此可将任一种细菌与布拉酵母菌菌液混合使用，或任两种细菌混合使用，又或者是将任两种以上细菌与布拉酵母菌菌液混合使用。
[0041]
如上所述，较佳为使用希瓦氏菌、潘朵拉菌、假单胞菌、光合菌、硝化菌、乳酸菌、双歧杆菌、芽孢杆菌及布拉酵母菌。
[0042]
希瓦氏菌(shewanellasp.)，为革兰氏阴性杆菌，属兼性厌氧菌，无孢子产生，周身纤毛且具单鞭毛，长度2～3μm，直径0.4～0.7μm。
[0043]
本发明的益生菌组合物的制造方法，其中该钙离子溶液为氯化钙溶液、乳酸钙溶液、碳酸钙溶液、醋酸钙溶液、柠檬酸钙溶液或草酸钙溶液其中一种以上的任意组合，因此益生菌组合物的制造方法的过程中可同时混合使用不止一种钙溶液，使得该菌液与该海藻酸钠溶液或海藻酸溶液经混合的海藻酸钠菌液或海藻酸菌液后，滴入混合的钙溶液时可固定成形，亦可进一步进行干燥程序。
[0044]
人体的健康与肠道内的益生菌群结构息息相关，菌群中不同种类之间，菌群与宿主之间，菌群、宿主与环境之间，某一种或复数种微生物当喂食予人类或动物时可增进其肠内菌丛的质量，若菌群结构相对稳定，本发明益生菌组合物中为优势菌株，对在宿主中的表现有提高作用。
[0045]
该钙离子溶液较佳实施方式可另经过杀菌程序以提高本发明益生菌组合物在宿主中为优势菌株。
[0046]
如上所述，该钙离子溶液较佳可选用氯化钙溶液。
[0047]
lb培养基(luria-bertanibroth，lb)，是微生物学实验中最常使用的营养性培养基，用于培养大肠杆菌等细菌，分为液态培养基和加入琼脂而制成的固态培养基。
[0048]
磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate buffered saline，简称为pbs)，具有维持渗透压的能力，且对细胞无毒性，是生物学研究中常用的缓冲液，10倍(10x)pbs为常见的磷酸盐
缓冲生理盐水浓缩配制方法。
[0049]
菌液包埋方式为通过将菌液及海藻酸钠溶液或海藻酸溶液的混合溶液，利用重力、喷雾或其他一般方式向下滴入钙离子溶液后可固定成形为颗粒状，或也可利用滴入钙离子溶液中的特殊模具而固定成形为不特定形状，另也可先将菌液及海藻酸钠溶液或海藻酸溶液的混合溶液先装入模具后再置入钙离子溶液固定成形。
[0050]
如上所述，菌液及海藻酸钠溶液或海藻酸溶液的混合溶液较佳可选用调控液滴大小滴下至钙离子溶液固定成形。
[0051]
如上所述，菌液及海藻酸钠溶液或海藻酸溶液的混合溶液较佳可选用等速滴下至钙离子溶液固定成形。
[0052]
实施例3
[0053]
本发明将3wt％的海藻酸钠溶液和水产用益生菌液以重量百分比1∶2的比例混合均匀，益生菌液如：希瓦氏菌、潘朵拉菌、假单胞菌、乳酸菌、双歧杆菌、酵母菌或芽孢杆菌等，再滴入2.5wt％的氯化钙溶液中，使其固定成形后进行干燥，加入一般饲料制程中制作成为水产养殖饲料。
[0054]
实验方法
[0055]
希瓦氏菌菌液培养
[0056]
(1)药品配制：
[0057]
实验药品：lb培养基、琼脂(agar)、海藻酸钠、氯化钙、pbs(10x)ph 7.4
[0058]
lb培养基：用一次水配制含有10g/l胰蛋白胨(tryptone)和5g/l酵母粉(yeast extract)及5g/l氯化钠(nacl)。
[0059]
(2)实验步骤：
[0060]
挑希瓦氏菌的单一菌落置入5ml lb培养基，以37℃震荡培养16小时，将5ml倒入1l lb培养基，37℃震荡培养16小时，以分光光度计于波长600nm，利用lb培养基将菌液稀释至吸光值为1.8，即得菌液。
[0061]
益生菌菌液包埋
[0062]
(1)药品配制：
[0063]
(a)海藻酸钠溶液：取30g海藻酸钠溶于1000ml一次水中。
[0064]
(b)氯化钙溶液：取25g氯化钙溶于1000ml一次水中。
[0065]
(2)实验步骤：
[0066]
各取出菌液及海藻酸钠溶液以1∶2的重量百分比混合均匀后，利用重力滴入下方氯化钙溶液中，使其固定成形，以37℃烘干，做进行测试。
[0067]
耐热性测试
[0068]
(1)药品配置：
[0069]
(a)lb培养基：用一次水配置含有10g/l胰蛋白胨和5g/l酵母粉及5g/l氯化钠的lb培养基。
[0070]
(b)lb平盘培养基：8g lb培养基与6g琼脂混合，以一次水定量至400ml，灭菌后倒入培养皿后备用。
[0071]
(c)1
×
pbs：利用10x pbs(1.37m nacl、0.1m na
2
hpo
4
、27mm kcl、18mm kh
2
po
4 ph7.4)以一次水稀释至1倍。
[0072]
(2)实验步骤：
[0073]
将经过干燥后的希瓦氏菌干燥菌球在室温存放一年后，将一颗通过益生菌菌液包埋的干燥菌球及1ml的菌液以121℃处理6分钟后，将干燥菌球置入1ml 1
×
pbs，分别于0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5及4小时，分别取100μl涂lb平盘培养基，以37℃培养24小时后，计算菌落数。
[0074]
希瓦氏菌(液)：为液态希瓦氏菌菌液；
[0075]
希瓦氏菌(干)：为希瓦氏菌干燥菌球。
[0076]
实验结果
[0077]
经121℃处理6分钟后分别于0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5及4小时取样，仍有细菌存活。结果如下表2所示。
[0078]
表2、液态希瓦氏菌菌液及希瓦氏菌干燥菌球释放存活菌数的测试
[0079][0080][0081]
实施例4
[0082]
通过本发明上述益生菌组合物的制造方法，通过一菌液，其为细菌或布拉酵母菌中的一种或一种以上菌液，该菌液与该海藻酸钠溶液或海藻酸溶液以5∶1至1∶10之间的重量百分比混合；及加入该钙离子溶液中，直至使其固定成形可制造而成本发明的益生菌组合物。
[0083]
实施例5
[0084]
由本发明益生菌组合物的制造方法，经制造为益生菌组合物后可添加入水产饲料
或动物饲料的一般常见制程中制作成为饲料。
[0085]
实施例6
[0086]
由本发明益生菌组合物的制造方法，经制造为益生菌组合物后可添加入人类食品或保健品中供人类食用。
[0087]
经实施例3实验结果显示，该益生菌组合物于常温下保存菌株，其中益生菌组合物菌株于常温15～35℃下保存36个月，仍有菌株存活。
[0088]
经实施例3实验结果显示，该益生菌组合物于高温处理下保存菌株，经121℃处理6分钟、95℃处理10分钟或65℃处理24小时，其中益生菌组合物菌株经高温处理后仍有菌株存活。
[0089]
本发明为呈现解决问题所采用的技术手段较佳实施方式或实施例而已，并非用来限定本发明专利实施的范围，即凡与本发明专利申请范围文义相符，或依本发明专利范围所作的均等变化与修饰，皆为本发明专利所涵盖。

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