新型血管生成素2，VEGF双特异性拮抗剂的制作方法

新型血管生成素2，vegf双特异性拮抗剂
交叉引用的申请
[0001]
本申请要求2016年5月13日提交的美国临时申请号62/336,552、2017年2月14提交的美国临时申请号62/459,046和2017年1月21日提交的美国临时申请号62/448,998的权益，其每一篇通过引用整体并入本文。本申请还要求于2017年5月11日提交的美国专利申请us20170327569a1的优先权，其全部内容通过引用合并在内。本申请进一步要求于2018年4月10日提交的美国专利申请62/655,436的优先权，其全部内容通过引用合并在内。


背景技术：

[0002]
本申请涉及包含与vegf和ang2两者结合的结构域的新型分子。
[0003]
血管生成与多种疾病的发病机理有关，包括实体瘤，眼内新血管综合征(例如增生性视网膜病或年龄相关性黄斑变性(amd)，类风湿性关节炎和牛皮癣)(folkman，j.等，j.biol.chem.267(1992)10931-10934；klagsbrun，m.等，annu.rev.physiol.53(1991)217-239；和garner，a.，血管疾病，参见：《眼病病理生物学，一种动态方法》，garner，a.和klintworth，g.k.(编辑)，第二版，marcel dekker，纽约(1994)，页码1625-1710)。在实体瘤的情况下，与正常细胞相比，新血管形成可使肿瘤细胞获得生长优势和增殖自主性。因此，已经观察到肿瘤切片中的微血管密度与多种癌症患者的存活率之间存在相关性(参见，例如，weidner，n.等，n engl j med.324(1991)1-8；horak，e.r.等，lancet 340(1992)1120-1124；和macchiarini，p.等，lancet 340(1992)145-146)。
[0004]
人血管内皮生长因子(vegf/vegf-a)描述于，例如，leung，d.w.等，science 246(1989)1306-9；keck，p.j.等，science 246(1989)1309-12和connolly，d.t.等，j.biol.chem.264(1989)20017-24。应对缺氧vegf的表达是增强的，通过激活的癌基因和多种细胞因子。血管内皮生长因子参与调节与肿瘤和眼内疾病有关的正常和异常的血管生成和新血管形成(ferrara，n.等，endocr.rev.18(1997)4-25；berkman，r.a.等，j.clin.invest.91(1993)153-159；brown，l.f.等，人类病理.26(1995)86-91；brown，l.f.等，cancer res.53(1993)4727-4735；mattem，j.等，brit.j.cancer.73(1996)931-934；和dvorak，hf.等，am.j.pathol.146(1995)1029-1039)。
[0005]
失调的vegf表达通过促进肿瘤血管生成而促进实体瘤的发展，并且也是以血管生成异常为特征的其他几种疾病的病因(kim，k.j.等，1993.自然(伦敦)362，841-844；millauer，b.等，1994年.自然(伦敦)367，576-579)。因此，抑制vegf信号传导可以消除多种肿瘤的发展。
[0006]
在视网膜病变中，视网膜的局部或普遍缺血伴随着vegf的过度表达和血管过度增生，可能会导致失明(aiello，l.p等，1994.n.engl.j.med.331，1480-1487；adamis，a.p.等，am.j.眼科.118，445-450)。在这种疾病状态下抑制vegf的表达可以治疗或预防失明的产生。
[0007]
在maisonpierre，pc等，science 277(1997)55-60和cheung，ah等，genomics48(1998)389-91中描述了人血管生成素2(ang-2或ang-2或ang2)(或者缩写angpt2或ang2)。
ang2在血管生成中起重要作用，其表达水平与癌症和眼部疾病相关(gerald d等，cancer res.2013，73(6)：1649-57；watanabe等，am j ophthalmol.2005，139(3)：476-81)。
[0008]
在最近的一项临床试验中，双重拮抗剂rg7716被证实疗效优于vegf拮抗剂兰尼单抗。然而，考虑到对眼睛的给药量通常较低(例如50微升)，rg7716报道的剂量为每剂6mg已经相当高。这可能需要120mg/ml的浓度，对制剂开发是一个重大挑战。需要对vegf和/或ang2具有更强结合亲和力的双重拮抗剂。本发明包括具有增强的结合能力的双特异性分子，并且用本发明公开的分子治疗的患者的疾病严重性降低。发明概述
[0009]
本

技术实现要素：
涉及新型双特异性嵌合分子，其包含与vegf和ang-2两者结合的结构域。进一步还公开了使用所述嵌合分子治疗癌症，增生性视网膜病，新生血管性青光眼，黄斑水肿，湿性年龄相关性黄斑变性(wamd)，视网膜静脉闭塞后黄斑水肿(rvo)，糖尿病性黄斑水肿(dme)或糖尿病性视网膜病变(dr)患者的方法。
[0010]
在一些方面，所述嵌合分子包含一个或两个vegf结合部分和一个或两个ang-2拮抗剂肽，其中：a)所述ang-2拮抗剂肽包含选自seq id no：8-14的氨基酸序列；和b)所述vegf结合部分是抗体，fab或scfv；其中所述抗体，fab或scfv包含衍生自具有seq id no：4所示氨基酸序列的轻链或衍生自具有seq id no：6所示氨基酸序列的scfv的轻链cdrs，和衍生自具有seq id no：5所示氨基酸序列的重链，或衍生自具有seq id no：6所示氨基酸序列的scfv的重链cdrs。
[0011]
在一些实施方案中，所述vegf结合部分包含具有与seq id no：4至少有95％同一性氨基酸序列的轻链和与seq id no：7至少有99％同一性氨基酸序列的重链的抗体。
[0012]
在一些实施方案中，所述ang-2拮抗剂肽可选的通过肽接头与所述抗体的重链的n-末端(hc)之一或两个融合。在一些实施方案中，肽-hc融合多肽包含与选自seq id no：29、30和33具有至少99％同一性的氨基酸序列。
[0013]
在一些实施方案中，所述ang-2拮抗剂肽通过肽接头与所述抗体重链的c-末端融合。在一些实施方案中，ang-2拮抗剂肽-重链融合多肽包含与选自seq id no：31、32和34中之一的氨基酸序列具有至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
[0014]
在一些实施方案中，所述ang-2拮抗剂多肽通过肽接头与所述抗体重链的n末端或c末端融合；其中ang-2拮抗肽-重链融合多肽包含与选自seq id no：37、39、41、43、45、47、49、51和53中之一具有至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
[0015]
在一些实施方案中，所述vegf结合部分是具有与seq id no：4有至少95％同一性的轻链氨基酸序列和与seq id no：5有至少95％同一性的重链氨基酸序列的fab。
[0016]
在一些实施方案中，ang2拮抗剂肽通过肽接头与所述fab分子的重链的n-末端融合。在一些实施方案中，ang2拮抗剂肽-重链融合多肽具有与seq id no：19或seq id no：20有至少99％同一性的氨基酸序列。
[0017]
在一些实施方案中，ang-2拮抗剂肽通过肽接头与所述fab分子的重链的c末端融合。在一些实施方案中，肽-重链融合多肽具有与seq id no：25或seq id no：26有至少99％同一性的氨基酸序列。
[0018]
在一些实施方案中，所述vegf结合部分是具有与seq id no：6有至少95％同一性
的氨基酸序列的scfv。在一些实施方案中，将ang-2拮抗剂肽融合至scfv的n-末端；其中肽-scfv融合物具有如seq id no：21或22所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，ang-2拮抗剂肽与scfv的c-末端融合；其中肽-scfv融合多肽具有如seq id no：27或28所示的氨基酸序列。
[0019]
在某些方面，所述嵌合分子包含具有一个或多个vegf结合部分和一个或两个ang-2拮抗剂肽的融合蛋白，其中所述vegf结合部分是与seq id no：3具有至少95％同一性的氨基酸序列的vegf捕获剂；其中所述嵌合分子包含两条相同的多肽链，其具有与选自seq id no：15-17、23和24中之一有至少99％一致性的氨基酸序列。
[0020]
还公开了编码上述任何一种嵌合分子的一种或多种多核苷酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含选自seq id no：35、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54和56中的一种的dna序列。
[0021]
还公开了包含上述一种或多种多核苷酸的一种或多种表达载体。
[0022]
还公开了包含上述载体的宿主细胞。
[0023]
还公开了一种制备上述任何一种嵌合分子的方法，该方法包括在允许该嵌合分子表达的条件下培养上述宿主细胞，并分离该嵌合分子。
[0024]
还公开了一种药物组合物，其包含上述嵌合分子中的任一种和药学上可接受的赋形剂。
[0025]
进一步提供了一种治疗患有癌症，增生性视网膜病，湿性年龄相关性黄斑变性(wamd)，视网膜静脉阻塞后黄斑水肿(rvo)，糖尿病性黄斑水肿(dme)或糖尿病性视网膜病(dr)的患者的方法，包括对受试者施用上述药物组合物。附图简述
[0026]
图1为蛋白质a亲和色谱。将大约150ml瞬时表达amd-b的澄清hek293细胞培养基以3ml/min的速度加到proteina色谱柱(captivaproteina树脂1
×
17cm(直径
×
高度))上。用平衡缓冲液(25mm tris buffer，100mm nacl，ph约7.2)平衡蛋白a柱。用平衡缓冲液洗涤色谱柱，并用ph为4的2m精氨酸溶液洗脱。
[0027]
图2为由octet red96分析的ang-1或ang-2与amd-e结合的动力学。
[0028]
图3为amda-e与vegf的结合。
[0029]
图4a为由amd-a和amd-b阻断ang-1和ang-2与tie-2的结合。
[0030]
图4b为由amd-c和amd-d阻断ang-1和ang-2与tie-2的结合。
[0031]
图5为由askb712-o和askb712-o2阻断ang-2与tie-2的结合。发明详述
[0032]
本文公开的融合蛋白和嵌合分子，其包含两个组分：可选择的连接至vegf结合域的ang-2拮抗剂肽，vegf结合域选自抗-vegf抗体，抗-vegf fab，抗-vegf scfv或vegf受体胞外域-fc融合蛋白(或vegf捕获剂)。ang-2拮抗剂肽和vegf结合域分别在下文关于与参考序列的同一性百分比做了定义。还进一步公开了使用所述嵌合分子治疗癌症，增生性视网膜病，新生血管性青光眼，黄斑水肿，湿性年龄相关性黄斑变性(wamd)，视网膜静脉阻塞后黄斑水肿(rvo)，糖尿病性黄斑水肿(dme)或糖尿病性视网膜病变(dr)的患者的方法。
[0033]
应当理解，本文描述的本发明的内容和变型包括内容和变型的“组成”和/或“基本由其组成”。
定义
[0034]
如本文和权利要求书中所使用的，单数形式“一个”，“或”和“该”包括复数参照物，除非上下文另外明确指出。
[0035]
本文“约”值或参数包括(并描述)针对该值或参数本身的变化。例如，涉及“约x”的描述包括对“x”的描述。另外，在任何系列的数字前面使用“约”包括该系列中每个所述的数字“约”。例如，提及“大约x，y或z”的描述旨在描述“大约x，大约y或大约z”。
[0036]
术语“抗原结合部分”是指与抗原特异性结合的多肽或一组相互作用的多肽，并且包括但不限于抗体或抗体片段，例如单克隆抗体，多克隆，嵌合抗体，cdr移植抗体，人源化抗体，fab，fab
′
，f(ab
′
)
2
，fv，二硫键连接的fv，scfv，单域抗体(dab)，双抗体，多特异性抗体，双特异性抗体，抗独特型抗体，双特异性抗体，其功能活性表位结合片段，双功能杂交抗体，单链抗体和含fc的多肽，例如免疫粘附素。在一些实施方案中，抗体可以是任何重链亚型(例如，igg，iga，igm，ige或igd)。在一些实施方案中，抗体可以是任何轻链亚型(例如，κ或γ)。抗体可以是非人类的(例如，来自小鼠，山羊或任何其他动物)，完全人类的，人源化的或嵌合的。在一些实施方案中，抗体是衍生抗体。
[0037]
本文所用的术语“有效量”是指足以治疗特定异常，症状或疾病，例如改善，减轻，减少和/或延迟一种或多种症状的化合物或组合物的量。关于诸如癌症的疾病，有效量包括足以引起肿瘤缩小和/或降低肿瘤的生长速率(例如抑制肿瘤生长)或预防或延迟癌症中其他不需要的细胞的增殖。在一些实施方案中，有效量是足以延迟癌症发展的量。在一些实施方案中，有效量是足以预防或延迟复发的量。有效量可以是一次或多次施用。在癌症的情况下，药物或组合物的有效量可以：(i)减少上皮样细胞的数量；(ii)缩小肿瘤大小；(iii)在某种程度上抑制，延迟，减慢，更好是阻止癌细胞浸润到周围器官中；(iv)抑制(例如，在某种程度上减慢，更好是停止)肿瘤转移；(v)抑制肿瘤生长；(vi)预防或延迟肿瘤的发生和/或复发；和/或(vii)在某种程度上缓解了与癌症有关的一种或多种症状。
[0038]
术语“融合”或“融合体”是两个或更多个多肽序列(例如抗体重链，抗体轻链，抗体重链片段，抗体轻链片段，药物缀合部分，异源肽，白蛋白或白蛋白片段)通过主链肽键将多肽序列连接。
[0039]
术语“药学上可接受的”当用于指化合物或组合物时，是指该化合物或组合物适合施用于受试者，包括人类受试者，以实现本文所述的治疗，并鉴于疾病的严重程度和治疗的必要性，没有产生过度的有害副作用。
[0040]
术语“受试者”是指哺乳动物，包括但不限于人，牛，马，猫，犬，啮齿动物或灵长类动物。
[0041]
如本文所用，“疗法”或“治疗”是用于获得有益或期望结果包括临床结果的方法。就本发明的目的而言，有益的或期望的临床结果包括但不限于以下一种或多种：缓解一种或多种由疾病引起的更多症状，减轻疾病的程度，稳定疾病(例如，预防或延缓疾病的恶化)，预防或延迟疾病的扩散(例如转移)，预防或延缓疾病的复发疾病，延缓或减缓疾病的进展，改善疾病状态，缓解(部分或全部)疾病，减少治疗疾病所需的一种或多种其他药物的剂量，延缓疾病的进展，提高生活质量和/或延长生存期。“治疗”还包括减少疾病(例如癌症)的病理结果。本发明的方法涵盖了治疗的这些方面中的任何一个或多个。
[0042]
应当理解，本文描述的各种实施方式的一个，一些或全部性质可以组合以形成本
发明的其他实施方式。
[0043]
本文使用的章节标题仅用于组织的目的，而不应解释为限制所描述的主题。ang-2拮抗肽
[0044]
融合蛋白或嵌合分子包含ang-2拮抗剂肽组分，其与血管生成素2(ang-2)结合并抑制ang-2与其受体的结合。肽的一个实例被称为2xcon4(c)，如wo2004/092215a2或wo03/05134a2中所述。2xcon4(c)具有如seq id no：1所示的氨基酸序列。ang-2结合肽的其他实例包括但不限于：l-1-21，l1-7，l1-10和l1-15，如wo2004/092215a2中所描述的。ang-2拮抗剂肽的实例显示在seq id no：8-14中。vegf结合部分
[0045]
嵌合分子还包含vegf结合部分。在一个实施方案中，所述vegf结合部分是抑制vegf与其受体结合的抗vegf抗体，抗vegf fab或抗vegf scfv。vegf抗体的一个实例是贝伐单抗，其具有两条具有如seq id no：1所示的氨基酸序列的重链和两条具有如seq id no：2所示的氨基酸序列的轻链。另一个例子是兰尼单抗，一种抗vegf fab。第三个例子是溴珠单抗(rth258)，它是抗vegf的人源化单链抗体片段(scfv)。
[0046]
在另一个实施方案中，所述vegf结合域是“捕获”vegf(这里称为“vegf捕获剂”)并与天然存在的vegf细胞受体竞争抑制vegf的vegf受体-fc融合蛋白。vegf-受体fc融合蛋白的一个实例是阿柏西普，其具有如seq id no：3所示的氨基酸序列。
[0047]
在一些实施方案中，vegf结合部分包含溴珠单抗(rth258)，雷珠单抗或贝伐单抗的六个互补决定区(cdrs)。许多cdr的描述是本领域已知的，并且包含在本文中。本领域技术人员可以基于重链或轻链可变区的序列容易的确定给定描绘的cdr。“kabat”互补决定区(cdr)是基于序列可变性并且是最常用的(kabat等人，免疫学感兴趣的蛋白质序列，第5版，公共卫生服务，国家卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州(1991))。“chothia”cdr是指结构环的位置(chothia和lesk，免疫球蛋白的高变区的标准结构，j.mol.biol.卷196，第901-917页(1987))。“abm”cdr代表了kabat cdr和chothia结构环之间的折衷，并被牛津分子公司的abm抗体建模软件使用。“接触”cdr是基于对可变复杂晶体结构的分析。参考常用的抗体编号方案，这些cdr的每个残基在下表1中列出。除非本文另有说明，否则抗体的氨基酸编号是指如上文kabat等人所述的kabat编号方案，包括当参照kabat，chothia，abm或contact方案进行cdr描述时。使用该编号系统，实际的线性氨基酸序列可以包含较少或额外的氨基酸，其对应于可变域的框架区(fr)或cdr区的缩短或插入。例如，重链可变区可以包括在h2残基52之后的单个氨基酸插入物(根据kabat的残基52a)和在重链fr残基82之后的插入残基(例如，根据kabat的残基82a，82b和82c等)。可以通过在抗体序列的同源性区域与“标准”kabat编号的序列进行比对来确定给定抗体的残基的kabat编号。表1：根据各种方案的cdr描述
[0048]
在一些实施例中，cdr是“扩展的cdr”，并且包含根据不同方案开始或终止的区域。例如，扩展cdr可以是：l24-l36，l26-l34或l26-l36(vl-cdr1)；l46-l52，l46-l56或l50-l55(vl-cdr2)；l91-l97(vl-cdr3)；h47-h55，h47-h65，h50-h55，h53-h58或h53-h65(vh-cdr2)；和/或h93-h102(vh-cdr3)。ang-2拮抗剂肽-vegf结合部分融合蛋白
[0049]
ang-2肽可以与vegf抗体(例如，重链或轻链)或vegf受体-fc融合蛋白的c-或n-末端连接或融合。vegf受体-fc融合蛋白的fc部分可以位于vegf受体蛋白的c-或n-末端。fc部分在本文中进一步定义。
[0050]
本发明的组合物包括“fc片段”或“fc区”。如本文所用的术语“fc片段”或“免疫球蛋白fc区”是指至少包含免疫球蛋白的重链恒定区2(ch2)和重链恒定区3(ch3)的蛋白质。在一个实施方案中，fc区不包括免疫球蛋白的重链和轻链的可变区，重链恒定区1(ch1)和轻链恒定区1(cl1)。fc区还可进一步包括在重链恒定区的铰链区。另外，本文公开的免疫球蛋白fc区可包含一部分或包括重链恒定区1(ch1)和/或轻链恒定区1(cl1)的全部fc区(重链和轻链的可变区除外)，只要其具有基本上类似于或优于天然蛋白的生理功能。同样，免疫球蛋白fc区可以是在ch2和/或ch3的氨基酸序列相对长的部分中具有缺失的片段。也就是说，本文公开的免疫球蛋白fc区可包含1)ch1结构域，ch2结构域，ch3结构域和ch4结构域，2)ch1结构域和ch2结构域，3)ch1结构域和ch3结构域，4)ch2结构域和ch3结构域，5)一个或多个结构域与免疫球蛋白铰链区(或铰链区的一部分)的组合，以及6)重链恒定区和轻链恒定区结构域的二聚体。
[0051]
本文公开的免疫球蛋白fc区包括天然氨基酸序列或其序列类似物。氨基酸序列类似物是由于一个或多个氨基酸残基的缺失，插入，非保守或保守取代或其组合而与天然氨基酸序列不同的序列。
[0052]
同样，其他各种类似物也是可以的，包括删除了能够形成二硫键的区域，或者在天然fc形式的n-末端删除了某些氨基酸残基，或者添加了甲硫氨酸残基。此外，为了去除效应子功能，可以在补体结合位点如c1q结合位点和adcc(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)位点发生缺失。wo1997/034631和wo1996/032478中公开了制备此类序列类似物免疫球蛋白fc区的技术。
[0053]
前述fc类似物是具有与本文公开的fc区域相同的生物学活性或改善的结构稳定性(例如，耐热，耐ph等)的类似物。
[0054]
另外，这些fc区可以从人和其他动物，包括牛，山羊，猪，小鼠，兔，仓鼠，大鼠和豚
鼠分离的天然形式，或是从转化的动物细胞或微生物、它们的重组体或类似物中获得。在本文中，它们可以从通过人或动物生物体中分离出完整免疫球蛋白并用蛋白水解酶处理的天然免疫球蛋白中获得。木瓜蛋白酶将天然免疫球蛋白消化成fab和fc区，胃蛋白酶处理导致产生pf
′
c和f(ab)2片段。可对这些片段进行例如尺寸排除色谱法以分离fc或pf
′
c。在另一个实施方案中，人源化fc区是从微生物获得的重组免疫球蛋白fc区。
[0055]
在一个实施方案中，如有需要可以通过磷酸化，硫酸化，丙烯酸化，糖基化，甲基化，法尼基化，乙酰化，酰胺化等修饰fc区。在一个实施方案中，本文公开的免疫球蛋白fc区可以是具有天然糖链，与天然形式相比糖链增加或糖链减少的形式，或者可以是去糖基化的形式。免疫球蛋白fc糖链的增加，减少或去除可以通过本领域常用的方法来实现，例如化学方法，酶法和使用微生物的基因工程方法。从fc区去除糖链会导致与第一补体成分c1的c1q部分的结合亲和力急剧下降，以及抗体依赖性细胞介导的细胞毒性或补体依赖性细胞毒性的降低或丧失，从而不会引起不必要的体内免疫应答。在这方面，去糖基化或非糖基化形式的免疫球蛋白fc区可能会更适合作为药物载体。
[0056]
如本文所用，术语“去糖基化”是指从fc区酶促除去糖的部分，并且术语“无糖基化”是指原核生物，优选大肠杆菌以非糖基化形式产生fc区。
[0057]
在一个实施方案中，免疫球蛋白fc区可以是源自igg，iga，igd，ige和igm的fc区，或由其组合或其杂交制备的fc区。在一个实施方案中，其衍生自igg或igm，它们是人血液中最丰富的蛋白质，并且进一步地，其中已知增强配体结合蛋白的半衰期的igg是igg1，igg2a，igg2b和/或igg3。
[0058]
术语“多肽”，“肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，也适用于天然氨基酸聚合物和非天然氨基酸聚合物。获得多肽的方法(例如生产，分离，纯化，合成和重组生产)是本领域普通技术人员所公知的。药物成分
[0059]
嵌合分子的药物组合物是通过将具有所需纯度的抗体融合分子或抗体融合分子药物缀合物与一种或多种任选的药学上可接受的载体混合来制备的(参见remington
′
s pharmaceutical sciences第16版，osol，a.ed.(1980))，它是冻干制剂或水溶液的形式。药学上可接受的载体通常在所采用的剂量和浓度下对受体无毒，包括但不限于：缓冲剂，例如磷酸盐，柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚，丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合剂，如edta；糖，例如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，例如钠；金属配合物(例如锌蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂，例如聚乙二醇(peg)。
[0060]
缓冲液用于控制ph在优化治疗效果的范围内，尤其是在稳定性取决于ph的情况下。缓冲液浓度优选约50mm至约250mm。适用于本发明的缓冲液包括有机和无机酸及其盐，例如柠檬酸盐，磷酸盐，琥珀酸盐，酒石酸盐，富马酸盐，葡萄糖酸盐，草酸盐，乳酸盐，乙酸
盐。另外，缓冲液可包含组氨酸和三甲胺盐，例如tris。
[0061]
添加防腐剂以阻止微生物生长，并且防腐剂的量通常为0.2％-1.0％(w/v)。适用于本发明的防腐剂包括十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲铵；苯扎氯铵卤化物(例如氯化物，溴化物，碘化物)，苄索氯铵；硫柳汞，苯酚，丁基或苄基醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚间苯二酚；环己醇，3-戊醇和间甲酚。
[0062]
张度剂，有时称为“稳定剂”，以调节或维持组合物中液体的张度。当与带电荷的生物大分子(如蛋白质和抗体)一起使用时，它们通常被称为“稳定剂”，因为它们可以与氨基酸侧链的带电荷基团相互作用，从而减少了分子间和分子内相互作用的可能性。考虑到其他成分的相对量，张度剂的量按重量计算可以是0.1％至25％，或优选1％至5％。优选的张度剂包括多元醇，优选三元或更高级的糖醇，例如甘油，赤藓糖醇，阿拉伯糖醇，木糖醇，山梨糖醇和甘露糖醇。
[0063]
非离子型表面活性剂或去污剂(也称为“湿润剂”)，帮助溶解治疗剂并保护治疗蛋白免于搅动引起的聚集，这也使制剂暴露于表面剪切应力而不会有活性的治疗性蛋白或抗体变性。非离子表面活性剂的量为约0.05mg/ml至约1.0mg/ml，优选约0.07mg/ml至约0.2mg/ml。
[0064]
合适的非离子表面活性剂包括聚山梨酯(20、40、60、65、80等)，泊咯沙姆(184、188等)，多元醇，聚氧乙烯脱水山梨醇单醚(聚氧乙烯脱水山梨醇单醚(等)，聚桂醇400，硬脂酸聚乙二醇40，聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60，单硬脂酸甘油酯，蔗糖脂肪酸酯，甲基纤维素和羧甲基纤维素。可以使用的阴离子去污剂包括月桂基硫酸钠，琥珀酸二异辛酯磺酸钠和二辛基磺酸钠。阳离子去污剂包括苯扎氯铵或苄索氯铵。
[0065]
可以根据预期的给药途径和标准药学实践选择药物载体，赋形剂或稀释剂。药物组合物可包含作为载体或除载体之外，赋形剂或稀释剂，还包含任何合适的粘合剂，润滑剂，助悬剂，包衣剂或增溶剂。
[0066]
取决于不同的分配系统，可能存在不同的组成/配方要求。举例来说，本发明有效的药物组合物可配制成使用微型泵或通过粘膜途径给药的形式，例如作为用于吸入或可吸收溶液的鼻喷雾剂或气雾剂，或非肠道给药，其中组合物可配制成注射液形式，给药途径通过例如静脉，肌肉或皮下注射。或者，可以将制剂设计成通过多种途径给药。在一些实施方案中，所述制剂直接在一个或多个肿瘤中施用。
[0067]
在一个实施方案中，宿主细胞是用表达载体转染的细胞，所述表达载体包含编码可在细胞中表达的一个或多个蛋白质序列的核苷酸或多核苷酸序列。在一个实施方案中，包括宿主细胞的细胞是哺乳动物细胞，酵母细胞，昆虫细胞或细菌。在另一个实施方案中，用作宿主细胞的哺乳动物细胞可以是中国仓鼠卵巢(“cho”)细胞，hela细胞，和包括hek-293细胞的hek细胞。在另一个实施方案中，用作宿主细胞的酵母细胞可以是酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母。在一个实施方案中，用作宿主细胞的昆虫细胞可以是sf9，sf21，hi-5，schneider2细胞，schneider3细胞或high five昆虫细胞。在另一个实施方案中，用作宿主细胞的细菌细胞可以是大肠杆菌，棒状杆菌或谷氨酸棒杆菌。
[0068]
在一些实施方案中，抗体或蛋白质制剂是冻干制剂。在另一个实施方案中，抗体或蛋白质制剂是水溶液制剂。
[0069]
在实施方案的其他方面，本发明公开的融合蛋白或嵌合分子可以降低疾病的严重
程度例如至少10％，至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％或至少95％。在实施方案的其他方面，本发明公开的融合蛋白或嵌合分子可以降低疾病的严重程度从，例如约5％至约100％，约10％至约100％，约20％至约100％，约30％至约100％，约40％至约100％，约50％至约100％，约60％至约100％，约70％至约100％，约80％至约100％，约10％至约90％，约20％至约90％，约30％全约90％，约40％全约90％，约50％全约90％，约60％全约90％，约70％全约90％，约10％至约80％，约20％至约80％，约30％至约80％，约40％至约80％，约50％至约80％，或约60％至约80％，约10％至约70％，约20％至约70％，约30％至约70％，约40％至约70％，或约50％至约70％。
[0070]
本发明公开的融合蛋白或嵌合分子可以包含足以常规个体给药量的治疗化合物，和其他赋形剂一起可以构成药物组合物。在实施方案的一个方面，本发明公开的治疗化合物可以是，例如至少5mg，至少10mg，至少15mg，至少20mg，至少25mg，至少30mg，至少35mg，至少40mg，至少45mg，至少50mg，至少55mg，至少60mg，至少65mg，至少70mg，至少75mg，至少80mg，至少85mg，至少90mg，至少95mg或至少100mg的治疗化合物。在实施方案的其他方面，本发明公开的治疗化合物可以是，例如至少5mg，至少10mg，至少20mg，至少25mg，至少50mg，至少75mg，至少100mg，至少200mg，至少300mg，至少400mg，至少500mg，至少600mg，至少700mg，至少800mg，至少900mg，至少1,000mg，至少1,100mg，至少1,200mg，至少1,300mg，至少1,400mg或至少1,500mg的治疗化合物。在实施方案的其他方面，本发明公开的治疗化合物可以在，例如约5mg至约100mg，约10mg至约100mg，约50mg至约150mg，约100mg至约250mg，约150mg至约350mg，约250mg至约500mg，约350mg至约600mg，约500mg至约750mg，约600mg至约900mg，约750mg至约1,000mg，约850mg至约1200mg，或约1000mg至约1500mg的范围内。在实施方案的其他方面，本发明公开的治疗化合物可以在，例如约10mg至约250mg，约10mg至约500mg，约10mg至约750mg，约10mg至约1,000mg，约10mg至约1,500mg，约50mg至约250mg，约50mg至约500mg，约50mg至约750mg，约50mg至约1,000mg，约50mg至约1,500mg，约100mg至约250mg，约100mg至约500mg，约100mg至约750mg，约100mg至约1,000mg，约100mg至约1,500mg，约200mg至约500mg，约200mg至约750mg，约200mg至约1,000mg，约200mg至约1,500mg，约5mg至约1,500mg，约5mg至约1,000mg或约5mg至约250mg的范围内。
[0071]
本发明公开的治疗化合物可包含足以溶解该治疗化合物的量的溶剂，乳液或其他稀释剂。在该实施方案的其他方面，这里公开的治疗化合物可包含溶剂，乳液或稀释剂，其量例如小于约90％(v/v)，小于约80％(v/v)，小于约70％(v/v)，小于约65％(v/v)，小于约60％(v/v)，小于约55％(v/v)，小于约50％(v/v)，小于约45％(v/v)，小于约40％(v/v)，小于约35％(v/v)，小于约30％(v/v)，小于约25％(v/v)，小于约20％(v/v)，小于约15％(v/v)，小于约10％(v/v)，小于约5％(v/v)，或小于约1％(v/v)。在该实施方案的其他方面，这里公开的治疗化合物可以包含溶剂，乳剂或其他稀释剂，其量的范围例如约1％(v/v)至90％(v/v)，约1％(v/v)至70％(v/v)，约1％(v/v)至60％(v/v)，约1％(v/v)至50％(v/v)，约1％(v/v)至40％(v/v)，约1％(v/v)至30％(v/v)，约1％(v/v)至20％(v/v)，约1％(v/v)至10％(v/v)，约2％(v/v)至50％(v/v)，约2％(v/v)至40％(v/v)，约2％(v/v)至30％(v/v)，约2％(v/v)至20％(v/v)，约2％(v/v)至10％(v/v)，约4％(v/v)至50％(v/v)，约4％(v/v)至40％(v/v)，约4％(v/v)至30％(v/v)，约4％(v/v)至20％(v/v)，约4％(v/v)至10％(v/
v)，约6％(v/v)至50％(v/v)，约6％(v/v)至40％(v/v)，约6％(v/v)至30％(v/v)，约6％(v/v)至20％(v/v)，约6％(v/v)至10％(v/v)，约8％(v/v)至50％(v/v)，约8％(v/v)至40％(v/v)，约8％(v/v)至30％(v/v)，约8％(v/v)至20％(v/v)，约8％(v/v)至15％(v/v)，或约8％(v/v)至12％(v/v)。
[0072]
这里公开的药物组合物中治疗化合物的最终浓度可以是任何期望的浓度。在该实施方案的一个方面，药物组合物中治疗化合物的最终浓度可以是治疗有效剂量。在该实施方案的其他方面，药物组合物中治疗化合物的最终浓度可以是，例如至少0.00001mg/ml，至少0.0001mg/ml，至少0.001mg/ml，至少0.01mg/ml，至少0.1mg/ml，至少1mg/ml，至少10mg/ml，至少25mg/ml，至少50mg/ml，至少100mg/ml，至少200mg/ml，至少500mg/ml，至少700mg/ml，至少1,000mg/ml或至少1,200mg/ml。在该实施方案的其他方面，溶液中治疗化合物的浓度可以是，例如至多1,000mg/ml，至多1100mg/ml，至多1200mg/ml，至多1300mg/ml，至多1,400mg/ml，至多1,500mg/ml，至多2,000mg/ml，至多2,000mg/ml或至多3,000mg/ml。在该实施方案的其他方面，药物组合物中治疗化合物的最终浓度可以在，例如约0.00001mg/ml至约3,000mg/ml，约0.0001mg/ml至约3,000mg/ml，约0.01mg/ml至约3,000mg/ml，约0.1mg/ml至约3,000mg/ml，约1mg/ml至约3,000mg/ml，约250mg/ml至约3,000mg/ml，约500mg/ml至约3,000mg/ml，约750mg/ml至约3,000mg/ml，约1,000mg/ml至约3,000mg/ml，约100mg/ml至约2,000mg/ml，约250mg/ml至约2,000mg/ml，约500mg/ml至约2,000mg/ml，约750mg/ml至约2,000mg/ml，约1,000mg/ml至约2,000mg/ml，约100mg/ml至约1,500mg/ml，约250mg/ml至约1,500mg/ml，约500mg/ml至约1,500mg/ml，约750mg/ml至约1,500mg/ml，约1,000mg/ml至约1,500mg/ml，约100mg/ml至约1,200mg/ml，约250mg/ml至约1,200mg/ml，约500mg/ml至约1,200mg/ml，约750mg/ml至约1,200mg/ml，约1,000mg/ml至约1,200mg/ml，约100mg/ml至约1,000mg/ml，约250mg/ml至约1,000mg/ml，约500mg/ml至约1,000mg/ml，约750mg/ml至约1,000mg/ml，约100mg/ml至约750mg/ml，约250mg/ml至约750mg/ml，约500mg/ml至约750mg/ml，约100mg/ml至约500mg/ml，约250mg/ml约500mg/ml，约0.00001mg/ml至约0.0001mg/ml，约0.00001mg/ml至约0.001mg/ml，约0.00001mg/ml至约0.01mg/ml，约0.00001mg/ml至约0.1mg/ml，约0.00001mg/ml至约1mg/ml，约0.001mg/ml至约0.01mg/ml，约0.001mg/ml至约0.1mg/ml，约0.001mg/ml至约1mg/ml，约0.001mg/ml至约10mg/ml或约0.001mg/ml至约100mg/ml的范围内。
[0073]
本说明书的各方面部分地公开了治疗患有疾病包括癌症的个体。如本文所用，术语“治疗”是指减轻或消除个体癌症的临床症状；或延迟或预防个体包括癌症临床症状的发作。例如，术语“治疗”可以指将以癌症为特征的疾病的症状减少，包括但不限于肿瘤大小，例如至少20％，至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或至少100％。与癌症相关的实际症状是众所周知的，并且可以由本领域普通技术人员根据考虑的因素来确定，这些因素包括但不限于疾病的位置，包括癌症，病因，包括癌症，疾病的严重程度，包括癌症，和/或受疾病影响的组织或器官，包括癌症。本领域技术人员知晓与特定类型疾病相关的症状或指标，包括癌症，并且知晓如何确定个体是否为本文所述治疗的候选者。
[0074]
在该实施方案的一些方面，本文公开的治疗有效量的治疗化合物减少包括癌症在内的疾病的相关症状，减少例如至少10％，至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少
35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或至少100％。在该实施方案的其他方面，本文公开的治疗有效量的治疗化合物减少包括癌症在内的疾病的相关症状，减少例如至多10％，至多15％，至多20％，至多25％，至多30％，至多35％，至多40％，至多45％，至多50％，至多55％，至多60％，至多65％，至多70％，至多75％，至多80％，至多85％，至多90％，至多95％或至多100％。在该实施方案的其他方面，本文公开的治疗有效量的治疗化合物减少包括癌症在内的疾病的相关症状，减少例如约10％至约100％，约10％至约90％，约10％至约80％，约10％至约70％，约10％至约60％，约10％至约50％，约10％至约40％，约20％至约100％，约20％至约90％，约20％至约80％，约20％至约20％，约20％至约60％，约20％至约50％，约20％至约40％，约30％至约100％，约30％至约90％，约30％至约80％，约30％至约70％，约30％至约60％或约30％至约50％。
[0075]
在该实施方案的其他方面，本文公开的治疗化合物的治疗有效量通常在约0.001mg/kg/天至约100mg/kg/天的范围内。在该实施方案的一些方面，本文公开的治疗化合物的有效量可以是，例如至少0.001mg/kg/天，至少0.01mg/kg/天，至少0.1mg/kg/天，至少1.0mg/kg/天，至少5.0mg/kg/天，至少10mg/kg/天，至少15mg/kg/天，至少20mg/kg/天，至少25mg/kg/天，至少30mg/kg/天，至少35mg/kg/天，至少40mg/kg/天，至少45mg/kg/天或至少50mg/kg/天。在该实施方案的其他方面，本文公开的治疗化合物的有效量可以在，例如约0.001mg/kg/天至约10mg/kg/天，约0.001mg/kg/天至约15mg/kg/天，约0.001 mg/kg/天至约20mg/kg/天，约0.001 mg/kg/天至约25mg/kg/天，约0.001 mg/kg/天至约30mg/kg/天，约0.001 mg/kg/天至约35mg/kg/天，约0.001mg/kg/天至约40mg/kg/天，约0.001mg/kg/天至约45mg/kg/天，约0.001mg/kg/天至约50mg/kg/天，约0.001mg/kg/天至约75mg/kg/天，或约0.001mg/kg/天至约100mg/kg/天的范围内。在该实施方案的其他方面，本文公开的治疗化合物的有效量可以在，例如约0.01mg/kg/天至约10mg/kg/天，约0.01mg/kg/天至约15mg/kg/天，约0.01mg/kg/天至约20mg/kg/天，约0.01mg/kg/天至约25mg/kg/天，约0.01mg/kg/天至约30mg/kg/天，约0.01mg/kg/天至约35mg/kg/天，约0.01mg/kg/天至约40mg/kg/天，约0.01mg/kg/天至约45mg/kg/天，约0.01mg/kg/天至约50mg/kg/天，约0.01mg/kg/天至约75mg/kg/天，或约0.01mg/kg/天至约100mg/kg/天的范围内。在该实施方案的其他方面，本文公开的治疗化合物的有效量可以在，例如约0.1mg/kg/天至约10mg/kg/天，约0.1mg/kg/天至约15mg/kg/天，约0.1mg/kg/天至约20mg/kg/天，约0.1mg/kg/天至约25mg/kg/天，约0.1mg/kg/天至约30mg/kg/天，约0.1mg/kg/天至约35mg/kg/天，约0.1mg/kg/天至约40mg/kg/天，约0.1mg/kg/天至约45mg/kg/天，约0.1mg/kg/天至约50mg/kg/天，约0.1mg/kg/天至约75mg/kg/天或约0.1mg/kg/天至约100mg/kg/天的范围内。
[0076]
在该实施方案的其他方面，本文公开的治疗化合物的有效量可以在，例如约1mg/kg/天至约10mg/kg/天，约1mg/kg/天至约15mg/kg/天，约1mg/kg/天至约20mg/kg/天，约1mg/kg/天至约25mg/kg/天，约1mg/kg/天至约30mg/kg/天，约1mg/kg/天至约35mg/kg/天，约1mg/kg/天至约40mg/kg/天，约1mg/kg/天至约45mg/kg/天，约1mg/kg/天至约50mg/kg/天，约1mg/kg/天至约75mg/kg/天或约1mg/kg/天至约100mg/kg/天的范围内。在该实施方案的其他方面，本文公开的治疗化合物的有效量可以在，例如约5mg/kg/天至约10mg/kg/天，约5mg/kg/天至约15mg/kg/天，约5mg/kg/天至约20mg/kg/天，约5mg/kg/天至约25mg/kg/
天，约5mg/kg/天至约30mg/kg/天，约5mg/kg/天至约35mg/kg/天，约5mg/kg/天至约40mg/kg/天，约5mg/kg/天至约45mg/kg/天，约5mg/kg/天至约50mg/kg/天，约5mg/kg/天至约75mg/kg/天或约5mg/kg/天至约100mg/kg/天的范围内。
[0077]
在液体和半固体制剂中，本文公开的治疗化合物的浓度通常可以在约50mg/ml至约1,000mg/ml之间。在该实施方案的一些方面，本文公开的治疗化合物的治疗有效量可以为，例如约50mg/ml至约100mg/ml，约50mg/ml至约200mg/ml，约50mg/ml至约300mg/ml，约50mg/ml至约400mg/ml，约50mg/ml至约500mg/ml，约50mg/ml至约600mg/ml，约50mg/ml约700mg/ml，约50mg/ml至约800mg/ml，约50mg/ml至约900mg/ml，约50mg/ml至约1,000mg/ml，约100mg/ml至约200mg/ml，约100mg/ml至约300mg/ml，约100mg/ml至约400mg/ml，约100mg/ml至约500mg/ml，约100mg/ml至约600mg/ml，约100mg/ml至约700mg/ml，约100mg/ml至约800mg/ml，约100mg/ml至约900mg/ml，约100mg/ml至约1,000mg/ml，约200mg/ml至约300mg/ml，约200mg/ml至约400mg/ml，约200mg/ml至约500mg/ml，约200mg/ml至约600mg/ml，约200mg/ml至约700mg/ml，约200mg/ml至约800mg/ml，约200mg/ml至约900mg/ml，约200mg/ml至约1,000mg/ml，约300mg/ml至约400mg/ml，约300mg/ml至约500mg/ml，约300mg/ml至约600mg/ml，约300mg/ml至约700mg/ml，约300mg/ml至约800mg/ml，约300mg/ml至约900mg/ml，约300mg/ml至约1,000mg/ml，约400mg/ml至约500mg/ml，约400mg/ml至约600mg/ml，约400mg/ml至约700mg/ml，约400mg/ml至约800mg/ml，约400mg/ml至约900mg/ml，约400mg/ml至约1,000mg/ml，约500mg/ml至约600mg/ml，约500mg/ml至约700mg/ml，约500mg/ml至约800mg/ml，约500mg/ml约900mg/ml，约500mg/ml至约1,000mg/ml，约600mg/ml至约700mg/ml，约600mg/ml至约800mg/ml，约600mg/ml至约900mg/ml或约600mg/ml至约1,000mg/ml。
[0078]
剂量可以是单次剂量或累积剂量(连续剂量)，并且可以由本领域技术人员容易地确定。例如，包括癌症在内的疾病的治疗可以包括一次性施用有效剂量的本文公开的治疗化合物或药物组合物。可选地，包括癌症在内的疾病的治疗可包括在一定时间段内多次施用有效剂量的药物组合物，例如每天一次，每天两次，每天三次，每几天一次，或每周一次。给药时间因人而异，取决于个体症状的严重程度等因素。例如，可以在不确定的时间内每天一次向个体施用有效剂量的本文公开的治疗化合物或药物组合物，直到个体不再需要治疗为止。本领域普通技术人员能够认识到，可以在整个治疗过程中监测个体的状况，并且可以相应地调整施用本文公开的治疗化合物或药物组合物的有效量。
[0079]
在一个实施方案中，本文公开的治疗化合物能够使患有癌症的个体的癌细胞数或肿瘤大小减少，例如与未接受治疗的患者相比减少至少10％，至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％或至少95％。在该实施方案的其他方面，治疗性化合物能够将患有癌症的个体中的癌细胞数或肿瘤大小减少，例如与未接受治疗的患者相比减少约10％至约100％，约20％至约100％，约30％至约100％，约40％至约100％，约50％至约100％，约60％至约100％，约70％至约100％，约80％至约100％，约10％至约90％，约20％至约90％，约30％至约90％，约40％至约90％，约50％至约90％，约60％至约90％，约70％至约90％，约10％至约80％，约20％至约80％，约30％至约80％，约40％至约80％，约50％至约80％，或约60％至约80％，约10％至约70％，约20％至约70％，约30％至约70％，约40％至约70％，或约50％至约70％。
[0080]
在另一个实施方案中，治疗化合物及其衍生物的半衰期为2小时，3小时，4小时，5小时，6小时，7小时，8小时，9小时，10小时，11小时，12小时，13小时，14小时，15小时，16小时，17小时，18小时，19小时，20小时，21小时，22小时，23小时，1天，2天，3天，4天，5天，6天，7天，1周，2周，3周，4周，1个月，2个月，3个月，4个月或更长时间。
[0081]
在一个实施方案中，治疗化合物的施用期为1天，2天，3天，4天，5天，6天，7天，8天，9天，10天，11天，12天，13天，14天，3周，4周，5周，6周，7周，8周，9周，10周，11周，12周，4个月，5个月，6个月，7个月，8个月，9个月，10个月，11个月，12个月或更长时间。在另一个实施方案中，停止给药的时间为1天，2天，3天，4天，5天，6天，7天，8天，9天，10天，11天，12天，13天，14天，3周，4周，5周，6周，7周，8周，9周，10周，11周，12周，4个月，5个月，6个月，7个月，8个月，9个月，10个月，11个月，12个月或更长时间。
[0082]
在该实施方案的各方面中，本文公开的治疗有效量的治疗化合物减少或维持疾病，包括个体中癌细胞群体和/或肿瘤细胞大小，例如减少或维持至少10％，至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或至少100％。在该实施方案的其他方面，本文公开的治疗有效量的治疗化合物减少或维持疾病或个体中癌细胞群体和/或肿瘤细胞大小，例如减少或维持至多10％，至多15％，至多20％，至多25％，至多30％，至多35％，至多40％，至多45％，至多50％，至多55％，至多60％，至多65％，至多70％，至多75％，至多80％，至多85％，至多90％，至多95％或至多100％。在该实施方案的其他方面，本文公开的治疗有效量的治疗化合物减少或维持疾病，包括个体中的癌细胞群体和/或肿瘤细胞大小，例如减少或维持约10％至约100％，约10％至约90％，约10％至约80％，约10％至约70％，约10％至约60％，约10％至约50％，约10％至约40％，约20％至约100％，约20％至约90％，约20％至约80％，约20％至约20％，约20％至约60％，约20％至约50％，约20％至约40％，约30％至约100％，约30％至约90％，约30％至约80％，约30％至约70％，约30％至约60％或约30％至约50％。
[0083]
将药物组合物或治疗化合物施用于个体。个体通常是人类，但可以是动物，包括但不限于狗，猫，鸟，牛，马，马，绵羊，山羊，爬行动物和其他动物，无论是否驯养。通常，任何需要治疗的个体都是患有某种类型疾病的候选者，包括癌症，无论癌症是良性还是恶性，肿瘤，实体的或其他形式，不在肿瘤中的癌细胞或其他形式的癌症。其中最常见的癌症类型包括但不限于膀胱癌，乳腺癌，结肠癌和直肠癌，子宫内膜癌，肾肿瘤，肾癌，白血病，肺癌，黑素瘤，非霍奇金淋巴瘤，胰腺癌，前列腺癌，胃癌和甲状腺癌。术前评估通常包括常规病史和体格检查，此外还应充分披露过程中所有相关的风险和益处，获得知情同意。
实施例
[0084]
实施例1-在hek293细胞中生产包含vegf抗体和ang-2结合肽的嵌合分子。
[0085]
hek-293细胞通过瞬时表达来表达名为amd a，b，c，d和e的嵌合分子(参见表2)。简而言之，合成包含具有或不具有ang2结合肽的vegf抗体轻链的融合蛋白的dna(seq id no：58、59、60和63)和包含具有ang2结合肽的vegf抗体重链的融合蛋白的dna(seq id no：57、61和62)，并将其克隆到表达载体上。通过dna测序验证包含基因的完整表达构建体。将dna构建体转化到大肠杆菌dh5alfa感受态细胞中(invitrogen)。挑选单克隆，并在含有抗生素
(卡那霉素，25μg/ml)的lb液体培养基中培养。按照厂商的使用说明，用qiagen plasmid maxi kit(qiagen)提取dna质粒。质粒浓度通过nanodrop(thermo fisher)进行测定。通过使用聚乙烯亚胺(pei)将含有编码目的基因的dna序列的表达质粒构建体瞬时转入hek-293细胞中。转染后24小时，用丙戊酸(vpa)处理转染的细胞以增强蛋白表达。表2.amd分子*le是一个侧翼序列，在肽筛选的原始噬菌体克隆和随后的肽类抗体(肽-fc融合)分子中均存在。
[0086]
培养约6天后，通过在9000rpm下澄清离心30-60分钟收集细胞培养基，然后通过0.22微米的过滤器过滤。将澄清的上清液加载到蛋白质a亲和柱上，并纯化嵌合分子(amd-a，b，c，d和e)。使用2m精氨酸溶液，ph 4从蛋白a柱上洗脱嵌合分子。图1显示了蛋白a色谱柱步骤得到的代表性色谱图。表3总结了嵌合分子的纯化结果。如表3所示，包含都融合在重链n末端的2个拷贝l1-15肽的嵌合分子(amd-b和amd-d)与总共有四个拷贝的l1-15肽(amd-a和amd-c)，其中每个l1-15肽与抗体的轻链和重链n端融合相比较，具有显著较高的表达水平。具有或不具有作为l1-15肽一部分的侧翼序列le似乎不影响嵌合分子的表达。
[0087]
amd-e的表达水平与amd-b和amd-d的表达水平相当(参见表3)。amd-e具有一个肽2
×
con4(c)，与bevacizumab重链的每个c末端融合。使用sds电泳和/或hplc方法分析产物的纯度。表3.蛋白质a亲和层析纯化总结
实施例2-cho细胞中包含vegf捕获剂和ang2结合肽的嵌合分子的制备
[0088]
合成包含vegf受体-fc融合蛋白(vegf捕获剂)和ang-2结合肽(seq id no：64，命名为askb-e06)的嵌合分子dna，并将其克隆到表达载体上。通过dna测序验证包含dna基因的完整表达构建体。通过转化大肠杆菌dh10b并过夜培养细胞来扩增表达构建体。制备用于表达构建体的dna，并通过无内毒素小量质粒提取试剂盒(来自)进行纯化。
[0089]
通过电穿孔将表达构建体转染到gs-/-中国仓鼠卵巢细胞(cho)中，并使用不含谷氨酰胺的选择性培养基(cd cho融合生长培养基)筛选转染的cho细胞，获得稳定表达askb-e06的细胞系。以这种方式，建立32个或更多的稳定小池，并根据分批和补料分批培养中的表达水平选择优选的小池。通过elisa效价测定法检测表达水平。通过有限稀释并使用克隆培养基进行单克隆操作，根据分批和补料分批培养的生产能力和细胞生长情况，从100多个阳性克隆中选择两个优选的单克隆。扩增优选克隆，并以0.5
×
10
6
个细胞/ml的浓度接种，将总体积300ml加入2l的摇瓶中，并将细胞于37℃，5％co
2
、70％hmr的条件下培养，并以120rpm摇动。在第3、6、7、8和9天，通过使用5％feeda+0.5％feed b(来自ge health)进行补料培养。每隔一天监测细胞活力，活细胞密度，并在第11-13天收获培养物。
[0090]
通过以2000rpm离心10分钟澄清约600ml的细胞培养液，然后过滤来收集细胞培养基。将澄清的上清液上样至蛋白质a亲和柱，将嵌合分子进行纯化。使用离子交换色谱，疏水相互作用色谱，羟基磷灰石色谱，和/或混合模式色谱进一步纯化蛋白质。将产物进一步浓缩，并使用ufdf进行缓冲液交换，并进一步配制。使用ce-sds和hplc方法分析产物的纯度。实施例3-分子检测评估嵌合分子的双重拮抗剂活性
[0091]
开发了分子测定法(octet结合亲和力，亲和力elisa和阻断elisa)以评估嵌合分子与ang-1，ang-2和/或vegf的直接结合能力，以及嵌合分子对ang1：tie-2相互作用，ang-2：tie-2相互作用和/或vegf：vegf受体相互作用。这些体外测定法描述如下：octet亲和力
[0092]
纯化的重组人vegf蛋白购自life-technologies(cat.#phc9391)。人ang1或ang2蛋白是从r&d system订购的。使用pall fortebio的octet red96进行分析。使用抗人igg fc传感器，将嵌合分子amd-b，amd-d，amd-e或对照抗体贝伐单抗的样品以3μg/ml的量加入动力学缓冲液中，加载300秒。从5或10μg/ml开始使用稀释系列，将配体ang1，ang2或vegf样品关联300秒，然后连续7孔稀释2倍。解离运行600秒。使用具有整体拟合的1∶1模型分析数
据。代表性的结合动力学图如图2所示。结合亲和力结果汇总在表4a，4b和4c中。结果表明，嵌合分子amd-b，amd-d和amd-e能够结合ang1，ang2和vegf。还注意到，与对照抗体贝伐单抗相比，具有与抗体的n-末端融合的四个l1-15肽的嵌合分子amd-b对vegf的亲和力降低。与对照抗体askb1202，即内部开发的贝伐单抗生物类似物askb 1202(内部对照)相比，amd-d和amd-e与vegf的亲和力相当。表4a.octet亲和力分析结果汇总-ang-1的结合 kon(1/ms)koff(1/s)kd(m)amd-b1.56e+052.69e-041.73e-09amd-d1.75e+052.41e-041.37e-09amd-e9.42e+041.01e-041.07e-09表4b.octet亲和力分析结果汇总-ang-2的结合 kon(1/ms)koff(1/s)kd(m)amd-b3.34e+044.33e-051.30e-09amd-d3.68e+042.39e-056.49e-10amd-e3.54e+045.52e-051.56e-09表4c.octet亲和力分析结果汇总-vegf的结合 kon(1/ms)koff(1/s)kd(m)bevacizumab8.03e+04＜1.0e-07＜1.0e-12amd-b1.41e+053.42e-052.42e-10amd-d1.01e+05＜1.0e-07＜1.0e-12amd-e1.38e+05＜1.0e-07＜1.0e-12
[0093]
亲和elisa：纯化的重组人vegf蛋白购自life-technologies(cat.#phc9391)。根据制造商的建议，vegf在bsa溶液中以0.1mg/ml的浓度进行重构。制备样品的试样并储存在-20℃。
[0094]
使用微量滴定板，向每个孔中加入约100微升的vegf，并将平板孵育约2小时，然后用含有约0.1％tween-20的磷酸盐缓冲盐液(pbs)洗涤四次。然后每孔使用约250微升的含有约5％bsa的pbs溶液进行封闭，并将平板在室温下孵育约2小时。孵育后，弃去过量的封闭溶液，将约100微升amd-a，b，c，d或e加入到孔中，以约40纳摩尔的浓度开始稀释，然后在含有约1％bsa的pbs中连续稀释4倍。将板在室温下孵育过夜。孵育后，将平板用含有约0.1％tween-20的pbs洗涤。再重复洗涤四次，然后每孔加入约100微升预先在含有1％bsa的pbs中以1∶5000进行稀释的山羊抗人igg(fc)-hrp(pierce chemical co.，货号31416)。将平板在室温下孵育约1小时。将平板在含有约0.1％tween-20的pbs中洗涤五次，然后每孔加入约100微升tmb基质(3，3
′
，5，5
′-
四甲基联苯胺液体基质系统；sigma chemical company，st.louis，mo，货号t8665)，并将平板孵育约5-15分钟直到形成蓝色。然后在分光光度计下于约450nm读取吸光度。
[0095]
图3显示了vegf与amd-a，b，c，d和e结合的elisa结果。内部对照askb 1202(是目前正在开发的贝伐单抗的生物类似药)用作阳性对照。结果表明，所有分子amd-a，b，c，d和e均保留结合vegf的能力。表5总结了ec-50的结果。结果表明，amd-b和amd-d具有与askb1202相接近的vegf结合亲和力。另外，amd-b和amd-d具有比amd-a和amd-c更强的vegf结合亲和力。
表5.亲和elisa结果：vegf与amd-a，b，c，d和e的结合。d和e的结合。阻断elisa：
[0096]
评估嵌合分子阻断ang1和ang2与其受体tie-2结合的能力。将96孔微量滴定板(nunk)用100μl终浓度100ng/ml稀释在0.1m碳酸盐(ph9.3)中的人tie2-fc(r&d system，313-t1)于4℃包覆过夜。用含有5％bsa的pbst(0.05％tween 20)封闭平板2小时。纯化嵌合分子，起始浓度为1000ng/ml，在含有1％bsa的pbs中以3的稀释倍数连续稀释。加入人类ang1或ang2蛋白(r&d系统)至终浓度50ng/ml，并在室温下孵育1小时。将嵌合分子-ang1或嵌合分子-ang2的混合物加入包覆有人tie2-fc的微量滴定平板中，并在室温下再孵育1小时。将100μl抗ang1或抗ang2单克隆抗体(r&d system)以1μg/ml的终浓度添加到每个孔中，并在室温下孵育1小时。加入辣根过氧化物酶(hrp)偶联的抗小鼠igg双抗，稀释比例为1∶5000，并在室温下孵育1小时。使用tmb(皮尔斯)开发了标准比色响应。用分光光度计读取od450吸光度。在每个步骤之间，要用100μl的pbs洗涤平板5次。
[0097]
ang1和ang-2与受体tie-2结合的剂量依赖性抑制或抑制缺乏情况如图4所示。ic-50结果归纳在表6中。结果表明，嵌合分子amd-a，b，c和d选择性抑制ang2与tie-2的结合，ic-50的抑制范围为5-15ng/ml；尽管它们都能够与ang1结合，但它们抑制ang-1与tie-2结合的能力却非常弱。结果还显示，均包含4个拷贝的肽l1-15的amd-a和amd-c具有比amd-b和amd-d更低的ic-50。amd-e能够抑制ang-1和ang-2与其受体tie-2的结合。
[0098]
图5显示了嵌合分子712-o和712-o2对ang-2与tie-2结合的抑制。嵌合分子712-o包含具有如seq id no：29所示的氨基酸序列的两条重链多肽链和具有如seq id no：4所示的氨基酸序列的两条轻链。嵌合分子712-o2包含具有氨基酸序列如seq id no：31所示的两条重链多肽链和具有氨基酸序列如seq id no：4所示的两条轻链。
[0099]
在712-o存在的情况下，ang-2拮抗剂肽l1-15与vegf结合抗体的重链的n-末端融合。在712-o2存在的情况下，l1-15融合到重链的c末端。ang-2阻断试验的ic-50值对于712-o约为33pm，对于712-o2约为78pm。由于l1-15与其他肽包括l1-7，l1-10和l1-21，被认为是n端融合肽，并于wo2004/092215a2中描述了仅在与fc的n端融合时才被检测到有活性。令人惊讶的是，嵌合分子712-o2是显著有效的，具有大约78pm的ic-50。表6.阻断elisa结果：抑制ang-1或ang-2与tie-2的结合。
实施例4-基于细胞的活性测定：体外人脐静脉内皮细胞(huvec)成管分析
[0100]
为了确认askb-e06是否抑制人脐静脉内皮细胞(huvec)的生成，增殖，迁移和分化，需要进行测定。a)712-o对huvec的增殖抑制
[0101]
将10,000huvec加入到100μl ebm-2培养基(瑞士龙沙)，其中ebm-2培养基中添加vegf-a(50ng/ml)，或在96孔板的每个孔中添加包含vegf-a(50ng/ml)和不同浓度的712-o样品，然后在5％co
2
，37℃下孵育72小时。然后，向其中添加10μl的wst-1溶液，随后在37℃下孵育4小时。在410nm处以610nm为参照测量吸光度。结果显示在表7中，其表明712-o具有与相似或更高的效力。它比askb1202(贝伐单抗的生物类似物)更有效。表7.huvec分析结果(2)712-o对huvec的迁移抑制
[0102]
将孔径为8μm的transwells底部(美国康宁公司)涂上0.1％明胶并安装在24孔板中，然后在下腔室中装入600μl ebm-2培养基(lonza)，含vegf-a(50ng/ml)的ebm-2或含vegf-a(50ng/m1)的ebm-2和不同浓度的712-o样品。上腔室装有100μl含有1
×
10
5
huvec的ebm-2培养基。在37℃的细胞培养箱中培养4小时后，将滤膜从transwell分离，并将细胞用甲醇固定1分钟，并用苏木精/曙红染色。用棉签将未迁移但留在transwell上表面的细胞完全清除。在光学显微镜(
×
100)下，在通过过滤器迁移的细胞中任意选择五个随机视野，对其计数。(3)712-o对成管的抑制
[0103]
为了确认askb-e06可以抑制huvec的分化，进行了成管试验。更具体地说，在96孔板上涂上生长因子降低基质(bd biosciences，美国)，然后在100μl的ebm-2培养基中加入15,000huvec，加入含有vegf-a(50ng/ml)的ebm-2培养基，或含有vegf-a(50ng/ml)的ebm-2培养基，以及向每个孔中加入抗体样品，再在37℃细胞培养箱中培养6小时。然后，通过使用倒置显微镜观察成管情况。实施例5-体内抗肿瘤活性研究：施用双重拮抗嵌合分子的系统疗效研究
[0104]
在肿瘤激发后72小时，a431荷瘤小鼠每天一次皮下施用嵌合分子askb712-b。使用
的剂量是1000，200，40和8ug/只/天。所有动物总共给予20剂。每周记录3次肿瘤体积和体重。在研究结束时，处死动物，收集其血清通过elisa测量askb712-b的水平。从所有组中收集肿瘤和一组正常组织。
[0105]
本文提供的非限制性实施例仅是出于说明性目的，以促进对所公开主题更完整的理解。这些实施例不应解释为限制本说明书中描述的任何实施方案，包括那些涉及融合肽，药物组合物，或用于治疗癌症，增生性视网膜病，amd或ra的方法和用途的实施方案。
[0106]
一种嵌合分子，其包含一个或两个vegf结合部分和一个或两个ang-2拮抗剂肽，其中：a)所述ang-2拮抗剂肽包含选自seq id no：8-14的氨基酸序列；和b)所述vegf结合部分是抗体，fab或scfv；其中所述抗体，fab或scfv包含衍生自具有seq id no：4所示氨基酸序列的轻链或衍生自具有seq id no：6所示氨基酸序列的scfv轻链的cdrs，以及衍生自具有seq id no：5所示氨基酸序列的重链或衍生自具有seq id no：6所示氨基酸序列的scfv重链的cdrs。
[0107]
如权利要求2所述的嵌合分子，其中所述vegf结合部分包含具有与seq id no：4有至少95％同一性的轻链氨基酸序列和与seq id no：7有至少99％同一性的重链氨基酸序列的抗体。
[0108]
权利要求2的嵌合分子，其中所述ang-2拮抗剂肽可选地通过肽接头融合到所述抗体重链(hc)的n端。
[0109]
如权利要求3所述的嵌合分子，其中所述ang-2拮抗剂肽-hc融合多肽包含与选自seq id no：29、30和33具有至少99％同一性的氨基酸序列。
[0110]
如权利要求2所述的嵌合分子，其中所述ang-2拮抗剂肽可选地通过肽接头融合到所述抗体重链的c端。
[0111]
如权利要求5所述的嵌合分子，其中所述ang-2拮抗剂肽-重链融合多肽包含与选自seq id no：31，32和34中之一的氨基酸序列具有至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
[0112]
如权利要求2所述的嵌合分子，其中所述ang-2拮抗剂多肽通过肽接头融合到所述抗体重链的n端或c端；其中ang-2拮抗剂肽重链融合多肽包含与选自seq id no：37，39，41，43，45，47，49，51和53中之一具有至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
[0113]
如权利要求1所述的嵌合分子，其中所述vegf结合部分是具有与seq id no：4有至少95％同一性的轻链氨基酸序列和与seq id no：5有至少95％同一性的重链氨基酸序列的fab。
[0114]
如权利要求8所述的嵌合分子，其中所述ang-2拮抗剂肽通过肽接头与所述fab分子的重链的n-末端融合。
[0115]
如权利要求9所述的嵌合分子，其中所述ang-2拮抗剂肽-重链融合多肽具有与seq id no：19或seq id no：20有至少99％同一性的氨基酸序列。
[0116]
如权利要求8所述的嵌合分子，其中所述ang-2拮抗剂肽通过肽接头与所述fab分子的重链的c末端融合。
[0117]
如权利要求11所述的嵌合分子，其中所述ang-2拮抗剂肽-重链融合多肽具有与seq id no：25或seq id no：26有至少99％同一性的氨基酸序列。
[0118]
如权利要求1所述的嵌合分子，其中所述vegf结合部分是具有与seq id no：6有至
少95％同一性的氨基酸序列的scfv。
[0119]
如权利要求13所述的嵌合分子，其中所述ang-2拮抗剂肽与scfv的n-末端融合；其中肽-scfv融合物具有如seq id no：21或22所示的氨基酸序列。
[0120]
如权利要求13所述的嵌合分子，其中所述ang-2拮抗剂肽可选地与scfv的c-末端融合；其中肽-scfv融合物具有如seq id no：27或28所示的氨基酸序列。
[0121]
一种嵌合分子，其中所述嵌合分子包含具有一个或多个vegf结合部分和一个或两个ang-2拮抗剂肽的融合蛋白，其中所述vegf结合部分是与seq id no：3具有至少95％同一性的氨基酸序列的vegf捕获剂；其中所述嵌合分子包含两条相同的多肽链，每条具有与选自seq id no：15-17、23和24中之一有至少99％一致性的氨基酸序列。
[0122]
编码如权利要求1-16中任一项所述的嵌合分子的一种或多种多核苷酸。
[0123]
包含如权利要求17所述的一种或多种多核苷酸的一种或多种表达载体。
[0124]
用一个或多个如权利要求18所述的表达载体转染的宿主细胞。
[0125]
一种制备权利要求1-16中任一项的嵌合分子的方法，其包括在允许所述嵌合分子表达的条件下培养转染有一个或多个表达载体的宿主细胞和分离所述嵌合分子，所述表达载体包含编码权利要求1所述的嵌合分子的多核苷酸。
[0126]
一种药物组合物，其中所述药物组合物包含权利要求1-16中任一项所述的嵌合分子和药学上可接受的赋形剂。
[0127]
如权利要求21所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含一种或多种可接受的载体。
[0128]
如权利要求21所述的药物组合物，其中所述药物组合物为冻干制剂或水溶液形式。
[0129]
根据权利要求21所述的药物组合物，其中所述药物组合物包括载体，赋形剂，稀释剂，合适的粘合剂，润滑剂，悬浮剂，包衣剂或增溶剂中的一种或多种。
[0130]
一种治疗患有癌症，增殖性视网膜病变，湿性年龄相关性黄斑变性(wamd)，视网膜静脉闭塞(rvo)后黄斑水肿，糖尿病黄斑水肿(dme)或糖尿病视网膜病变(dr)的患者的方法，其中所述方法包括向受试者施用如权利要求21所述的药物组合物。
[0131]
最后，应当理解，尽管通过参考具体实施例突出了本说明书的各方面，但是本领域技术人员容易理解这些公开的实施例仅说明本发明公开主题的原理。因此，应该理解的是，除非明确说明，否则所公开的主题不限于本文所述的特定化合物，组合物，制品，设备，方法，方案和/或试剂等。另外，本领域普通技术人员将认识到，可以根据本文的教导进行某些改变，修改，置换，变更，增加，减少和子组合，而不背离本说明书的主题。因此，所附权利要求和此后引入对权利要求的解释包括了在其真正主题和范围内的所有上述改变，修改，置换，变更，增加，减少和子组合。
[0132]
本文描述了本发明的某些实施例，包括发明人已知的用于实施本发明的最佳方式。当然，在阅读了前文的描述之后，这些描述的实施例的变型对于本领域普通技术人员将变得显而易见。发明人期望熟练的技术人员适当地采用这样的变型，并且发明人希望以不同于本文具体描述的方式来实践本发明。因此，本发明包括适用法律所允许的所附权利要求中所述主题的所有修改和等同内容。而且，除非本文另外指出或与上下文明显矛盾，否则本发明涵盖上述实施例所有可能变型的任一组合。
[0133]
本发明的替代实施例，元件或步骤的分组不应被解释为限制。每个组成员可以单独引用，也可以与本文中公开的其他组成员进行任意组合。可以预期，出于简便和/或可专利性的原因，组中的一个或多个成员可以包括在组中或从中删除。当发生任何包含或删除时，说明书被认为包含经过修改的组，从而满足所附权利要求中使用的所有马库什组的书面描述。
[0134]
除非另有说明，否则在本说明书和权利要求书中使用的表示特征，项目，数量，参数，特性，术语等所有数字在所有情况下均应被理解为由术语“约”来修饰。在这里使用时，术语“约”是指经过限定的特性，项目，数量，参数，特性或术语涵盖所陈述值上下浮动百分之十的范围。因此，除非有相反的指示，否则说明书和所附权利要求书中提出的数字参数是可以变化的近似值。例如，由于质谱仪在确定给定分析物的质量方面可能略有变化，因此在离子质量或离子质荷比的上下文中，术语“约”是指+/-0.50原子质量单位。至少，并且不试图将等同原则的应用限制于权利要求的范围，每个数字的含义至少应根据所报告的有效数字以及通过应用普通的舍入法来进行解释。
[0135]
关于实施例或实施例的方面，术语“可以”或“能”的使用还带有“可以不”或“不能”的替代含义。这样，如果本说明书公开了一个实施例或实施例的一个方面可以作为或能够作为本发明主题的一部分被包括在内，则也明确地意味着否定限制或排除条件，即一个实施例或一个实施例的方面可以不被或不能被包括作为发明主题的一部分。以类似的方式，关于实施例或实施例的方面，术语“可选地”的使用意味着该实施例或实施例的方面可以被包括作为本发明主题的一部分，或者可以不被包括作为本发明主题的一部分。这种否定限制或排除条件的适用将基于所要求保护主题中是否记载了这些否定限制或排除条件。
[0136]
尽管阐述本发明宽泛范围的数值范围和值是近似值，但是在具体实施例中阐述的数值范围和值都是尽可能精确报告的。但是，任何数值范围或值都会固有地包含某些误差，这些误差必定是由它们各自试验测量中的标准偏差引起的。此处数值的数值范围的详述仅旨在用作分别指代该范围内的每个单独数值的简写方法。除非本文另有指出，否则数值范围的每个单独的值都被并入本说明书中，如同其在本文中被单独引用一样。
[0137]
除非另有说明或与上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中使用的术语“一个”，“一种”，“该”和类似的引用(特别是在以下权利要求的上下文中)应被解释为涵盖单数和复数两种情况。此外，标识元素的顺序指示符(例如“第一”，“第二”，“第三”等)用于区分元素，而不指示或暗示此元素必需或有限的数量，也不表示此元素的特定位置或顺序，除非另有明确说明。除非本文另有指出或与上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序执行。本文提供的任何和所有示例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，并不对以其他方式要求保护的本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应被解释为表示对实施本发明必要的任何未要求保护的要素。
[0138]
当在权利要求书中使用时，无论是按修正案提交还是增加，开放式过渡术语“包含”(及其同义的开放式过渡短语，例如包括，含有和具有)涵盖所有明确列举的要素，限制，步骤和/或单独或与未列举的主题结合使用的特征；命名的要素，限制和/或特征是必不可少的，但是可以添加其他未命名的要素，限制和/或特征，并且仍然在权利要求范围内形成一个组。这里披露的具体实施方式可在权利要求书中用封闭式过渡短语“由
……
组成”或“基本上由
……
组成”代替或修订“包含”来进一步限制。当在权利要求书中使用时，无论是
按修正案提交还是增加，封闭式过渡短语“由
……
组成”均不包括权利要求书中未明确列举的任何要素，限制，步骤或特征。封闭式过渡短语“基本上由...组成”将权利要求的范围限制为明确列举的要素，限制，步骤和/或特征以及不实质性影响所要求保护主题基本和新颖特征的任何其他要素，限制，步骤和/或特征。因此，开放式过渡短语“包含”的含义被定义为涵盖所有具体列举的要素，限制，步骤和/或特征以及任何可选的，附加的未指定要素。封闭式过渡短语“由
……
组成”的含义被定义为仅包括权利要求中具体列举的那些要素，限制，步骤和/或特征，而封闭式过渡短语“基本上由
……
组成”的含义被定义为仅包括权利要求中具体列举的那些要素，限制，步骤和/或特征，以及不实质性影响所要求保护主题基本和新颖特征的那些要素，限制，步骤和/或特征。因此，开放式过渡短语“包含”(及其同义的开放式过渡短语)在其含义内包括由限制的封闭式过渡短语“由
……
组成”或“基本上由
……
组成”限定的要求保护的主题。如本文所描述的实施例或由短语“包含”所要求保护的是对本文中短语“基本上由...组成”和“由...组成”进行的清楚或固有明确的描述，授权和支持。
[0139]
本说明书中引用和标识的所有专利，专利公开文本和其他出版物均通过引用以其整体单独地和明确地并入本文，以进行描述和公开，例如在这些出版物中描述的组合物和方法可能用于本发明相关的内容中。提供这些出版物仅是出于其是在本申请的申请日之前公开的原因。在这方面，任何内容都不应被解释为承认发明人借助在先发明或任何其他原因而导致无权早于上述公开。关于这些文件的日期或内容的所有陈述均基于申请人可获得的信息，并不构成对这些文件日期或内容的正确性的承认。
[0140]
最后，本文所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，而无意限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求书限定。因此，本发明不限于精确地解释和描述。序列seq id no：1，贝伐单抗重链：seq id no：2，贝伐单抗轻链：
seq id no：3，vegf捕获剂阿柏西普vegf捕获剂阿柏西普seq id no：4，蛋白序列的轻链，雷珠单抗(vegf fab)seq id no：5，蛋白序列的重链，雷珠单抗(vegf fab)seq id no：6，vegf scfv的蛋白序列seq id no：7，vegf抗体重链的蛋白序列
seq id no：8，l1-7seq id no：9，l1-10seq id：no：10，l1-15seq id no：11，l1-7bseq id no：12，li-10bseq id no：13，l1-15bseq id no：14，cvx-060：seq id no 15，l1-15融合到vegf捕获剂n-端，连接肽ggggsggggsggggsseq id no 16，amd-i的蛋白序列(l1-15融合到vegf捕获剂)
wherein xaa1为a，g，或缺失；xaa2为q或a或缺失；xaa25为l或缺失；xaa5为y或f；xaa12为d或e；xaa13为q或k；xaa 17为d或e；xaa26为e或缺失；n＝0，1，2，3，4，或5；c端氨基酸残基k可以为缺失.seq id no 17，amd-j的蛋白序列(l1-7融合到vegf捕获剂)wherein xaa1为a，g，或缺失；xaa2为q或a或缺失；xaa26为l或缺失；xaa27为e或缺失；n＝0，1，2，3，4，或5；c端氨基酸残基k可以为缺失.seq id no 19，amd-k重链的蛋白序列(l1-15融合到vegf fab)wherein xaa1为a，g，或缺失；xaa2为q或a或缺失；xaa5 is y或f；xaa12 is d或e；xaa13 is q或k；xaa 17 is d或e；xaa25 is l或缺失；xaa26 is e is缺失；and n＝0，1，2，3，4，或5.seq id no 20，amd-l重链的蛋白序列(l1-7融合到vegf fab)wherein xaa1为a，g，或缺失；xaa2为q或a或缺失；xaa26为l或缺失；xaa27为e或缺失；and n＝0，1，2，3，4，或5.seq id no 21，amd-n的蛋白序列(l1-15融合到vegf scfv)wherein xaa1为a，g，或缺失；xaa2为q或a或缺失；xaa5为y或f；xaa12为d或e；xaa13为q或k；xaa 17为d或e；xaa25为l或缺失；xaa26为e或缺失；and n＝0，1，2，3，4，或5
seq id no 22，amd-q的蛋白序列(l1-7融合到vegf scfv)wherein xaa1为a，g，或缺失；xaa2为q或a或缺失；xaa26为l或缺失；xaa27为e或缺失；and n＝0，1，2，3，4，或5.seq id no 23，amd-i-c端的蛋白序列(l1-15融合到vegf捕获剂的c-端)端)wherein xaa1为a，g，或缺失；xaa2为q或a或缺失；xaa5为y或f；xaa12为d或e；xaa13为q或k；xaa 17为d或e；xaa25为l或缺失；xaa26为e或缺失；and n＝0，1，2，3，4，或5.seq id no 24，amd
--
j-c端的蛋白序列(l1-7融合到ve6f捕获剂的c-端)wherein xaa1为a，g，或缺失；xaa2为q或a或缺失；xaa26为l或缺失；xaa27为e或缺失；and n＝0，1，2，3，4，或5.seq id no 25，amd-k-c端重链的蛋白序列(l1-15融合到vegf fab的c-端)wherein xaa1为a，g，或缺失；xaa2为q或a或缺失；xaa5为y或f；xaa12为d或e；xaa13为q或k；xaa 17为d或e；xaa25为l或缺失；xaa26为e或缺失；and n＝0，1，2，3，4，或5.seq id no 26，amd-l-c端重链的蛋白序列(l1-7融合到vegf fab)wherein xaa1为a，g，或缺失；xaa2为q或a或缺失；xaa26为l或缺失；xaa27为e或缺失；and n＝0，1，2，3，4，或5.seq id no 27，amd-n-c端的蛋白序列(l1-15融合到vegf scfv的c-端)
wherein xaa1为a，g，或缺失；xaa2为q或a或缺失；xaa5为y或f；xaa12为d或e；xaa13为q或k；xaa 17为d或e；xaa25为l或缺失；xaa26为e或缺失；and n＝0，1，2，3，4，或5.seq id no 28，amd-q-c端的蛋白序列(l1-7融合到vegf scfv)scfv)wherein xaa1为a，g，或缺失；xaa2为q或a或缺失；xaa26为l或缺失；xaa27为e或缺失；and n＝0，1，2，3，4，或5.seq id no：29，askb712-o的蛋白序列(l1-15融合到vegf-结合抗体的n-端)seq id no：30，askb712-o3的蛋白序列(l1-15融合到vegf-结合抗体的n-端)端)wherein xaa1为a，g，或缺失；xaa2为q或a或缺失；xaa5为y或f；xaa12为d或e；xaa13为q或k；xaa 17为d或e；xaa25为l或缺失；xaa26为e或缺失；n＝0，1，2，3，4，或5；c端氨基酸残基k可以为缺失.seq id no：31，askb712-o2的蛋白序列(l1-15融合到vegf-结合抗体的c-端)seq id no：32，askb712-o4的蛋白序列(l1-15融合到ve6f-结合抗体的c-端)
wherein xaa1为a，g，或缺失；xaa2为q或a或缺失；xaa25为l或缺失；xaa5为y或f；xaa12为d或e；xaa13为q或k；xaa 17为d或e；xaa26为e或缺失；n＝0，1，2，3，4，或5.seq id no：33，askb712-p的蛋白序列(l1-7融合到vegf-结合抗体的n-端)wherein xaa1为a，g，或缺失；xaa2为q或a或缺失；xaa26 is l或缺失；xaa27为e或缺失；and n＝0，1，2，3，4，或5.seq id no：34，askb712-p2的蛋白序列(l1-7融合到vegf-结合抗体的c-端)wherein xaa1为a，g，或缺失；xaa2为q或a或缺失；xaa26为l或缺失；xaa27为e或缺失；seq id no：35-712o_l7_3xgs_dna序列
seq id no：36-712o_l7_2xgs_dna序列seq id no：37-712o_l7_2xgs_蛋白序列
seq id no：38-712o_l7_1xgs_dna序列712o_l7_1xgs_dna序列seq id no：39-712o_l7_1xgs_dna序列seq id no：40 712o_l10_3xgs_dna序列
seq id no：41 712o_l10_3xgs_蛋白序列seq id no：42 712o_li0_2xgs_dna序列
seq id no：43 712o_l10_2xgs_蛋白序列seq id no：44 712o_l10_3xgs_dna序列
seq id no：45 712o_l10_1xgs_蛋白序列seq id no：46 712o_c端l7_1xgs_dna序列
seq id no：47 712o_c端l7_1xgs_蛋白序列seq id no：48 7120_l7_c_2xgs_dna序列seq id no：49 7120_l7_c_2xgs_蛋白序列seq id no：50 712o_l7_c_3xgs_dna序列
seq id no：51 712o_l7_c_3xgs_蛋白序列seq id no：52 7120_l15_c_1xgs_dna序列
seq id no：53 7120_l15_c_1xgs_蛋白序列seq id no：54 712o_l15_c_2x6s_dna序列seq id no：55 712o_l15_c_2xgs_蛋白序列
seq id no：56 712o_l15_c_3xgs_dna序列seq id no 57，dna序列(dhamdh02083016)for 2xcon4(c)融合到贝伐单抗重链的c-端，连接肽ggggsggggsggggs
seq id no 58，dna序列(dhamdl083016)，贝伐单抗的轻链seq id no 59，dna序列(ly2.55.1)，l1-15肽(没有le)融合到贝伐单抗轻链的n-端seq id no 60，dna序列(ly2.55.2)，l1-15肽(有le)融合到贝伐单抗轻链的n-端端seq id no 61，dna序列(ly2.55.3)，l1-15肽(没有le)融合到贝伐单抗重链的n-端
seq id no 62，dna序列(ly2.55.4)，l1-15肽(有le)融合到贝伐单抗重链的n-端端seq id no 63，dna序列(ly2.55.5)，贝伐单抗的轻链
seq id no 64，2xcon4(c)融合到vegf捕获剂的c-端

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