一种TZAP基因或蛋白作为提高间充质干细胞增殖及分化能力的靶点中的应用的制作方法

一种tzap基因或蛋白作为提高间充质干细胞增殖及分化能力的靶点中的应用
技术领域
[0001]
本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种tzap基因或蛋白作为提高间充质干细胞增殖及分化能力的靶点中的应用。


背景技术：

[0002]
间充质干细胞(mscs)是一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力。在临床应用也最多，与造血干细胞联合应用，可以提高移植的成功率，加速造血重建。当患者接受大剂量化疗后，将间充质干细胞与造血干细胞一同输入，可明显加速患者血细胞恢复时间，且安全无不良反应。间充质干细胞不仅存在于骨髓中，也存在于骨骼肌、骨外膜和骨小梁中。由于它分化的组织类型十分广泛，因此临床应用价值不菲。
[0003]
mscs移植具有诸多优点，如免疫排斥轻、来源广泛等，但mscs移植尚面临诸多难题：
[0004]
1)体内安全性有待评估。体外扩增的mscs移植后在体内长期存在是否有致瘤风险目前仍未可知。
[0005]
2)mscs体外活性的维持。体外培养条件下如何更好地维持mscs的干性目前尚无确切答案。
[0006]
3)mscs移植后迁移与分化。
[0007]
如何促进移植的mscs在体内的分化率和存活率并向目标区域迁移，如何把握mscs移植的合适时间和数量，如何促进mscs向成骨细胞的分化，也是亟待解决的问题。


技术实现要素：

[0008]
有鉴于此，本发明提供了一种tzap基因或蛋白作为提高间充质干细胞增殖及分化能力的靶点中的应用。敲除tzap基因后，mscs的增殖、分化能力明显升高。
[0009]
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0010]
本发明提供了一种tzap基因或蛋白作为间充质干细胞干性标志物中的应用。
[0011]
本发明还提供了一种tzap基因或蛋白作为提高间充质干细胞增殖及分化能力的靶点中的应用。
[0012]
本发明中使用cas9和sgrna整合一起的lenticrisorv2质粒，应用crisp/cas9技术，通过设计靶向tzap的sgrna进行敲除，将构建好的lenticrisprv2-tzap慢病毒载体与慢病毒包装质粒共转染，获得敲除慢病毒。用嘌呤霉素筛选慢病毒感染过人mscs，通过qpcr及westemblot检测成功构建tzap敲除细胞系。
[0013]
发明人应用crisp/cas9技术建立tzap敲除人骨髓间充质干细胞系，观察其增殖、自我更新和分化能力。首先评估了所设计的cas9的敲除效率，基因组测序、实时定量pcr和免疫印记结果显示，敲除tzap的mscs的mrna水平和蛋白水平，与对照相比，差异有显著性(p＜0.05)。并且，tzap基因敲除的mscs的增殖率(brdu阳性细胞数量及cck8实验od值)显著高
于对照组，这些结果表明tzap在mscs的增殖和生长中起着重要的促进作用。
[0014]
进一步了解tzap对mscs分化能力的作用，进行了mscs分化的实验，tzap敲除组与tzap未敲除的对照组相比，成骨分化及成脂分化细胞数明显增加(茜素红染色及油红o染色阳性细胞数增多)，并且成骨标志物(alp，runx2和andcol1a1)脂肪分化标志物(cebpa)的mrna的表达水平表达量明显升高，表明mscs的分化能力均显著升高。且敲除tzap的mscs衰老细胞数明显减少(β-gal染色阳性细胞数明显减少)。这些数据表明，tzap在调控mscs的增殖及分化中发挥重要作用。
[0015]
作为优选，间充质干细胞为哺乳动物间充质干细胞。
[0016]
优选地，间充质干细胞为人间充质干细胞。
[0017]
优选地，间充质干细胞为骨髓间充质干细胞。
[0018]
作为优选，分化能力为成骨分化能力和/或成脂分化能力。
[0019]
作为优选，提高间充质干细胞分化能力的方法为：采用tzap基因或蛋白的抑制剂作用于tzap基因或蛋白，降低tzap基因或蛋白的表达量。
[0020]
作为优选，提高间充质干细胞分化能力的方法为：采用crisp/cas9技术敲除tzap基因。
[0021]
crisp/cas9技术其原理是crrna(crispr-derivedrna)通过碱基配对与tracrrna(trans-activatingrna)结合形成双链rna，然后tracrrna/crrna复合体引导cas9蛋白切断双链dna。通过人工设计有引导作用的sgrna(single-guiderna)，来引导cas9核酸酶对dna的进行定点切割。
[0022]
作为优选，方法包括以下步骤：
[0023]
s1.将sgrna片段连入慢病毒系统敲除载体，获得重组质粒；
[0024]
s2.重组质粒和包装质粒对宿主细胞进行共转染，得到包装体；
[0025]
s3.将包装体感染间充质干细胞。
[0026]
作为优选，sgrna的核苷酸序列如seq id no：1所示：tgcgatgccaccttggacgt；
[0027]
优选地，慢病毒系统敲除载体为lenticrispr v2。
[0028]
优选地，包装质粒为pmd2.g和pspax。
[0029]
优选地，宿主细胞为293t细胞。
[0030]
优选地，moi值为9～11进行转染。
[0031]
更优选地，moi值为10。
[0032]
优选地，用嘌呤霉素筛选慢病毒感染过的间充质干细胞。
[0033]
以上的重组质粒和/或包装体在促进人间充质干细胞成骨及成脂分化中的应用，也属于本发明的保护范围。
[0034]
本发明提供了一种tzap基因或蛋白作为提高间充质干细胞增殖及分化能力的靶点中的应用。还提供了tzap基因或蛋白还可作为间充质干细胞干性标志物中的应用。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0035]
本发明发现了使用crisp/cas9技术敲除tzap基因后，mscs的增殖、分化能力明显升高，衰老细胞数明显减少；发现了tzap对mscs的增殖、自我更新和分化中发挥积极作用。本发明首次揭示了tzap基因对mscs的干性及及其成骨成脂分化的影响，为间充质干细胞大量体外扩增并维持其干性及应用提供新的方案，为间充质干细胞大量体外扩增并维持其干
性及在骨相关疾病治疗方面的应用提供新的方案，具有很大的应用价值和前景。
附图说明
[0036]
图1qrt-pcr结果显示敲除组(ko)中tzap的表达水平显著低于对照组(v2)(p＜0.01)；
[0037]
图2westernblot敲除组(ko)中tzap的表达水平显著低于对照组(v2)(p＜0.01)；
[0038]
图3敲除组(ko)和对照组(v2)edu阳性细胞数；
[0039]
图4敲除tzap细胞生长曲线；
[0040]
图5a敲除组(ko)钙盐沉积、钙结节及脂滴形成能力高于对照组
[0041]
图5b敲除组成骨(alp、runx2、col1a1)相关基因表达明显高于对照组。
具体实施方式
[0042]
本发明公开了一种tzap基因或蛋白作为提高间充质干细胞增殖及分化能力的靶点中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0043]
本发明提供的tzap基因或蛋白作为提高间充质干细胞增殖及分化能力的靶点中的应用中所用质粒、试剂等均可由市场购得。
[0044]
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0045]
实施例1 tzap基因稳定转化敲除细胞株的建立
[0046]
一、实验方法
[0047]
1、目的基因获取
[0048]
采用慢病毒系统载体lenticrispr v2，将针对目的基因的tzap序列的sgrna连接到载体上，tzap sgrna序列(seq id no：1)如下：tgcgatgccaccttggacgt(exon2)，酶切位点：bsmbi，用基因合成的方法获得目的质粒lenticrispr v2-tzap，重组质粒lenticrispr v2-tzap的序列如下：
[0049]
[0050]
[0051]
[0052]
[0053][0054]
2、重组质粒转化感受态细胞
[0055]
重组质粒加入预冷的dh5α感受态细胞冰浴30min；42℃热敷90s(期间不要振荡)；再次冰浴2～3min；加入800μl不含抗生素的l.b.液体培养基，于37℃、200r/min振荡培养45min；吸取100μl菌液涂布于kan抗性平板，并于培养箱中先正置培养1h，后倒置培养12～16h。挑取抗性平板上的菌落，分别接种于lb液体培养基中培养(含10μg/ml卡那霉素)，于37℃、200r/min振荡培养过夜，用无内毒素的质粒提取试剂盒提取质粒。
[0056]
3、慢病毒颗粒的包装及moi测定
[0057]
采用lenticrispr v2-tzap重组质粒与两个包装质粒(pmd2.g，pspax)对293t细胞进行共转染。经培养、富集后即得高滴度病毒浓缩液。病毒感染复数(multiplicity of infection，moi)应用lenti-x gostix(clontech，takara，ca)进行检测。使用moi值为9～11的病毒进行细胞转染，随后使用嘌呤霉素筛选敲除细胞株。未重组目的基因的空质粒lenticrispr v2也同时被包装生产作为空载体对照组。
[0058]
二、实验结果
[0059]
慢病毒颗粒的moi指数为10。
[0060]
实施例2实时定量pcr检测敲除效率
[0061]
一、实验方法
[0062]
1、细胞总rna抽提
[0063]
(1)细胞生长状态良好时，去掉上清，pbs洗除血清，加入1ml trizol，静置5分钟，保证trizol充分裂解细胞，将细胞从培养皿上吹打下来，液体转移至离心管内，反复吹打直到无明显大块沉淀；室温静置5min；
[0064]
(2)离心机4℃预冷，12,000g离心5min，上清转移至新的1.5ml离心管中；
[0065]
(3)加入200μl氯仿，漩涡仪振荡，于4℃离心机中以12,000g离心15min，此后液体
分为三层；
[0066]
(4)吸取上层水相(注意不要碰到中间的蛋白质层)，转入新的rnaasefree的离心管中；
[0067]
(5)加入等体积的异丙醇，轻柔地上下颠倒5次，室温静置10min；
[0068]
(6)12,000rpm转速，4℃离心10min，此时出现白色沉淀；
[0069]
(7)弃上清，加入1ml经depc处理的75％乙醇，上下颠倒数次洗涤沉淀；7500g离心5分钟，弃上清保留沉淀；
[0070]
(8)rna于室温下干燥10min，然后加入无rna酶的水溶解；
[0071]
(9)测量od值，以确定rna的浓度和质量，然后置于-80℃保存。
[0072]
2、反转录反应(reverse transcription，rt)
[0073]
将检测完好的rna进行逆转录反应，按照primescript
tm
rt reagent kit逆转录试剂盒说明书进行cdna的合成。在0.2ml rnasefree的ep管中配制下列混合液：
[0074][0075]
将上述反应液混合均匀后，于pcr仪中设置如下条件进行反转录：37℃15min，85℃5sec，待反应完成后，所得产物用ddh
2
o稀释5倍(20μl产物中加入80μl ddh
2
o)后，置于-20℃保存备用。
[0076]
3、qrt-pcr反应
[0077]
qrt-pcr按照sybr premix ex taq
tm
荧光定量pcr试剂盒说明书进行操作，以cdna为模板，以u6为内参，检测mir-155的表达。按下列组份配制pcr反应液(冰上避光操作)：
[0078][0079]
将上述各组分混合均匀后，使用mx3005p定量pcr仪进行荧光定量pcr反应。
[0080]
反应程序设定为95℃预变性30s；95℃5s、60℃30s、72℃30s，循环总数为40个。反应后进行熔解曲线的检测，为检测产物特异性，取5μl产物行1％琼脂糖凝胶电泳。以上实验
均重复3次。结果以ct值显示，ct(c：cycle，t：threshold)值为每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。应用相对定量法来对mrna的表达差异进行比较。
[0081]
所用引物见下表：
[0082]
geneforward primer(5
′-
3
′
)reverse primer(5
′-
3
′
)pgapdhggtgatgctggtgctgagtacagtcttctgggtggcagtptzapctcggaacaggtcttcacaggaggagcacttgtagg
[0083]
其中，pgapdh作为内参。
[0084]
二、实验结果
[0085]
结果显示，tzap敲除细胞株中tzap在转录水平表达显著降低，证明sgrna敲除效率是切实有效的(图1)。
[0086]
实施例3蛋白免疫印迹(westernblot)检测tzap蛋白表达情况
[0087]
一、实验方法
[0088]
1、mscs总蛋白的提取
[0089]
按说明书(lysis buffer南京凯基生物科技发展有限公司)配制含有蛋白酶抑制剂、pmsf、磷酸酶抑制剂的蛋白裂解液，置于冰上数分钟待用。取敲除tzahmscs，弃去上清培养基，用pbs洗涤1次；根据细胞沉淀的量加入相应的细胞裂解液，冰上振摇孵育30min，收集液体至ep管中，4℃12,000g
×
离心30min，将上清移至一新的ep管中，-80℃保存备用。
[0090]
2、蛋白含量的测定
[0091]
用bca试剂盒对蛋白进行定量，具体方法如下：
[0092]
(1)完全溶解蛋白标准品，取10μl稀释至100μl，使终浓度为0.5mg/ml；
[0093]
(2)将标准品按0，1，2，4，8，12，16，20μl加到96孔板的标准品孔中，加pbs补足到20μl；
[0094]
(3)加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加pbs溶液到20μl；
[0095]
(4)根据样品数量，按50体积bca试剂a加1体积bca试剂b(50∶1)配制适量bca工作液，充分混匀。各孔加入200μl bca工作液，37℃放置30分钟；
[0096]
(5)酶标仪读取波长573nm吸光度值。
[0097]
(6)以吸光度值为纵坐标，标准蛋白浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据标准曲线，计算样品的浓度。
[0098]
3、蛋白免疫印迹
[0099]
(1)配制10％sds-page分离胶
[0100]
依次加入h
2
o、30％丙烯酰胺、tris-hcl(ph8.8)、10％sds，混匀后加入10％过硫酸铵、temed，充分混匀后，灌入玻璃板，用去离子水封胶，约半小时后，胶凝固，出现明显折线，将去离子水倒掉，滤纸吸干。
[0101]
(2)配5％sds-page浓缩胶
[0102]
依次加入h
2
o、30％丙烯酰胺、tris-hcl(ph6.8)、10％sds，混匀后加入10％过硫酸铵、temed，充分混匀后，灌入玻璃板，插入梳子，注意不要有气泡。
[0103]
(3)准备蛋白样品
[0104]
取20μg蛋白质，与5
×
sds上样缓冲液4∶1混合，95℃水浴10min变性蛋白。
[0105]
(4)上样
[0106]
在内槽倒入电泳缓冲液，水平面高于胶上缘，垂直拔出梳子，用1ml注射器清洗每个加样孔，加样，尽量避免出现气泡。
[0107]
(5)跑胶
[0108]
将内槽放入电泳槽内，倒入缓冲液至指定位置，浓缩胶恒压80v，分离胶恒压100v。
[0109]
(6)转膜
[0110]
转膜液配制为tris碱3.03g、甘氨酸14.4g、甲醇200ml、补水至1000ml。加入甲醇后会产热，配制后于冰上冷却后再用；按照蛋白质marker所指示的条带位置，将目的片段所在位置切下来，放在滤纸上，剪一张与凝胶大小相同的pvdf膜，先在甲醇湿润5min，使膜亲水，轻轻覆盖在凝胶上，将气泡赶走，组装好转膜夹层(黑色面在下)、海绵垫、滤纸、凝胶、pvdf膜、滤纸、海绵垫；将夹子放入tiaron盒中，放入电泳槽中，加入转膜液，盖上盖子，放入盛满碎冰的盆中，恒流350ma，直至相应蛋白转移至pvdf膜上。
[0111]
(7)免疫杂交封闭
[0112]
取出pvdf膜，先于tbst中漂洗下，将pvdf膜放入3％bsa的tbst的平皿中封闭，室温摇床1h；一抗：沥干封闭液，加入一抗(不同条带分别加入相应稀释抗体)，4℃冰箱孵育过夜；从冰箱中取出平皿，摇床30min至室温，之后tbst洗膜3次，每次10min；二抗：加入二抗(1∶1000稀释)，室温孵育1h，tbst洗膜3次，每次10min。
[0113]
(8)显影(ecl法)配制显影液
[0114]
ecla液与b液等体积混合，高灵敏度化学发光成像系统下成像拍照。
[0115]
其中，将细胞裂解物分别检测tzap和gapdh的表达，gapdh作为对照。
[0116]
二、实验结果
[0117]
结果显示，tzap敲除细胞株中tzap的蛋白表达显著降低，证明sgrna敲除效率是切实有效的(图2)。
[0118]
实施例4edu细胞增殖检测实验
[0119]
一、实验方法
[0120]
稳定敲除tzap的hmscs生长到80％覆盖度时，去掉上清，pbs洗除血清，0.05％胰酶1ml消化5分钟，培养基终止，吹打成单细胞悬液，用countstar细胞计数仪进行计数，均按照每孔500μl 5
×
10
4
的细胞总量，分别种于96孔板中，置于37℃、5％co
2
二氧化碳培养箱中过夜。
[0121]
待细胞培养至正常生长阶段后按照如下方式继续进行培养。
[0122]
(1)每孔加入100μl 50μm edu培养基孵育2小时，pbs清洗细胞2次；
[0123]
(2)每孔加50μl细胞固定液(即含4％多聚甲醛的pbs)室温孵育30分钟后，加入50μl 2mg/ml甘氨酸中和，然后弃掉；随后加入100μl渗透剂(0.5％tritonx-100的pbs)脱色摇床孵育10分钟；pbs漂洗2次；
[0124]
(3)每孔加入100μl的1x染色反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30分钟后，弃染色反应液；加入100μl渗透剂(0.5％tritonx-100的pbs)脱色摇床清洗2～3次，每次10分钟，弃渗透剂；
[0125]
(4)每孔加入100μl 1x hoechst 33342反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30分钟后，弃染色反应液；每孔每次加入100μl pbs清洗1～3次；
[0126]
将细胞置于pbs中，4℃保存，荧光显微镜进行拍照并计数。用image j软件和t检
验，以双盲方式对细胞的增殖水平进行定量分析。
[0127]
二、实验结果
[0128]
结果表明，稳定遗传的敲除tzap的细胞株中edu的掺入明显较对照组增加(图3)，说明了tzap敲除细胞株增殖能力增加。
[0129]
实施例5 cck8检测细胞增殖实验
[0130]
一、实验方法
[0131]
收集对数生长期细胞，计数，用完全培养基重新悬浮细胞，调整细胞浓度5.0～6.0
×
10
4
cells/ml，接种96孔板，每孔加100μl的细胞悬液约5000～6000个细胞，在37℃、5％co
2
条件下孵育过夜。待细胞铺板孵育过夜后(16～24小时)，弃去原培养基，按以上分组及处理，置于37℃含5％co
2
培养箱中孵育分别24、48、72小时后；分别向每孔中加入10μl cck8溶液，继续于细胞培养箱内培养2h。于酶标仪上测定od
450
。以时间为横坐标，od
450
为纵坐标绘制细胞生长曲线。
[0132]
二、实验方法
[0133]
结果所示，tzap敲除组(ko)细胞的生长速度明显高于对照组(v2)，敲除tzap基因的hmscs细胞增殖明显升高(图4)。
[0134]
实施例6 mscs的成骨分化实验
[0135]
一、实验方法
[0136]
成骨诱导培养液：高糖dmem+10％fbs+0.1μmol/l地塞米松+50μmol/l抗坏血酸+10μmol/l β-甘油磷酸钠。
[0137]
成骨诱导的方法：收集mscs细胞悬液，以1
×
10
5
细胞/孔的密度铺入六孔板中，细胞生长24h后即可用成骨诱导培养液培养，每隔3d换液，细胞长满时进行正常传代，培养2～3周后用茜素红染液染色。显微镜下观察即可。阳性区域呈现鲜红色。
[0138]
二、实验方法
[0139]
结果所示，敲除组(ko)钙盐沉积、钙结节及脂滴形成能力高于对照组(图5a)，敲除组成骨(alp、runx2、col1a1)相关基因表达明显高于对照组(图5b)。结果表明敲除tzap基因，细胞成骨诱导分化能力明显增强。
[0140]
实施例7mscs的成脂分化实验
[0141]
一、实验方法
[0142]
成脂诱导培养液：高糖dmem+10％fbs+10μmol/l地塞米松+10μmol/l胰岛素+200μmol/l吲哚美辛；
[0143]
成脂维持培养液：高糖dmem+10％fbs+0.2nmol/l胰岛素。
[0144]
成脂诱导方法：收集mscs细胞悬液，以1
×
10
5
细胞/孔的密度铺入六孔板中，细胞生长24h后先用成脂诱导培养液培养3d，然后用成脂维持培养液培养2d，如此往复循环3次后，用成脂维持培养液继续培养5-7d即可用油红o进行染色。油红o染色在细胞成脂肪诱导结束后，弃除培养液，pbs洗3次，10％甲醛固定30min，pbs冲洗3次，蒸馏水洗3次，室温干燥后，油红o染色液作用40min。显微镜下观察即可。阳性区域呈红色。
[0145]
二、实验方法
[0146]
结果显示，敲除组(ko)钙盐沉积、钙结节及脂滴形成能力高于对照组(图5a)，成脂(cebpa)相关基因表达明显高于对照组(图5b)，提示敲除tzap的hmscs细胞成脂分化能力明
显升高。
[0147]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

起点商标作为专业知识产权交易平台，可以帮助大家解决很多问题，如果大家想要了解更多知产交易信息请点击 【在线咨询】或添加微信 【19522093243】与客服一对一沟通，为大家解决相关问题。

此文章来源于网络,如有侵权,请联系删除