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您当前的位置： 氟苯尼考/甲砜霉素单抗杂交瘤细胞株及其分泌的单抗和应用的制作方法
2021-02-02 12:02:01|
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起点商标网 [0001]本发明涉及生物
技术领域：
：，具体涉及氟苯尼考/甲砜霉素单抗杂交瘤细胞株及其分泌的单抗和应用。
背景技术：
：：[0002]氯霉素类抗生素(包括氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考)以抗菌谱广、机体易吸收、用药成本低等优点广泛应用于动物细菌病的防治，经多年使用通过食物链对人体毒副作用日益凸显尤其是氯霉素导致人体再生障碍性贫血而倍受关注。为此包括中国在内许多国家明文规定肉禽蛋奶水产品中氯霉素不得检出，这意味着其残留量必须低于0.1ppb这是现有检测技术最高检出限。[0003]鉴于氯霉素被禁用，以甲砜基替代氯霉素分子苯环上硝基的衍生物第二代氯霉素类抗生素：甲砜霉素、氟苯尼考对动物与人体的毒副作用大大地降低，仍以其广谱、高效、吸收迅速、分布广泛安全、动物专用等特点作为氯霉素替代药物在国内外畜牧和水产养殖细菌病治疗中迅速获得广泛推广使用，尽管其毒副作用远远小于氯霉素，仍对机体一定毒副作用如甲砜霉素对机体免疫系统发育的抑制；氟苯尼考对胚胎发育的抑制等不容小觑，为此我国规定动物源可食部分中二种药物最高残留标准均小于100-1000ppb。[0004]近十多年来，既德国拜发(r-biopharm)公司将氯霉素elisa专用检测试剂盒推向中国市场后，中国农业大学沈建忠院士团队与北京维德维康公司联合也推出相应的快检产品，特别是江南大学胥传来教授团队推出针对氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考三联胶体金测试条等氯霉素类快检产品，尽管这些产品在畜禽中氯霉素类单目标物或/和多种目标物残留的高通量筛查起了不可替代的作用，由于免疫快检产品自身局限性特别是同类目标物之间免疫交叉性因而无法对目标物每种单一目标物完全明确界定以及精确定量，更不能作为违禁或超标使用后的行政处罚法律依据，仅起阴性排除作用。[0005]鉴于此，国内各级食安检等部门更加关注机测分析。近年来，这些部门均配备了waters和agilent等国际知名公司的gc-ms、hplc-ms/ms、uplc-ms/ms等功能强大分析设备，其色谱分离水平、检测器信号响应水平等技术参数能满足上述三种目标物残留限的国家标准，但由于检测通量低、技术要求高、检测成本高等因素很难满足实际待检样本需求量；更重要的是，检测数据的真实性与可靠性以及再现性压倒性地取决于样本前处理效果，对于氯霉素类抗生素残留样本机测前处理，包括2008年修订的氯霉素类残留检测国家标准在内等多种测试方案，其样本前处理均采用常规理化处理模式，其中固相萃取小柱净化环节为关键步骤，并存在多种技术瓶颈：[0006]1.操作繁杂环节多目标物损失很大甚至丢失；[0007]2.尽管三种目标物归为同一类，但其理化性质差异较大，故而很难用单一固相萃取小柱净化同时获得满意回收率；[0008]3.固相萃取小柱净化很难完全排除基质的干扰；[0009]4.经固相萃取柱净化其目标物回收率很低，必须用其对应同位素标准品作为内标对前处理回收率加以纠正才能较精确地推算出待测样本目标物的实际残留量，不仅其检测成本很高，同时有放射性废料存放与处理之累。[0010]5.固相萃取小柱spe(solidphaseextractioncartridge)依赖进口，受新冠疫情影响，其供应链有中断之虞。[0011]基于上述待机测样本理化前处理的技术瓶颈，以氯霉素类特异性抗体对其具有强特异性(选择性)、高亲和力以及抗原-抗体反应可逆性的基本原理，制备氯霉素强特异性免疫亲和层析色谱胶并以其作机测前处理的模式，可将免疫层析技术对目标物的强选择性和高富集性与色谱柱对目标物有效色谱分离以及检测器强大的分子信息解析能力完美结合起来，这种联合技术是相关学者追求的目标。[0012]尽管近十多年来国内有大量针对氯霉素对应抗体制备、近几年来也有一些针对氟苯尼考/甲砜霉素抗体制备零星的报道，但其在免疫亲和层析技术中应用报道甚少、特别是用一步免疫层析法同时富集待测样本中上述三种目标物未见正式报道，限制了该项技术对hplc-fld或lc-ms/ms检测强大技术支持作用。技术实现要素：[0013]有鉴于此，本发明的目的在于提供一种氟苯尼考/甲砜霉素单抗杂交瘤细胞株及其产生的单抗，使得所述杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体同时对氟苯尼考和甲砜霉素有较高的交叉反应，而且对氟苯尼考具有极高的检测灵敏度(ic50为1.35ppb)和较高工作滴度(工作稀释度为1：40000)；[0014]本发明的另外一个目的在于提供一种采用上述单克隆抗体制备的免疫亲和层析色谱胶和机测前处理试剂组成的免疫亲和层析试剂，使得经所述免疫亲和层析色谱胶机测前处理后具有极佳的检出限、定量限、回收率、净化能力和抗基质效应能力等多种优异效果；[0015]本发明的另外一个目的在于提供上述单克隆抗体制备的免疫亲和层析色谱胶和机测前处理试剂在对氯霉素类抗生素残留样本预处理和/或检测中的应用。[0016]本发明的另外一个目的在于提供采用上述单克隆抗体制备的免疫亲和层析色谱胶、氯霉素单克隆抗体制备的免疫亲和层析色谱胶和机测前处理试剂组成的免疫亲和层析试剂，使得经所述免疫亲和层析试剂机测前处理后具有极佳的检出限、定量限、回收率、净化能力和抗基质干扰能力等多种优异效果。[0017]为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：[0018]氟苯尼考/甲砜霉素单抗杂交瘤细胞株，保藏编号为cctccno.c201945，命名为9d4-ff，并于2019年3月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为武汉市武昌珞珈山武汉大学内。[0019]本发明以氟苯尼考新型人工抗原作为免疫原免疫小鼠，经过筛选获得上述9d4-ff杂交瘤细胞株，其诱生的单抗与甲砜霉素、氯霉素进行交叉反应率的检测，当认定氟苯尼考的cr值为100％时，发现甲砜霉素交叉反应率较大，cr值分别为69.69％，而氯霉素的cr值小于0.001％。[0020]所述新型人工抗原由氟苯尼考(半抗原)溶解于吡啶后与戊二酸酐(五碳链联接臂)反应被修饰成氟苯尼考戊二酸半醛，n2气吹干后转入二甲基甲酰胺/1,4-二氧六环混合溶剂中经氯甲酸异丁酯/正三丁胺活化再与牛血白蛋白中游离-nh2交联而成，与现有报道氟苯尼考以丁二酸酐(四碳链联接臂)作修饰剂制备的人工抗原相比，本发明的新型人工抗原的优势在于：[0021](1)联接臂变长：由原来c4链变为c5链，使氟苯尼考抗原表位暴露更为充分便于机体识别。[0022](2)氟苯尼考化学修饰、修饰基团活化以及与蛋白载体交联均在温和反应体系完成，不需要高级仪器设备，可在普通实验室完成。[0023](3)反应体系无萃取步骤：既保证产物得率，又可实现反应体系微量化。[0024]具体的反应过程如下：[0025][0026]本发明获得的杂交瘤细胞株-9d4-ff的步骤具体如下：[0027]①针对氟苯尼考人工抗原-免疫原的合成与理化表征分析；[0028]②针对氟苯尼考人工抗原-包被抗原的合成；[0029]③balb/c鼠免疫以及合格受免鼠的遴选；[0030]④细胞融合以及针对氟苯尼考单抗杂交瘤细胞株筛选与克隆；[0031]⑤体内诱生腹水的获取与评估；[0032]经上述步骤，本发明获得一株针对氟苯尼考单克隆杂交瘤细胞-9d4-ff，其体内诱生腹水样本，经间接竞争elisa试验分析，所述该样本对氟苯尼考具有极高的检测灵敏度(ic50为1.35ppb)和较高工作滴度(工作稀释度为1：40000)，与甲砜霉素免疫交叉率约为69.69％，与氯霉素免疫交叉率＜0.001％。该结果为制备氟苯尼考/甲砜霉素特异性固相化免疫吸附剂提供了供应稳定、质量可靠、价格低廉的核心原料。[0033]基于上述优异的技术效果，本发明提供了所述杂交瘤细胞株或由其分泌的单克隆抗体在氯霉素类残留样本机测前处理/免疫检测中的应用，或在制备氯霉素类残留样本机前处理/免疫检测产品中的应用；其中，所述氯霉素类为氟苯尼考和/或甲砜霉素。[0034]更优选地，本发明进一步提供了保藏编号为cctccno.c201945的杂交瘤细胞株或由其分泌的单克隆抗体联合保藏编号为cctccno.c201870的杂交瘤细胞株或由其分泌的单克隆抗体在氯霉素类残留样本机前处理/免疫检测中的应用，或在制备氯霉素类残留样本机测前处理/免疫检测产品中的应用。[0035]保藏编号cctccno.c201870的杂交瘤细胞株分泌产生的单抗针对氯霉素有强特异性(一对一)、高亲和力，但对氯霉素二种重要替代物-甲砜霉素和氟苯尼考均无免疫交叉性；该杂交瘤细胞株，保藏编号为cctccno.c201870，命名为2d2-c1，并于2018年3月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为武汉市武昌珞珈山武汉大学内。[0036]作为优选，所述氯霉素类为氟苯尼考、甲砜霉素、氯霉素中的一种或两种以上。[0037]在本发明具体实施方式中，所述机测前处理/免疫检测产品为免疫亲和层析色谱胶或由该胶预填装的免疫亲和层析色谱柱。[0038]本发明提供的免疫亲和层析胶，通过结合液-洗涤液-洗脱液等参数优化后，氟苯尼考/甲砜霉素二种目标物系列浓度标液的免疫层析胶富集样本经hplc-ms/ms定量测定：针对氟苯尼考检出限和定量限:0.1,0.3ppb、有效吸附浓度域：0.1-81ppb；针对甲砜霉素检出限和定量限:0.3,0.9ppb、有效吸附浓度域：0.3-81ppb；针对氯霉素检出限和定量限:0.03,0.1ppb、有效吸附浓度域：0.01-81ppb；能满足配制氯霉素类混合型免疫亲和层析胶的基本要求。[0039]作为优选，所述机前处理/免疫检测产品中还包括结合液、洗涤液和洗脱液；所述结合液为0.01molml-1pbs，所述洗涤液为0.01molml-1pbs和水(交替洗涤)，所述洗脱液为甲醇：氨水体积比为9:1的混合洗脱液。[0040]本发明提供的免疫亲和层析胶作为氯霉素类类残留样本净化核心试剂，以系列浓度的等剂量三种药物混合物分别掺入虾肉/天然湖水后作模式试样，经层析胶机测前净化处理，处理样本再作lc-ms/ms定性与定量分析，并与国标法的固相萃取spe(solidphaseextraction)净化方法作对比试验。结果显示：以处理通量、抗基质干扰力、检测限、掺入目标物回收率等指标作评估，该模式全面优于国标固相萃取净化模式。[0041]根据上述应用，本发明提供了一种氯霉素类特异性免疫亲和层析机测前处理/免疫检测产品，包括由保藏编号为cctccno.c201945的杂交瘤细胞株分泌产生单抗经纯化再与cnbr-activatedsepharose-4b胶化学交联形成的免疫亲和层析色谱胶或由该胶预填装的免疫亲和层析色谱柱。[0042]作为优选，所述机测前处理/免疫检测产品还包括：由保藏编号为cctccno.c201870的杂交瘤细胞株分泌产生单抗经纯化再与cnbr-activatedsepharose-4b胶化学交联形成的免疫亲和层析色谱胶或由该胶预填装的免疫亲和层析色谱柱。[0043]更优选地，还包括：结合液、洗涤液和洗脱液；所述结合液为0.01molml-1pbs，所述洗涤液为0.01molml-1pbs和水(交替洗涤)，所述洗脱液为甲醇：氨水体积比为9:1的混合洗脱液。[0044]在免疫亲和层析色谱胶的制备中，本发明通过纯化单抗蛋白与cnbr-activatedsepharose-4b胶化学交联形成固相化抗体蛋白而获得，而所述免疫亲和层析色谱柱是将所述免疫亲和层析色谱胶填充于柱床中获得。根据检测的需要，所述色谱柱可以添加由保藏编号为cctccno.c201945的杂交瘤细胞株分泌产生单抗制备而成的色谱胶和/或保藏编号为cctccno.c201870的杂交瘤细胞株分泌产生单抗制备而成的色谱胶，两者的体积比优选为1:1。[0045]根据上述免疫亲和层析色谱胶/柱的性能，本发明还提供了一种预处理氯霉素类残留样本的方法，采用本发明所述机测前处理/免疫检测产品对于待测样本进行机测前处理。[0046]同时，本发明也提供了一种检测氯霉素类残留样本的方法，采用本发明所述机测前处理/免疫检测产品对于待测样本进行机前处理，将处理后的样本通过lc-ms/ms进行检测。[0047]本发明选取对氟苯尼考亲和力以及对甲砜霉素免疫交叉反应均较佳的单抗杂交瘤细胞株源制备其纯化抗体蛋白，利用该抗体蛋白连同特定杂交瘤细胞分泌的氯霉素单抗按ge公司标准操作规程制备免疫亲和层析胶，获取层析胶/柱产品后，通过lc-ms/ms等分析设备进行检测，具备较佳的检出限、定量限，同时与国标spe方法相比抗基质干扰能力、加标回收率和净化处理能力更优。[0048]生物保藏信息说明[0049](1)用于保藏的杂交瘤细胞株9d4-ff的分类命名为：[0050]保藏单位全称：中国典型培养物保藏中心；[0051]保藏单位简称：cctcc；[0052]保藏单位地址：武汉市武昌珞珈山武汉大学内；[0053]保藏日期：2019年3月18日；[0054]保藏编号：cctccno.c201945；[0055](2)用于保藏的杂交瘤细胞株2d2-c1的分类命名为：[0056]保藏单位全称：中国典型培养物保藏中心；[0057]保藏单位简称：cctcc；[0058]保藏单位地址：武汉市武昌珞珈山武汉大学内；[0059]保藏日期：2018年3月14日；[0060]保藏编号：cctccno.c201870；附图说明[0061]图1所示为ff-glu-bsa大分子质谱图；[0062]图2所示为细胞诱生腹水对ff竞争抑制曲线图；[0063]图3所示为细胞诱生腹水对氯霉素标样竞争抑制曲线图；[0064]图4所示为二种单抗诱生腹水样本经proteing纯化的二种纯化物蛋白电泳鉴定图；[0065]图5所示为二种单抗蛋白纯化物与胶交联前后蛋白含量检测直观图；[0066]图6所示为三种目标物混标液经lc-ms/ms测定的单目标物特征峰型图；[0067]图7所示为混合型胶在三因子多水平组合条件下对混标物回收率的三维柱状图；[0068]图8所示为系列浓度三种目标物混标液混合胶处理样本检测信号回归方程与拟合曲线；[0069]图9所示为天然湖水/虾肌肉经混合胶净化样本lc-ms/ms检测峰型图(blank对照)；二种基质经混合胶净化后仅出现峰幅极低的杂峰，推测这些杂峰是净化过程中残留的无机盐引起，不干扰掺标目标物特征峰的呈现；[0070]图10所示为天然湖水三种目标物混标试样经二种净化处理的检测峰型对比图；[0071]图11所示为虾肌肉三种目标物混标试样经二种净化处理的检测峰型对比图。具体实施方式：[0072]本发明公开了氟苯尼考/甲砜霉素单抗杂交瘤细胞株及其分泌的单抗和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的杂交瘤细胞及其单抗和应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的杂交瘤细胞及其单抗和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。[0073]下面就本发明提供的氟苯尼考/甲砜霉素单抗杂交瘤细胞株及其分泌的单抗和应用做进一步说明。[0074]实施例1：本发明所述针对氟苯尼考/甲砜霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株制备以及评估[0075]1、针对氟苯尼考人工抗原-免疫原的合成：称取35.8mgff(氟苯尼考)标样(混合消光型，0.1mmol)，加入2ml含11.4mg(0.1mmol)glu(戊二酸酐)的吡啶溶液中，室温搅拌反应过夜；完成后，氮气吹干吡啶；用4ml溶剂(dmf与1,4-二氧六环按1:1体积比混合)溶解ff-glu半醛；加入26.2μl(约0.1mmol)正三丁胺，冰浴中搅拌10min，加入氯甲酸异丁酯14.4μl(约0.1mmol)，转入室温搅拌1h；[0076]将上述活化的ff液逐滴加入5ml冰水浴处理的含10mgml-1bsa(牛血清白蛋白)的硼酸钠液(0.1moll-1,ph8.5)中，1h内加完，室温搅拌反应过夜。用0.1mol硼酸钠液(ph8.5)透析过夜，0.01mpbs(ph7.4)透析2d，3000rpm离心20min，取上清；取少许进行大分子质谱鉴定，其余部分制备成冻干粉，并命名为bsa-glu-ff。[0077]合成线路示意图：[0078][0079]2、针对氟苯尼考人工抗原-包被抗原的合成：称取6mgffa(氟苯尼考胺)，溶于100μldmf(二甲基甲酰胺)中为a液；称取10mgova(卵清白蛋白)溶于1.5mlpbs中为b液；将a液缓慢滴加到b液中，然后加入4mgedc和3mgnhs；室温反应过夜；将反应物装入透析袋内，4℃用pbs缓冲液透析5d，每天更换透析液3次，并命名为：ffa-ova。合成线路图：[0080][0081]3、动物免疫与合格免疫鼠的遴选：从史莱克公司购进6只spf级六周龄雌性balb/c鼠，按严格spf级标准精心饲养，每只鼠按下表1免疫计划同步免疫。[0082]表1免疫计划[0083][0084]说明：f-b代表ff与bsa偶联物，f代表ff，cfa代表弗氏完全佐剂，ifa代表弗氏不完全佐剂；[0085]4、受免鼠血清样本的评估[0086]棋盘elisa对受免鼠抗血清效价定性标定[0087](1)包被：包被抗原ffa-ova用包被缓冲液分别稀释至9、3、1、0.33、0.11、0.03和0.01μgml-1并分别加于一块酶标板的a-gline；hline作阴性对照：3μgml-1ova/cbs；每孔加100μl。包被好后置37℃湿孵1.5h,再于4℃湿孵过夜；[0088](2)洗涤：取出酶标板并甩干，用pbs洗涤2+1(1指加第一次pbs甩干后不在摇床上振荡3min，2指在后两次加pbs后都要在摇床上振荡3min再甩干)次(每次每孔300μl)并拍干；[0089](3)封闭：每孔加350μl封闭液，于37℃湿孵2h；[0090](4)一抗稀释：用抗体稀释液将每份血清分别稀释成：1:1000、3000、9000、27000，81000五个稀释度，同时稀释无抗体鼠血清至1:3000作阴性对照，作为孵育一抗，室温预作用一小时；[0091](5)洗涤：将酶标板取出并甩干，用pbst洗涤2+1次并拍干；[0092](6)加一抗：每孔加100μl一抗孵育液，于37℃湿孵2h；[0093](7)二抗稀释：用抗体稀释液将辣根过氧化物酶标记二抗稀释至1：500；[0094](8)洗涤：取出酶标板并甩干，用pbst洗涤4+1次并拍干；[0095](9)加二抗：每孔加100μl二抗稀释液，于37℃湿孵80min；[0096](10)洗涤：取出酶标板并甩干，pbst洗涤3+1次，再用pbs洗涤1+1次并拍干；[0097](11)显色：每孔加100μl显色液，避光黑暗显色3min；[0098](12)终止：显色结束后马上在每孔加50μl终止液；[0099](13)用酶标仪测od490值。[0100]间接竞争elisa定性标定抗血清对ff标样的亲和力[0101](1)包被：以上述棋盘elisa标定的包被浓度为标准，将ffa-ova两种包被抗原分别包被在两块酶标板的a-gline；hline作阴性对照：同浓度ova/cbs；每孔都加100μl。包被好后至37℃湿孵1.5h，再于4℃湿孵过夜；[0102](2)洗涤-封闭同上述棋盘elisa；[0103](3)一抗与竞争物的处理：[0104]a：用pbs缓冲液将抗血清稀释至两倍的标定的抗血清效价，并作为工作一抗备用；[0105]b：称取ff标样，用甲醇稀释成1mgml-1作为储存液备用；[0106]c：储存液用甲醇将ff标样的浓度分别稀释成0.2、1、5、25、125和625ngml-1六个稀释度，处理完后再每个稀释度中加等体积的工作一抗，使最终浓度为0.1、0.5、2.5、12.5、62.5和312.5ngml-1。[0107]d：将上述处理后的抗体作为孵育一抗，室温摇床振荡45min。[0108](4)加一抗：将处理好后的孵育一抗加于酶标板的a-fline；g、hline加pbs缓冲液稀释的无竞争物的抗血清(稀释度为标定的抗血清效价)；每孔都加100μl，37℃湿孵2h；[0109](5)洗涤-加二抗-洗涤-显色-终止同上述棋盘elisa。[0110]5、氟苯尼考/甲砜霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株制备与评估[0111](1)小鼠骨髓瘤细胞株-sp2/0细胞的培养：细胞株由江苏省血液研究所单抗室惠赠，并在10％fbs(eallbio公司产品)/rpmi-1640正常培养基中培养并传代，以细胞亚克隆试验单细胞成集落率＞70％以及1xhat选培试验证实该细胞株对hat完全敏感后视为合格培养系统；再将该细胞株用正常培养基培养至对数生长期且细胞形态大小均一、活细胞率＞98％时，轻轻拍打sp2/0细胞瓶的瓶壁收集细胞，1000r/min离心5min去除培养基，然后加无血清rpmi-1640培养基重悬细胞，计数备用；[0112](2)饲养细胞获取：融合前一天，取数只10周龄雄性小balb/c鼠，处死后浸泡于75％酒精中1-2min；剪开腹部表皮后，在腹腔上按压酒精棉进行消毒；剪开腹膜，然后用无菌巴氏滴管吸取含1×hat的rpmi-1640培养基淘洗小鼠腹腔，并移取出巨噬细胞于培养基中，吹打悬浮；按4块/只、100μl/孔种植于数块96孔培养板中，于37℃、5％co2的培养箱中培养；[0113](3)脾脏细胞的获取：七免后隔28天再进行一次免疫冲击，冲击后3d摘眼球采血；断颈处死后，将该鼠浸泡于75％酒精1-2min；剪开胸腹皮肤和肌肉，用镊子取出脾脏，剪去非脾结缔组织；在rpmi-1640培养液中洗一下，然后转入离心管中，1000rpm离心3min，弃去上清，再加rpmi-1640培养液至30ml，计数备用；[0114](4)细胞融合：按脾细胞:骨髓瘤细胞约8:1比例混匀后，1000r/min离心10min,去培养基，轻轻拍打使沉淀松弛(方便沉淀的溶解)；接下来试剂的滴加都要保持37℃恒温、缓慢滴加和持续搅拌，且按顺序滴加：分别是1mlpeg1500、1mlrpmi-1640培养基两次、1.5mlrpmi-1640培养基两次和5mlrpmi-1640培养；然后1000r/min离心5min，去培养基，轻轻拍打使沉淀松弛；加入少量含1×hat的rpmi-1640培养基，轻轻摇动，待沉淀完全溶解后，加入到37℃的含1×hat的rpmi-1640培养基中制备融合细胞悬液。[0115](5)细胞培养：将融合细胞悬液滴加于上述含有饲养细胞的96孔板中(每孔100μl)，并于37℃、5％co2培养箱中继续培养；4d和7d用含1×hat的rpmi-1640培养基分别进行一次半换液(即吹打混匀后用巴氏滴管移走一半体积，然后用含1×hat的rpmi-1640培养基补足体积)；10d用含1×ht的rpmi-1640培养基进行一次半换液；当融合细胞生长至96孔板1/10-1/4面积时就可以取一点进行初筛，剩余部分仍然于37℃、5％co2培养箱中继续培养。[0116]6、杂交瘤细胞的筛选和评估[0117]用棋盘elisa实验标定的包被浓度进行包被，洗涤-封闭同上；[0118]将上述融合细胞的培养上清一一对应的转移100μl至一新的96孔板中；再取一96孔板，取sp2/0细胞培养上清作阴性对照，稀释抗血清至1:10000作阳性对照，室温振荡一小时作孵育一抗；[0119]将上述一抗一一对应转移100μl至酶标板中，其余步骤同上述棋盘elisa。显色终止后，选取信号强的孔作为疑是孔，并将其一一对应扩增到24孔板中继续培养。[0120]7、ff特异性抗体阳性克隆的确证[0121]包被-洗涤-封闭-洗涤方法同上；[0122]取上述24孔培养板孔中处于对数生长期的杂交瘤细胞培养上清，用pbs缓冲液稀释原液，分别制成原液、1/10稀释液两个稀释度，每个稀释度均分成二份，一份加等体积pbs液，另一份加等体积2μgml-1ff标样/pbs液，即一个疑是阳性克隆样本均为4个处理，每个处理两个复孔；将这些配好的离心管置于摇床上，室温振荡孵育一小时后加入酶标板中作一抗孵育，其余步骤同上述棋盘elisa；显色终止后，每个样本同稀释度进行加ff标样处理与未加ff标样处理组间的od490值比较，再以候选克隆在24孔培养板孔扩大培养后能维持强杂交信号(即1/10稀释度od490值仍然较强)、该强信号能被ff标样有效抑制(同组ff处理有明显抑制)为标准，从上述候选克隆样本中筛选出针对ff特异性抗体阳性孔。[0123]8、ff特异性抗体阳性克隆的亚克隆：对上述筛选出的阳性孔进行亚克隆(有限稀释法)，9-12d镜检后，选择细胞状态良好、细胞数目较多(128个细胞左右)的单集落孔上清为待测样本，进行上述间接elisa。然后再进行亚克隆，直到阳性率为100％时，再挑选其中几孔信号最强、细胞生长最好的进行扩增、培养、冻存和保种。[0124]9、针对氟苯尼考单克隆抗体大量制备与评估：从上海史莱克公司购自10只10周龄雄性balb/c–nuke鼠，按0.5ml/只腹腔注射pristane致敏7d后，再按1x106/只腹腔接种杂交瘤细胞，按spf级动物饲养标准饲养，待其腹部明显膨大后抽取腹水，于4℃1000r/min离心10min取上清；于4℃12000r/min离心20min，取上清合并留小样用于评估，其余-20℃冻存备用。将上述腹水用0.1％ova/pbs稀释成1：5000、10000、20000、40000、80000五个稀释度分别作孵育一抗后，评估方法，同上述抗血清的棋盘和间接竞争elisa评估，与甲砜霉素、氯霉素免疫交叉试验方法与氟苯霉素作抑制物间接竞争elisa相同。[0125]10、结果[0126](1)针对氟苯尼考的人工免疫原：经上述化学合成，共回收约41mg(以蛋白量计)人工抗原，回收率约为82％；经大分子质谱分析结果见图1，该图显示：bsa标样分子量为66592，ff-glu-bsa偶联物分子量则为72991。这说明了ff已成功和bsa偶联，且根据公式[ff-glu-bsa分子量-bsa分子量]/ff分子量可大致计算出ff与bsa摩尔比为18:1。满足了小鼠免疫的需求。[0127](2)针对氟苯尼考的人工包被抗原：经上述化学合成，共回收约8.5mg(以蛋白量计)人工抗原，回收率约为85％；满足了下面试验需求。[0128](3)氟苯尼考免疫原合格受免鼠的遴选：六只受免鼠的六免后7天后，割尾后获取的6份抗血清分别作待测一抗，以3μg/mlova-ffa包被作标准，经上述棋盘和间接竞争elisa测定：其中二份抗血清工作稀释度＞1:10000(od490＞＝1.5)，同时针对氟苯尼考标准液的半抑制浓度ic50(50％inhibitionconcentration)＜＝5ng/ml，判读为合格抗血清，对应鼠作候选鼠，间隔4周免疫冲击，取其脾后用于融合。[0129](4)针对氟苯尼考单抗杂交瘤细胞株筛选、克隆与评估：上述候选鼠脾细胞与sp2/0细胞融合后于10块96孔培养板中培养，培养10d后的各孔上清一一对应于10块elisa孔，经3ug/mlova-ffa包被的间接elisa检测：共获得10孔疑似阳性孔(od490＞＝1.5)；其后一一对应于24孔培养板孔中扩增长至对数期，各取上清作待测一抗，将96孔elisa板按每检测单元4行2列(共8孔)划分为：(1-2)x(a-d)\(3-4)x(a-d)……\(11-12)x(e-h)12个检测单元：每份上清作四种处理：上清+加等体积pbs；上清+加等体积2μg/ml氟苯尼考；10x稀释上清+加等体积pbs；10x稀释上清+加等体积2μg/ml氟苯尼考，每个待测样本一一对应加至10个检测单元中(每一处理2个复孔)，最后二个检测单元用1000x稀释抗血请作同步阳性对照.经检测：二个稀释度的对照对氟苯尼考均有一定抑制价，说明检测系统工作正常；所检测10个克隆中，6个克隆样本免疫杂交信号丢失，其余4个克隆保有免疫杂交信号，其中仅有一株针对氟苯尼考有明显竞争抑制价，判读为针对氟苯尼考单抗确证克隆，按原始座标命名为-9d4，经二轮单细胞亚克隆并经检测阳性率100％；第二轮亚克隆共获得28个单细胞克隆检测均为阳性：a1-c4均有较强免疫杂交信号；c5-8为sp2/0培养上清的阴性对照；c9-12为1:5000的抗血清阳性对照。该结果表明经二轮单细胞亚克隆，阳性克隆率已经达100％(28/28)，说明该株细胞已得到充分纯化，且分泌单抗稳定，取其中一个克隆扩大培养并冻存，同时送至中国典型培养物保藏中心保种并获保藏号：cctccno.c201945。[0130](5)针对氟苯尼考单抗腹水样本的获取与评估：上述杂交瘤细胞共注射了10只balb/c-nuke鼠，10d和11d收集到了约65ml诱生腹水；腹水经过棋盘elisa法测定获得最佳标定：腹水工作稀释度：1:40000稀释；ffa-ova包被浓度：3μg/ml，以该二种稀释度作为主要技术参数对氟苯尼考间接竞争elisa检测结果见表2和图2。[0131]表2细胞诱生腹水对ff亲和力[0132][0133][0134]从表2和图2可以得出：该系统针对氟苯尼考有效检测域：0.556-3.153ngml-1(ppb，ic20-ic80)；检测灵敏度：1.354ngml-1(ppb，ic50)，以同样参数对氯霉素、甲砜霉素免疫交叉率检测结果见下表3；[0135]表39d4-ff诱生腹水对氯霉素类药物交叉率[0136][0137]上述的结果表明，本发明已经获得一株针对氟苯尼考高滴度高亲和力的单克隆抗体，此外，该株抗体对氯霉素类中另一重要成员-甲砜霉素有极佳的免疫交叉性(免疫交叉率达69.69％)，该结果为制备同时针对氟苯尼考/甲砜霉素高亲和力免疫吸附剂提供了来源易得、成本低廉、质量稳定可控试验原料。[0138]实施例2：本发明所述针对氯霉素单克隆抗体腹水样本制备以及评估[0139]1、针对氯霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株筛选与对应细胞上清液的评估：氯霉素人工抗原制备：包括氯霉素琥珀酸与klh(匙孔血蓝蛋白)化学交联(作免疫原)，氯霉素经还原后经重氮反应与bsa(牛血清白蛋白)化学交联(作包被抗原)；balb/c鼠免疫；针对氯霉素抗血清评估以及针对氯霉素单克隆抗体分泌融合细胞克隆筛选与评估的棋盘elisa和间接竞争elisa检测方法的建立与优化；单克隆抗体目标克隆的培养细胞上清对氯霉素标样定量或半定量测定等参见文献《developmentofamonoclonalantibodybased-elisaforthedetectionofchloramphenicolinshrimp,feedandmilksamplesandvalidationbylc-ms/mscoupledwithimmunoaffinityclean-up》(anal.methods.2019.11.507-516)的方法。经评估遴选出针对氯霉素滴度高免疫亲和力强杂交瘤细胞株2d2-c1株作出发细胞株用于下面试验。[0140]2、针对氯霉素单克隆抗体大量制备与评估：大量收集杂交瘤细胞株2d2-c1的对数期生长细胞，按实施例1提及方法体内注射10只10周龄雄性balb/c–nuke鼠。获取对应诱生腹水样本后，取小样用0.1％ova/pbs稀释成1：5000、10000、20000、40000、80000五个稀释度，上述抗血清的棋盘和间接竞争elisa评估，与氟苯霉素、甲砜霉素免疫交叉试验方法与氯霉素作抑制物间接竞争elisa相同。[0141]3、结果[0142](1)2d2-c1细胞培养上清对氯霉素标样定量检测与标准抑制曲线绘制：融合细胞经筛选和二轮亚克隆获得了针对氯霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株：1b1和2d2；选取对氯霉素亲和力较高的细胞株2d2-c1,以其对数生长期的培养上清作待测一抗，经棋盘elisa标定：最佳包被为：5μg/mlbsa-cap，最佳一抗稀释度：1：400；再以该技术参数与0.01，0.03，0.09，0.27，0.81，2.43，7.29ng/ml浓度点的氯霉素分别作竞争物，再设无竞争物对照组作间接竞争elisa测定，经测定：每个浓度点(12复孔)的od490平均值记为b，对照组(12复孔)的od490平均值记为b0，每个浓度点抑制率按(b0-b)/b0*100％计算；以抑制物浓度作横坐标，抑制率作纵坐标绘制该样本对氯霉素标准液的抑制曲线，结果参考文献《developmentofamonoclonalantibodybased-elisaforthedetectionofchloramphenicolinshrimp,feedandmilksamplesandvalidationbylc-ms/mscoupledwithimmunoaffinityclean-up》(anal.methods.2019.11.507-516)。[0143](2)2d2-c1诱生腹水对氯霉素标准抑制曲线绘制以及对其同系物免疫交叉性测定：2d2-c1细胞共注射了10只balb/c-nuke鼠，11d和12d收集到了约67ml诱生腹水；棋盘elisa标定:腹水工作稀释度：1:40000稀释；cap-ova包被浓度：5μg/ml.用该参数对氯霉素标样绘制标准抑制曲线见图3，抑制曲线图显示：针对氯霉素有效检测阈：0.033-2.53ng/ml(ic20-ic80),检测灵敏度：0.51ng/ml(ic50)，与氟苯尼考和甲砜霉素免疫交叉率见表4：[0144]表42d2-c1诱生腹水对氯霉素类药物交叉率[0145][0146]由图3和表4可以的得出：[0147]第一、2d2-c1细胞株所分泌单抗对氯霉素具有极高免疫亲和力，为下一步研发针对氯霉素目标物极微含量样本具有卓越富集性能免疫吸附产品奠定了基础。[0148]第二、2d2-c1细胞株所分泌单抗对氯霉素具有极强特异性(一对一)，为下一步研发针对含氯霉素目标物基质复杂待检样本具有卓越选择性能免疫吸附产品提供了可能。[0149]第三、该株细胞诱生腹水样本与培养上清相比，对氯霉素的免疫亲和力没有下降，但其抗体滴度增加近百倍。该结果为下一步研发具有一定价格竞争优势的氯霉素固相免疫吸附剂产品提供了目标抗体含量丰富、成本低廉试验原料。[0150]实施例3：本发明所述二种单抗对应固相化免疫吸附胶的制备[0151]1、二种单抗蛋白的大量纯化：分别取上述二种单抗数8ml腹水样本，各用冰水浴预冷的0.01mpbs(ph8.0)3×稀释后备用。再分别取与上述腹水原液等体积的proteingresin(金斯瑞公司产品)装填于2只层析用小柱(30ml)中，按金斯瑞公司提供标准方法纯化上述二种单抗蛋白，分部收集二种单抗的纯化蛋白洗脱液经1/10体积1mtris-cl(ph8.5)中和后，各置于蛋白透析袋(7500-14000mwsolarbio公司产品)中，于冰水浴预冷的0.01mpbs(ph7.4)液中透析24hr(每4-6h换液一次)。分别各取小样：蛋白含量用bca试剂盒(碧云天公司产品)并按其说明书测定；蛋白纯度用sds-page电泳鉴定，其余部分分装-80℃冻存备用。[0152]2、二种单抗纯化蛋白与cnbr-activatedsepharosetm4b交联：[0153](1)交联前单克隆抗体蛋白预处理：分别取已标定蛋白含量的上述二种单抗纯化单克隆抗体蛋白液分别置于二只透析袋(7500-14000mw)中，于100-200×0.1mnahco3/0.5mnacl(ph8.3)溶液4℃透析24hr(每4-6h换液一次)，透析后蛋白用0.22μm微孔滤膜过滤，过滤后于4℃保存备用。[0154](2)蛋白液与固胶交联：二种单抗样本均按待交联纯化单抗蛋白毫克数/5/3.5的克数(注：先按小胶珠粉溶涨系数1:3.5；再按5mg纯化单抗蛋白：1ml溶涨胶计算)各称取cnbr-activatedsepharosetm4b(healthcare公司产品)干粉于2支50ml离心管(corning公司产品)中，胶溶涨-洗涤-与纯化蛋白交联-洗涤-活化基团封闭-二种不同ph值缓冲液的交替洗涤等步骤均按healthcare公司提供的方法进行，分别取交联前和交联后的蛋白液小样作含量测定并计算其交联率。[0155]3、结果[0156](1)二种单抗纯化蛋白获得与鉴定：各取8ml二种单抗腹水样本经proteingresin一步法纯化:9d4-ff株获35ml1.35mg/ml共计47.25mg纯化蛋白；2d2-c1株获28ml1.65mg/ml共计46.20mg纯化蛋白,经sds-page电泳鉴定(见图4)，结果显示二种抗体纯化物均含有50kd(抗体重链)和25kd(抗体轻链)二条明显蛋白条带，无明显其他杂蛋白带，与鼠igg分子重链和轻链标定分子量吻合，表明本发明已经获得二种高纯度单抗蛋白，可以完全满足制备实用型免疫亲和层析胶中单抗蛋白的量和纯度需求。[0157](2)二种单抗纯化蛋白与固相化载体的交联率的评估：依据healthcare公司推荐合理交联度范围：2-10mg抗体蛋白：1ml溶涨胶，针对上述二种单抗，本发明均采用交联度的中间值：5mg抗体蛋白：1ml溶涨胶，通过二种单抗纯化蛋白交联前后浓度测定并结合公式：(交联前蛋白浓度-交联后蛋白浓度)/交联前蛋白浓度*100％计算出各自的交联率,二种单抗纯化蛋白处理前后浓度测定结果直观图见图5：经固相胶交联，二种单抗纯化物的蛋白浓度分别从1.25mg/ml陡降至0.04mg/ml；1.57mg/ml陡降至0.05mg/ml，充分说明二种单抗蛋白均能与固相胶极佳的交联，由该结果得出：9d4-ff株的交联率：(1.25-0.04)/1.25*100％＝96.8％；2d2-c1株的交联率：(1.57-0.05)/1.57*100％＝96.81％；该结果表明：本发明已获得了二种单抗交联率极佳的固相免疫吸附剂，为下一步试验奠定了坚实的基础。[0158]实施例4：针对氯霉素类混合型免疫亲和层析胶的配制与结合性能测定[0159]为了确证以及精确定量分析混合型免疫亲和层析胶所处理的以及常规固相萃取小柱spe(solidphaseextractioncartridge)所处理的目标物，本实施例采用lc-ms/ms法测定。[0160]1、氯霉素类多组分lc-ms测定方法建立与优化[0161](1)试剂：[0162]氯霉素，氟苯尼考购自dr.ehrenstorfergmbh(augsburg,germany)。甲砜霉素，购自阿拉丁(中国上海，均为色谱纯)。乙酸乙酯，甲醇，正己烷，甲酸(fisherhplcgrade)，其他试剂均为分析纯。[0163](2)仪器与附件：[0164]色谱仪：安捷伦1290型高效液相色谱仪[0165]质谱仪：安捷伦6545(qtof-ms)型质谱仪[0166]色谱柱：在zorbaxstablebondc18(1.8μm,3.0×50mm)柱[0167](3)测定条件：[0168]柱温：30℃；进样：20μl；流动相：甲醇+0.1％甲酸水；流速：0.3mlmin-1；梯度洗脱程序：下表5所示；离子源：负离子esi；干燥温度:200℃；气体流速:12lmin-1；气压：35psi；鞘气温度：375℃；鞘气流速:12lmin-1；毛细管电压:4000v；喷嘴电压2000v；分段电压:110v。[0169]表5梯度洗脱程序[0170][0171][0172]a——甲醇；b——0.1％甲酸水。[0173](4)lc-ms对氯霉素类三种目标物标准混标物检测和标准检测曲线绘制：分别精确称取1mg氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考各自用甲醇配成1mg/ml并作为母液保存，分别取少许上述三种每液，等体积混合后，再用上述流动相稀释成每种目标物均含：0.1、0.5、2.5、12.5、62.5、312.5、1562.5ng/ml七个浓度点的三种目标物混合液分别作的待测液，每个浓度点检测三次，以验证lc-ms检测系统的可靠性。[0174]2、针对氯霉素类多组分混合胶配制、优化与吸附性能的测定：[0175](1)针对氯霉素类多组分混合胶配制：各取实施例3所提及二种免疫亲和层析胶等体积混合后，按100μl(胶总压积)/管分装于1.5mlep管中，用0.01mpbs(ph7.2)离心洗涤二次尽量吸干pbs备用。[0176](2)本发明混合胶(iac)对多组分目标物免疫层析条件的优化：要使混合型iac能同时吸附三种目标物且均有较高的回收率，本实施例以三种目标物浓度均为20ngml-1(最大柱容量的中间值)混合标液作模式试样，以不同的上样液(结合液)、淋洗液(洗涤液)、洗脱液以及不同免疫结合时间做四指标多水平组合试验，并以三种目标物的回收率均较高作为标准，以获得最佳免疫亲和条件。[0177]上样液选用：纯水，0.01molml-1pbs，0.01molml-1pbs+10％甲醇水溶液(1:1)三种buffer；[0178]淋洗溶液选用：纯水，0.01molml-1pbs+水，0.01molml-1pbs+10％甲醇水三种buffer；[0179]洗脱液选用：0.1％甲酸水(ph＝2.5)，100％甲醇溶液，80％甲醇水溶液，meoh:hcooh(9:1)、meoh:nh3·h20(9:1)五种buffer；[0180]有关免疫亲和时间选用：10，15，30，45min四个作用时间点。经免疫亲和层析各组洗脱液氮吹(60℃)、1ml纯水复溶、过滤上样机测。[0181](3)混合胶对三种目标物单组分吸附性能的分析：在遴选了该胶对多组分目标物免疫层析最佳条件后，以三种目标物母液用0.01mpbs(ph7.4)配制出单目标物均含1、2、4、8、16、32ng/ml六组混合液并分别作待测液，每组的1ml待测液与100μl混合胶进行免疫层析试验(每组设三次独立重复试验，n＝3)，免疫层析后各组按上述方法进行氮吹、复溶、过滤-上样机测，每个组分通过各浓度点回收率作回归曲线；再将上述三种目标物母液分别用0.01mpbs(ph7.4)配制成500ng/ml单目标物饱和液(按鼠igg与目标物(mw300d计)摩尔比1：1推算出该100μl混合胶对各组分其最大理论吸附容量约为500ng)，按1ml单目标物饱和液与100μl混合胶进行免疫吸附试验(每种目标物：六次独立重复试验，n＝6)，免疫吸附后取其上清检测，再按(500-免疫吸附后检测值)ng/ml*1ml计算出该次反应的最大吸附容量，每种目标物得6个计算值再求平均值和之间的标准方差。[0182]3、结果[0183](1)三种目标物标准品对lc-ms检测系统的验证：用安捷伦一重二级杆的液-质串联仪lc-ms配合zorbaxstablebondc18(1.8μm,3.0×50mm)色谱柱对三种目标物均为0.1、0.5、2.5、12.5、62.5、312.5、1562.5ng/ml七个浓度点的三种目标物混合液检测结果显示：[0184]每种目标物的各个浓度与对应接收信号峰面积呈典型浓度依赖性且绘制回收曲线的拟合率r2均大于0.99；[0185]混合物样本中的每种目标物均有精确出峰时间，氯霉素：4.618min；甲砜霉素：3.548min；氟苯尼考：4.059min(见下表6)，同一目标物不同浓度的保留时间误差均小于5％；[0186]经质谱分析三种目标物的母离子分子量分别为：氯霉素＞322.0123；甲砜霉素＞355.0048；氟苯尼考＞357.0005(见下表6)；与三种目标物标准品标注的分子量吻合；[0187]三种目标物质谱信号的谱型：均为峰型锐利单峰且无任何杂峰。见图6质谱峰型图(每种目标物均为20ng/ml的混合液质谱图)。[0188]表6三种目标物混标液lc-ms标定的单目标物母离子分子量和保留时间[0189][0190]注：cap:氯霉素；tap:甲砜霉素；ff:氟苯尼考[0191]上述结果表明：该检测系统对单组分0.1-1562.5ng/ml浓度域的三种目标物混标样中的单目标物均能确证以及精确定量，可以满足后续样本测定。色谱柱选择以及lc-ms各种技术参数设定适易，三种目标物混合物同时测定不产生相互干扰。每种目标物的母离子分子量明确，可作为确证测定的直接证据。[0192](2)混合型免疫亲和层析胶亲和层析条件的选择：用三种目标物浓度均为20ng/ml混标物作试样，以单目标物回收率均大于60％作金标准，三因子综合优化条件为：结合液：0.01mpbs(ph7.4)；洗涤液:0.01mpbs(ph7.4)+h2o；洗脱液:甲醇+氨水(9：1v/v)。因此选择：0.01mpbs(ph7.4)作结合液；0.01mpbs(ph7.4)+h2o作洗涤液；甲醇+氨水(9：1v/v)作洗脱液；混合胶与待测样本免疫结合时间40min作最佳免疫层析试验条件组合应用于后续试验。各组试验条件所等得到每种目标物回收率见图7。[0193](3)混合型免疫亲和层析胶对三种目标物混标液吸附性能以及对单一目标物最大吸附容量的标定：[0194]混合型免疫亲和层析胶对三种目标物混标液吸附性能的标定：选用上述最佳反应条件，三种目标物均含1、2、4、8、16、32ng/ml六组混合液经混合胶免疫吸附的洗脱样本再经lc-ms测定结果显示：每个组分1到32ng/ml的6个浓度点所获得信号响应强度-即每种目标物的特征峰面积呈典型浓度依赖性，通过6个浓度点所绘制的浓度与对应信号强度相关曲线的拟合率r2均大于0.99，三种目标物：氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考各自检测曲线分别见图8；[0195]图8结果表明：[0196]本发明所建立混合型免疫层析胶与lc-ms联合检测系统能对1-32ng/ml浓度范围内的三种目标物的混合标样能对每种目标物准确确证以及精确定量，为低甚至极低含量三种目标物混合残留的实际待测样本检测需求提供可能。[0197]针对上述浓度域的三种目标物混标样，混合胶免疫吸附效应不存在相互干扰：即针对氯霉素固相免疫吸附剂与针对氟苯尼考/甲砜霉素固相免疫吸附剂各自免疫吸附目标物不产生空间位阻干扰；针对氟苯尼考/甲砜霉素固相免疫吸附剂在其抗体吸附表位过饱和的前体下，氟苯尼考与甲砜霉素之间并不产生量效竞争效应。[0198]混合型免疫亲和层析胶针对单组分最大吸附容量的标定：证实了上述混合胶对低甚至极低含量三种目标物混合样本具有极佳富集性后，本发明又考察了该胶的另一重要技术参数-针对单一目标物的最大吸附容量:通过三种单一目标物饱和标准液(500ng/ml)分别与该胶吸附后的剩余含量的精确定量测定，再按照吸附前单一目标物含量与吸附后单一目标物含量之间差值即为该胶针对单一目标物的最大吸附容量。三种目标物单一组分分别经6次重复试验求平均值，经测定：氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考的平均吸附容量分别为：81，140，109ng；三种目标物平均吸附容量和组间的标准差见下表7；[0199]表7混合胶针对三种目标物最大吸附容量与标准试验误差[0200]captapff最大柱容量(ng)81140109rsd(％)1.64.14.7[0201]实施例5：混合胶与常规固相萃取小柱对氯霉素类多组分掺标样本净化对比试验[0202]证实了本发明所述混合胶对三种目标物的标准混合液具有极佳免疫吸附性能后，该胶的抗基质干扰能力是决定该胶是否能被引入实际应用的关键指标。更进一步地，与国标法进行平行对比试验，进而获得该胶净化效果全面优于国标法净化的处理实际数据是为该胶替代常规固相萃取小柱应用于实际待测样本的重要依据，为此本实施例选用体长约12cm青虾(购自于本地农贸市场)和天然湖水(采自于苏州大学独墅湖校区附近的独墅湖水面下50cm的水样)经苏州农产品质量与安全监测中心检测证实无氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考残留后作模式基质用于后续试验。[0203]1、混合胶对三种目标物混标物掺入虾肉试样的净化与检测：取活虾去壳和内脏后剪碎、于4℃12000r/min匀浆5min,取虾肉匀浆或直接制备掺标样本或-20℃冻存备用。分别称取四份4g虾肉匀浆于四支50ml带盖聚丙烯离心管中，依次加入0、20、40、80μl的三种目标物浓度均为1μgml-1的混合标准溶液后，将试样涡旋5min充分混匀，于4℃冰箱过夜。第二天，每支离心管涡旋5min之后加入20ml乙酸乙酯，0.5ml氨水，涡旋混匀5分钟，震荡提取10min，5000r/min室温离心10min，取15ml上清液转移到另一个离心管中，于60℃氮气吹干。加3ml纯水，涡旋30min复溶，再加2ml正己烷，涡旋混匀3分钟，并以5000r/min离心10min，各取下层水相1ml作混合胶免疫净化。样本的净化-洗脱样本检测等方法与步骤同上。该试验独立重复三次。[0204]2、混合胶对三种目标物混标物掺入天然湖水的净化与检测：取天然湖水，于4℃12000r/min离心10min,分别称取四份4ml上清于四支50ml带盖聚丙烯离心管中，依次加入0、20、40、80μl的三种目标物浓度均为1μgml-1的混合标准溶液后，后续处理同上述方法。同样独立重复三次试验。[0205]3、spe柱对三种目标物混标物掺入虾肉/天然太湖水试样的净化与检测：[0206]待测样本的预处理：三种目标物掺入虾肉/天然湖水样本的制作、目标物的乙酸乙酯提取、萃取液氮气吹干、吹干物的复溶、正己烷脱脂等步骤同上，获得待净化水相样本备用。[0207]4、spe柱对待测样本的净化与进样检测：取数只oasis@hlb(300mg6mlwaters公司产品)小柱，每只小柱分别加5ml甲醇淋洗活化和5ml水淋洗平衡后，一份5ml待净化水相样本缓慢加入一只spe小柱中，待样品溶液流干后，加入5ml的纯水与5ml的5％甲醇水溶液进行淋洗，再加入5ml的甲醇溶液进行洗脱，洗脱液于60℃水浴下，氮气吹干。1ml的纯水复溶，过滤膜后进lc-ms检测，计算回收率。[0208]5、结果[0209](1)四种处理基质的三种目标物混合外标样本检测标准曲线标定：为了修正基质对lc-ms系统对三种目标物检测所产生系统偏差。本实施例采用四种基质：即混合胶对氯霉素类抗生素空白虾肉/天然湖水净化后的复溶水相(二种)；oasis@hlb小柱对氯霉素类抗生素空白虾肉/天然湖水净化后的复溶水相(二种)各自作三种目标物均为1、2、4、8、16、32ng/ml六水平混标液为上机试样。检测后分别作同处理单目标物不同加标水平标准检测曲线并作回归方程和计算拟合率r2,四种基质的外标物检测结果见下表8、表9。从表8-9可以得出四种处理水相作稀释液的三种目标物外标混合液，各个目标物获得检测信号与其浓度均具有良好相关性，其相关系数r2均大于0.99，充分表明四种基质并不干扰lc-ms系统对上述浓度域内的三种目标物的精确定量，该结果为下一步在对等基质水平下，lc-ms系统对三种目标物基质掺标物净化样本精确定量的可靠性奠定了坚实地基础。[0210]表8天然湖水经二种模式净化后的水相外标样本中的目标物定量回归方程和相关系数[0211][0212]表9虾肉经二种模式净化后的水相外标样本中的目标物定量回归方程和相关系数[0213][0214](2)天然湖水三种目标物混标物的二种处理净化效果的对比：[0215]定性对比：为了直观展示混合胶与spe小柱对上述三种目标物混标物的净化对比效果，在混合胶处理天然湖水净化样本(blank对照)经lc-ms检测获得检测峰型图(见图9天然湖水样本)仅呈现峰幅极低的杂峰并不干扰目标物特征峰的展现后，以浓度均为20ng/ml三种目标物混标湖水的二种净化样本lc-ms检测获得的三种目标物峰型图(见图10)显示：[0216]二种处理样本均能在三种目标物特定的保留时间出现各自特征峰，且各自保留时间邻近基本无杂峰；[0217]二种处理样本三种目标物特征峰峰幅相比：混合胶处理的样本均显著高于spe处理的样本，分别为cap:0.7>0.23；tap:0.3>0.15；ff:0.3>0.12；[0218]纵贯三种目标物全程连续测定峰(流动相连续洗脱检测约12min)分析:三种目标物特征峰以外基线(本底)相比：混合胶处理的样本优于spe处理的样本.[0219]上述该结果表明：[0220]二种净化介质对混标试样中的三种目标物均有一定保留能力，以三种目标物特征峰幅作定性指标，混合胶对三种目标物保留能力均远远高于spe小柱对三种目标物保留能力；[0221]虽本发明采用天然湖水模式基质所产生基质效应对待测样本中三种目标物特征峰的展示不构成实质性干扰，但以三种特征峰所对应杂峰—基质噪音信号峰作定性指标，混合胶处理样本的噪音水平明显低于spe处理样本，充分表明混合胶对基质滤除能力优于spe小柱；[0222]综合上述二个指标：iac净化效果显著优于spe小柱的净化效果[0223]定量对比：以三种目标物浓度分别均5、10、20ng/ml三水平混标物二种处理组经检测与统计结果见下表10，表10可以看出混合胶净化样本的目标物回收率普遍高于spe净化样本目标物的回收率，以同种目标物同等加标水平二种处理差值得到中间值为代表，结果显示：cap：78％>38％、差值40％；tap：84％>67.2％、差值16.8％；ff：79.2％>45.6％、差值33.6％；由此可以得出混合胶对目标物掺入样本净化效果远远优于spe小柱的净化处理。[0224]表10天然湖水三种目标物系列浓度混标试样经二种净化处理后各组的单目标物回收率[0225][0226](3)虾肌肉三种目标物混标物的二种处理净化效果的对比：[0227]定性对比：在混合胶净化虾肌肉样本(blank对照)所获得检测峰型图(见图9虾肌肉样本)同样仅呈现峰幅极低的杂峰不干扰目标物特征峰后，以同上浓度三种目标物混标虾肌肉的二种净化样本lc-ms检测获得的三种目标物峰型图(见图11)显示：[0228]与上述天然湖水混标模式试样处理效果相比，虾肉混标模式试样经二种处理样本虽也均能在三种目标物特定的保留时间出现各自特征峰，但仅混合胶处理样本在三种目标物各自保留时间邻近能保持无杂峰干扰；而spe处理的样本三种目标物各自保留时间邻近均有不同程度杂峰干扰，以ff\tap二种目标物的杂峰更为明显。[0229]二种处理样本三种目标物特征峰峰幅相比：混合胶处理的样本同样显著高于spe处理的样本，分别为cap:1.2>0.25；tap:0.4>0.07；ff:0.7>0.08.[0230]三种目标物特征峰以外基线(本底)相比：混合胶处理的样本基本无杂峰，而spe处理样本均有大量杂峰。[0231]上述结果表明：[0232]面对基质更为复杂待净化样本，二种净化介质对混标试样中的三种目标物仍能保持一定保留性能，以特征峰幅作定性指标，混合胶对三种目标物保留能力同样均远远高于spe小柱对三种目标物保留能力。[0233]以消除基质效应对目标物特征峰干扰作定性指标，混合胶处理与spe处理相比：混合胶净化处理不仅滤除了直接干扰特征峰的基质，同时也大量去除了其他基质。极大消除了检测本低。[0234]综合上述二个指标：iac净化效果显著优于spe小柱的净化效果[0235]定量对比：以三种目标物浓度分别均5、10、20ng/g三水平混标物二种处理组经检测与统计结果见下表11，表11可以看出混合胶净化样本的目标物回收率普遍高于spe净化样本目标物的回收率，选取二种处理组内变异系数相对小(cv(％))的单目标物同等加标水平样本作二种处理一一对比，结果显示：cap：63.4％>32.6％、差值30.8％；tap：57.9％>32.3％、差值25.6％；ff：72.5％>39.5％、差值33％；由此可以同样得出混合胶对目标物掺入样本净化效果远远优于spe小柱的净化处理。[0236]表11虾肌肉三种目标物系列浓度混标试样经二种净化处理后各组的单目标物回收率[0237][0238]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
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：的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3 当前第1页1 2 3
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：，具体涉及氟苯尼考/甲砜霉素单抗杂交瘤细胞株及其分泌的单抗和应用。
背景技术：
：：[0002]氯霉素类抗生素(包括氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考)以抗菌谱广、机体易吸收、用药成本低等优点广泛应用于动物细菌病的防治，经多年使用通过食物链对人体毒副作用日益凸显尤其是氯霉素导致人体再生障碍性贫血而倍受关注。为此包括中国在内许多国家明文规定肉禽蛋奶水产品中氯霉素不得检出，这意味着其残留量必须低于0.1ppb这是现有检测技术最高检出限。[0003]鉴于氯霉素被禁用，以甲砜基替代氯霉素分子苯环上硝基的衍生物第二代氯霉素类抗生素：甲砜霉素、氟苯尼考对动物与人体的毒副作用大大地降低，仍以其广谱、高效、吸收迅速、分布广泛安全、动物专用等特点作为氯霉素替代药物在国内外畜牧和水产养殖细菌病治疗中迅速获得广泛推广使用，尽管其毒副作用远远小于氯霉素，仍对机体一定毒副作用如甲砜霉素对机体免疫系统发育的抑制；氟苯尼考对胚胎发育的抑制等不容小觑，为此我国规定动物源可食部分中二种药物最高残留标准均小于100-1000ppb。[0004]近十多年来，既德国拜发(r-biopharm)公司将氯霉素elisa专用检测试剂盒推向中国市场后，中国农业大学沈建忠院士团队与北京维德维康公司联合也推出相应的快检产品，特别是江南大学胥传来教授团队推出针对氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考三联胶体金测试条等氯霉素类快检产品，尽管这些产品在畜禽中氯霉素类单目标物或/和多种目标物残留的高通量筛查起了不可替代的作用，由于免疫快检产品自身局限性特别是同类目标物之间免疫交叉性因而无法对目标物每种单一目标物完全明确界定以及精确定量，更不能作为违禁或超标使用后的行政处罚法律依据，仅起阴性排除作用。[0005]鉴于此，国内各级食安检等部门更加关注机测分析。近年来，这些部门均配备了waters和agilent等国际知名公司的gc-ms、hplc-ms/ms、uplc-ms/ms等功能强大分析设备，其色谱分离水平、检测器信号响应水平等技术参数能满足上述三种目标物残留限的国家标准，但由于检测通量低、技术要求高、检测成本高等因素很难满足实际待检样本需求量；更重要的是，检测数据的真实性与可靠性以及再现性压倒性地取决于样本前处理效果，对于氯霉素类抗生素残留样本机测前处理，包括2008年修订的氯霉素类残留检测国家标准在内等多种测试方案，其样本前处理均采用常规理化处理模式，其中固相萃取小柱净化环节为关键步骤，并存在多种技术瓶颈：[0006]1.操作繁杂环节多目标物损失很大甚至丢失；[0007]2.尽管三种目标物归为同一类，但其理化性质差异较大，故而很难用单一固相萃取小柱净化同时获得满意回收率；[0008]3.固相萃取小柱净化很难完全排除基质的干扰；[0009]4.经固相萃取柱净化其目标物回收率很低，必须用其对应同位素标准品作为内标对前处理回收率加以纠正才能较精确地推算出待测样本目标物的实际残留量，不仅其检测成本很高，同时有放射性废料存放与处理之累。[0010]5.固相萃取小柱spe(solidphaseextractioncartridge)依赖进口，受新冠疫情影响，其供应链有中断之虞。[0011]基于上述待机测样本理化前处理的技术瓶颈，以氯霉素类特异性抗体对其具有强特异性(选择性)、高亲和力以及抗原-抗体反应可逆性的基本原理，制备氯霉素强特异性免疫亲和层析色谱胶并以其作机测前处理的模式，可将免疫层析技术对目标物的强选择性和高富集性与色谱柱对目标物有效色谱分离以及检测器强大的分子信息解析能力完美结合起来，这种联合技术是相关学者追求的目标。[0012]尽管近十多年来国内有大量针对氯霉素对应抗体制备、近几年来也有一些针对氟苯尼考/甲砜霉素抗体制备零星的报道，但其在免疫亲和层析技术中应用报道甚少、特别是用一步免疫层析法同时富集待测样本中上述三种目标物未见正式报道，限制了该项技术对hplc-fld或lc-ms/ms检测强大技术支持作用。技术实现要素：[0013]有鉴于此，本发明的目的在于提供一种氟苯尼考/甲砜霉素单抗杂交瘤细胞株及其产生的单抗，使得所述杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体同时对氟苯尼考和甲砜霉素有较高的交叉反应，而且对氟苯尼考具有极高的检测灵敏度(ic50为1.35ppb)和较高工作滴度(工作稀释度为1：40000)；[0014]本发明的另外一个目的在于提供一种采用上述单克隆抗体制备的免疫亲和层析色谱胶和机测前处理试剂组成的免疫亲和层析试剂，使得经所述免疫亲和层析色谱胶机测前处理后具有极佳的检出限、定量限、回收率、净化能力和抗基质效应能力等多种优异效果；[0015]本发明的另外一个目的在于提供上述单克隆抗体制备的免疫亲和层析色谱胶和机测前处理试剂在对氯霉素类抗生素残留样本预处理和/或检测中的应用。[0016]本发明的另外一个目的在于提供采用上述单克隆抗体制备的免疫亲和层析色谱胶、氯霉素单克隆抗体制备的免疫亲和层析色谱胶和机测前处理试剂组成的免疫亲和层析试剂，使得经所述免疫亲和层析试剂机测前处理后具有极佳的检出限、定量限、回收率、净化能力和抗基质干扰能力等多种优异效果。[0017]为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：[0018]氟苯尼考/甲砜霉素单抗杂交瘤细胞株，保藏编号为cctccno.c201945，命名为9d4-ff，并于2019年3月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为武汉市武昌珞珈山武汉大学内。[0019]本发明以氟苯尼考新型人工抗原作为免疫原免疫小鼠，经过筛选获得上述9d4-ff杂交瘤细胞株，其诱生的单抗与甲砜霉素、氯霉素进行交叉反应率的检测，当认定氟苯尼考的cr值为100％时，发现甲砜霉素交叉反应率较大，cr值分别为69.69％，而氯霉素的cr值小于0.001％。[0020]所述新型人工抗原由氟苯尼考(半抗原)溶解于吡啶后与戊二酸酐(五碳链联接臂)反应被修饰成氟苯尼考戊二酸半醛，n2气吹干后转入二甲基甲酰胺/1,4-二氧六环混合溶剂中经氯甲酸异丁酯/正三丁胺活化再与牛血白蛋白中游离-nh2交联而成，与现有报道氟苯尼考以丁二酸酐(四碳链联接臂)作修饰剂制备的人工抗原相比，本发明的新型人工抗原的优势在于：[0021](1)联接臂变长：由原来c4链变为c5链，使氟苯尼考抗原表位暴露更为充分便于机体识别。[0022](2)氟苯尼考化学修饰、修饰基团活化以及与蛋白载体交联均在温和反应体系完成，不需要高级仪器设备，可在普通实验室完成。[0023](3)反应体系无萃取步骤：既保证产物得率，又可实现反应体系微量化。[0024]具体的反应过程如下：[0025][0026]本发明获得的杂交瘤细胞株-9d4-ff的步骤具体如下：[0027]①针对氟苯尼考人工抗原-免疫原的合成与理化表征分析；[0028]②针对氟苯尼考人工抗原-包被抗原的合成；[0029]③balb/c鼠免疫以及合格受免鼠的遴选；[0030]④细胞融合以及针对氟苯尼考单抗杂交瘤细胞株筛选与克隆；[0031]⑤体内诱生腹水的获取与评估；[0032]经上述步骤，本发明获得一株针对氟苯尼考单克隆杂交瘤细胞-9d4-ff，其体内诱生腹水样本，经间接竞争elisa试验分析，所述该样本对氟苯尼考具有极高的检测灵敏度(ic50为1.35ppb)和较高工作滴度(工作稀释度为1：40000)，与甲砜霉素免疫交叉率约为69.69％，与氯霉素免疫交叉率＜0.001％。该结果为制备氟苯尼考/甲砜霉素特异性固相化免疫吸附剂提供了供应稳定、质量可靠、价格低廉的核心原料。[0033]基于上述优异的技术效果，本发明提供了所述杂交瘤细胞株或由其分泌的单克隆抗体在氯霉素类残留样本机测前处理/免疫检测中的应用，或在制备氯霉素类残留样本机前处理/免疫检测产品中的应用；其中，所述氯霉素类为氟苯尼考和/或甲砜霉素。[0034]更优选地，本发明进一步提供了保藏编号为cctccno.c201945的杂交瘤细胞株或由其分泌的单克隆抗体联合保藏编号为cctccno.c201870的杂交瘤细胞株或由其分泌的单克隆抗体在氯霉素类残留样本机前处理/免疫检测中的应用，或在制备氯霉素类残留样本机测前处理/免疫检测产品中的应用。[0035]保藏编号cctccno.c201870的杂交瘤细胞株分泌产生的单抗针对氯霉素有强特异性(一对一)、高亲和力，但对氯霉素二种重要替代物-甲砜霉素和氟苯尼考均无免疫交叉性；该杂交瘤细胞株，保藏编号为cctccno.c201870，命名为2d2-c1，并于2018年3月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为武汉市武昌珞珈山武汉大学内。[0036]作为优选，所述氯霉素类为氟苯尼考、甲砜霉素、氯霉素中的一种或两种以上。[0037]在本发明具体实施方式中，所述机测前处理/免疫检测产品为免疫亲和层析色谱胶或由该胶预填装的免疫亲和层析色谱柱。[0038]本发明提供的免疫亲和层析胶，通过结合液-洗涤液-洗脱液等参数优化后，氟苯尼考/甲砜霉素二种目标物系列浓度标液的免疫层析胶富集样本经hplc-ms/ms定量测定：针对氟苯尼考检出限和定量限:0.1,0.3ppb、有效吸附浓度域：0.1-81ppb；针对甲砜霉素检出限和定量限:0.3,0.9ppb、有效吸附浓度域：0.3-81ppb；针对氯霉素检出限和定量限:0.03,0.1ppb、有效吸附浓度域：0.01-81ppb；能满足配制氯霉素类混合型免疫亲和层析胶的基本要求。[0039]作为优选，所述机前处理/免疫检测产品中还包括结合液、洗涤液和洗脱液；所述结合液为0.01molml-1pbs，所述洗涤液为0.01molml-1pbs和水(交替洗涤)，所述洗脱液为甲醇：氨水体积比为9:1的混合洗脱液。[0040]本发明提供的免疫亲和层析胶作为氯霉素类类残留样本净化核心试剂，以系列浓度的等剂量三种药物混合物分别掺入虾肉/天然湖水后作模式试样，经层析胶机测前净化处理，处理样本再作lc-ms/ms定性与定量分析，并与国标法的固相萃取spe(solidphaseextraction)净化方法作对比试验。结果显示：以处理通量、抗基质干扰力、检测限、掺入目标物回收率等指标作评估，该模式全面优于国标固相萃取净化模式。[0041]根据上述应用，本发明提供了一种氯霉素类特异性免疫亲和层析机测前处理/免疫检测产品，包括由保藏编号为cctccno.c201945的杂交瘤细胞株分泌产生单抗经纯化再与cnbr-activatedsepharose-4b胶化学交联形成的免疫亲和层析色谱胶或由该胶预填装的免疫亲和层析色谱柱。[0042]作为优选，所述机测前处理/免疫检测产品还包括：由保藏编号为cctccno.c201870的杂交瘤细胞株分泌产生单抗经纯化再与cnbr-activatedsepharose-4b胶化学交联形成的免疫亲和层析色谱胶或由该胶预填装的免疫亲和层析色谱柱。[0043]更优选地，还包括：结合液、洗涤液和洗脱液；所述结合液为0.01molml-1pbs，所述洗涤液为0.01molml-1pbs和水(交替洗涤)，所述洗脱液为甲醇：氨水体积比为9:1的混合洗脱液。[0044]在免疫亲和层析色谱胶的制备中，本发明通过纯化单抗蛋白与cnbr-activatedsepharose-4b胶化学交联形成固相化抗体蛋白而获得，而所述免疫亲和层析色谱柱是将所述免疫亲和层析色谱胶填充于柱床中获得。根据检测的需要，所述色谱柱可以添加由保藏编号为cctccno.c201945的杂交瘤细胞株分泌产生单抗制备而成的色谱胶和/或保藏编号为cctccno.c201870的杂交瘤细胞株分泌产生单抗制备而成的色谱胶，两者的体积比优选为1:1。[0045]根据上述免疫亲和层析色谱胶/柱的性能，本发明还提供了一种预处理氯霉素类残留样本的方法，采用本发明所述机测前处理/免疫检测产品对于待测样本进行机测前处理。[0046]同时，本发明也提供了一种检测氯霉素类残留样本的方法，采用本发明所述机测前处理/免疫检测产品对于待测样本进行机前处理，将处理后的样本通过lc-ms/ms进行检测。[0047]本发明选取对氟苯尼考亲和力以及对甲砜霉素免疫交叉反应均较佳的单抗杂交瘤细胞株源制备其纯化抗体蛋白，利用该抗体蛋白连同特定杂交瘤细胞分泌的氯霉素单抗按ge公司标准操作规程制备免疫亲和层析胶，获取层析胶/柱产品后，通过lc-ms/ms等分析设备进行检测，具备较佳的检出限、定量限，同时与国标spe方法相比抗基质干扰能力、加标回收率和净化处理能力更优。[0048]生物保藏信息说明[0049](1)用于保藏的杂交瘤细胞株9d4-ff的分类命名为：[0050]保藏单位全称：中国典型培养物保藏中心；[0051]保藏单位简称：cctcc；[0052]保藏单位地址：武汉市武昌珞珈山武汉大学内；[0053]保藏日期：2019年3月18日；[0054]保藏编号：cctccno.c201945；[0055](2)用于保藏的杂交瘤细胞株2d2-c1的分类命名为：[0056]保藏单位全称：中国典型培养物保藏中心；[0057]保藏单位简称：cctcc；[0058]保藏单位地址：武汉市武昌珞珈山武汉大学内；[0059]保藏日期：2018年3月14日；[0060]保藏编号：cctccno.c201870；附图说明[0061]图1所示为ff-glu-bsa大分子质谱图；[0062]图2所示为细胞诱生腹水对ff竞争抑制曲线图；[0063]图3所示为细胞诱生腹水对氯霉素标样竞争抑制曲线图；[0064]图4所示为二种单抗诱生腹水样本经proteing纯化的二种纯化物蛋白电泳鉴定图；[0065]图5所示为二种单抗蛋白纯化物与胶交联前后蛋白含量检测直观图；[0066]图6所示为三种目标物混标液经lc-ms/ms测定的单目标物特征峰型图；[0067]图7所示为混合型胶在三因子多水平组合条件下对混标物回收率的三维柱状图；[0068]图8所示为系列浓度三种目标物混标液混合胶处理样本检测信号回归方程与拟合曲线；[0069]图9所示为天然湖水/虾肌肉经混合胶净化样本lc-ms/ms检测峰型图(blank对照)；二种基质经混合胶净化后仅出现峰幅极低的杂峰，推测这些杂峰是净化过程中残留的无机盐引起，不干扰掺标目标物特征峰的呈现；[0070]图10所示为天然湖水三种目标物混标试样经二种净化处理的检测峰型对比图；[0071]图11所示为虾肌肉三种目标物混标试样经二种净化处理的检测峰型对比图。具体实施方式：[0072]本发明公开了氟苯尼考/甲砜霉素单抗杂交瘤细胞株及其分泌的单抗和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的杂交瘤细胞及其单抗和应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的杂交瘤细胞及其单抗和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。[0073]下面就本发明提供的氟苯尼考/甲砜霉素单抗杂交瘤细胞株及其分泌的单抗和应用做进一步说明。[0074]实施例1：本发明所述针对氟苯尼考/甲砜霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株制备以及评估[0075]1、针对氟苯尼考人工抗原-免疫原的合成：称取35.8mgff(氟苯尼考)标样(混合消光型，0.1mmol)，加入2ml含11.4mg(0.1mmol)glu(戊二酸酐)的吡啶溶液中，室温搅拌反应过夜；完成后，氮气吹干吡啶；用4ml溶剂(dmf与1,4-二氧六环按1:1体积比混合)溶解ff-glu半醛；加入26.2μl(约0.1mmol)正三丁胺，冰浴中搅拌10min，加入氯甲酸异丁酯14.4μl(约0.1mmol)，转入室温搅拌1h；[0076]将上述活化的ff液逐滴加入5ml冰水浴处理的含10mgml-1bsa(牛血清白蛋白)的硼酸钠液(0.1moll-1,ph8.5)中，1h内加完，室温搅拌反应过夜。用0.1mol硼酸钠液(ph8.5)透析过夜，0.01mpbs(ph7.4)透析2d，3000rpm离心20min，取上清；取少许进行大分子质谱鉴定，其余部分制备成冻干粉，并命名为bsa-glu-ff。[0077]合成线路示意图：[0078][0079]2、针对氟苯尼考人工抗原-包被抗原的合成：称取6mgffa(氟苯尼考胺)，溶于100μldmf(二甲基甲酰胺)中为a液；称取10mgova(卵清白蛋白)溶于1.5mlpbs中为b液；将a液缓慢滴加到b液中，然后加入4mgedc和3mgnhs；室温反应过夜；将反应物装入透析袋内，4℃用pbs缓冲液透析5d，每天更换透析液3次，并命名为：ffa-ova。合成线路图：[0080][0081]3、动物免疫与合格免疫鼠的遴选：从史莱克公司购进6只spf级六周龄雌性balb/c鼠，按严格spf级标准精心饲养，每只鼠按下表1免疫计划同步免疫。[0082]表1免疫计划[0083][0084]说明：f-b代表ff与bsa偶联物，f代表ff，cfa代表弗氏完全佐剂，ifa代表弗氏不完全佐剂；[0085]4、受免鼠血清样本的评估[0086]棋盘elisa对受免鼠抗血清效价定性标定[0087](1)包被：包被抗原ffa-ova用包被缓冲液分别稀释至9、3、1、0.33、0.11、0.03和0.01μgml-1并分别加于一块酶标板的a-gline；hline作阴性对照：3μgml-1ova/cbs；每孔加100μl。包被好后置37℃湿孵1.5h,再于4℃湿孵过夜；[0088](2)洗涤：取出酶标板并甩干，用pbs洗涤2+1(1指加第一次pbs甩干后不在摇床上振荡3min，2指在后两次加pbs后都要在摇床上振荡3min再甩干)次(每次每孔300μl)并拍干；[0089](3)封闭：每孔加350μl封闭液，于37℃湿孵2h；[0090](4)一抗稀释：用抗体稀释液将每份血清分别稀释成：1:1000、3000、9000、27000，81000五个稀释度，同时稀释无抗体鼠血清至1:3000作阴性对照，作为孵育一抗，室温预作用一小时；[0091](5)洗涤：将酶标板取出并甩干，用pbst洗涤2+1次并拍干；[0092](6)加一抗：每孔加100μl一抗孵育液，于37℃湿孵2h；[0093](7)二抗稀释：用抗体稀释液将辣根过氧化物酶标记二抗稀释至1：500；[0094](8)洗涤：取出酶标板并甩干，用pbst洗涤4+1次并拍干；[0095](9)加二抗：每孔加100μl二抗稀释液，于37℃湿孵80min；[0096](10)洗涤：取出酶标板并甩干，pbst洗涤3+1次，再用pbs洗涤1+1次并拍干；[0097](11)显色：每孔加100μl显色液，避光黑暗显色3min；[0098](12)终止：显色结束后马上在每孔加50μl终止液；[0099](13)用酶标仪测od490值。[0100]间接竞争elisa定性标定抗血清对ff标样的亲和力[0101](1)包被：以上述棋盘elisa标定的包被浓度为标准，将ffa-ova两种包被抗原分别包被在两块酶标板的a-gline；hline作阴性对照：同浓度ova/cbs；每孔都加100μl。包被好后至37℃湿孵1.5h，再于4℃湿孵过夜；[0102](2)洗涤-封闭同上述棋盘elisa；[0103](3)一抗与竞争物的处理：[0104]a：用pbs缓冲液将抗血清稀释至两倍的标定的抗血清效价，并作为工作一抗备用；[0105]b：称取ff标样，用甲醇稀释成1mgml-1作为储存液备用；[0106]c：储存液用甲醇将ff标样的浓度分别稀释成0.2、1、5、25、125和625ngml-1六个稀释度，处理完后再每个稀释度中加等体积的工作一抗，使最终浓度为0.1、0.5、2.5、12.5、62.5和312.5ngml-1。[0107]d：将上述处理后的抗体作为孵育一抗，室温摇床振荡45min。[0108](4)加一抗：将处理好后的孵育一抗加于酶标板的a-fline；g、hline加pbs缓冲液稀释的无竞争物的抗血清(稀释度为标定的抗血清效价)；每孔都加100μl，37℃湿孵2h；[0109](5)洗涤-加二抗-洗涤-显色-终止同上述棋盘elisa。[0110]5、氟苯尼考/甲砜霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株制备与评估[0111](1)小鼠骨髓瘤细胞株-sp2/0细胞的培养：细胞株由江苏省血液研究所单抗室惠赠，并在10％fbs(eallbio公司产品)/rpmi-1640正常培养基中培养并传代，以细胞亚克隆试验单细胞成集落率＞70％以及1xhat选培试验证实该细胞株对hat完全敏感后视为合格培养系统；再将该细胞株用正常培养基培养至对数生长期且细胞形态大小均一、活细胞率＞98％时，轻轻拍打sp2/0细胞瓶的瓶壁收集细胞，1000r/min离心5min去除培养基，然后加无血清rpmi-1640培养基重悬细胞，计数备用；[0112](2)饲养细胞获取：融合前一天，取数只10周龄雄性小balb/c鼠，处死后浸泡于75％酒精中1-2min；剪开腹部表皮后，在腹腔上按压酒精棉进行消毒；剪开腹膜，然后用无菌巴氏滴管吸取含1×hat的rpmi-1640培养基淘洗小鼠腹腔，并移取出巨噬细胞于培养基中，吹打悬浮；按4块/只、100μl/孔种植于数块96孔培养板中，于37℃、5％co2的培养箱中培养；[0113](3)脾脏细胞的获取：七免后隔28天再进行一次免疫冲击，冲击后3d摘眼球采血；断颈处死后，将该鼠浸泡于75％酒精1-2min；剪开胸腹皮肤和肌肉，用镊子取出脾脏，剪去非脾结缔组织；在rpmi-1640培养液中洗一下，然后转入离心管中，1000rpm离心3min，弃去上清，再加rpmi-1640培养液至30ml，计数备用；[0114](4)细胞融合：按脾细胞:骨髓瘤细胞约8:1比例混匀后，1000r/min离心10min,去培养基，轻轻拍打使沉淀松弛(方便沉淀的溶解)；接下来试剂的滴加都要保持37℃恒温、缓慢滴加和持续搅拌，且按顺序滴加：分别是1mlpeg1500、1mlrpmi-1640培养基两次、1.5mlrpmi-1640培养基两次和5mlrpmi-1640培养；然后1000r/min离心5min，去培养基，轻轻拍打使沉淀松弛；加入少量含1×hat的rpmi-1640培养基，轻轻摇动，待沉淀完全溶解后，加入到37℃的含1×hat的rpmi-1640培养基中制备融合细胞悬液。[0115](5)细胞培养：将融合细胞悬液滴加于上述含有饲养细胞的96孔板中(每孔100μl)，并于37℃、5％co2培养箱中继续培养；4d和7d用含1×hat的rpmi-1640培养基分别进行一次半换液(即吹打混匀后用巴氏滴管移走一半体积，然后用含1×hat的rpmi-1640培养基补足体积)；10d用含1×ht的rpmi-1640培养基进行一次半换液；当融合细胞生长至96孔板1/10-1/4面积时就可以取一点进行初筛，剩余部分仍然于37℃、5％co2培养箱中继续培养。[0116]6、杂交瘤细胞的筛选和评估[0117]用棋盘elisa实验标定的包被浓度进行包被，洗涤-封闭同上；[0118]将上述融合细胞的培养上清一一对应的转移100μl至一新的96孔板中；再取一96孔板，取sp2/0细胞培养上清作阴性对照，稀释抗血清至1:10000作阳性对照，室温振荡一小时作孵育一抗；[0119]将上述一抗一一对应转移100μl至酶标板中，其余步骤同上述棋盘elisa。显色终止后，选取信号强的孔作为疑是孔，并将其一一对应扩增到24孔板中继续培养。[0120]7、ff特异性抗体阳性克隆的确证[0121]包被-洗涤-封闭-洗涤方法同上；[0122]取上述24孔培养板孔中处于对数生长期的杂交瘤细胞培养上清，用pbs缓冲液稀释原液，分别制成原液、1/10稀释液两个稀释度，每个稀释度均分成二份，一份加等体积pbs液，另一份加等体积2μgml-1ff标样/pbs液，即一个疑是阳性克隆样本均为4个处理，每个处理两个复孔；将这些配好的离心管置于摇床上，室温振荡孵育一小时后加入酶标板中作一抗孵育，其余步骤同上述棋盘elisa；显色终止后，每个样本同稀释度进行加ff标样处理与未加ff标样处理组间的od490值比较，再以候选克隆在24孔培养板孔扩大培养后能维持强杂交信号(即1/10稀释度od490值仍然较强)、该强信号能被ff标样有效抑制(同组ff处理有明显抑制)为标准，从上述候选克隆样本中筛选出针对ff特异性抗体阳性孔。[0123]8、ff特异性抗体阳性克隆的亚克隆：对上述筛选出的阳性孔进行亚克隆(有限稀释法)，9-12d镜检后，选择细胞状态良好、细胞数目较多(128个细胞左右)的单集落孔上清为待测样本，进行上述间接elisa。然后再进行亚克隆，直到阳性率为100％时，再挑选其中几孔信号最强、细胞生长最好的进行扩增、培养、冻存和保种。[0124]9、针对氟苯尼考单克隆抗体大量制备与评估：从上海史莱克公司购自10只10周龄雄性balb/c–nuke鼠，按0.5ml/只腹腔注射pristane致敏7d后，再按1x106/只腹腔接种杂交瘤细胞，按spf级动物饲养标准饲养，待其腹部明显膨大后抽取腹水，于4℃1000r/min离心10min取上清；于4℃12000r/min离心20min，取上清合并留小样用于评估，其余-20℃冻存备用。将上述腹水用0.1％ova/pbs稀释成1：5000、10000、20000、40000、80000五个稀释度分别作孵育一抗后，评估方法，同上述抗血清的棋盘和间接竞争elisa评估，与甲砜霉素、氯霉素免疫交叉试验方法与氟苯霉素作抑制物间接竞争elisa相同。[0125]10、结果[0126](1)针对氟苯尼考的人工免疫原：经上述化学合成，共回收约41mg(以蛋白量计)人工抗原，回收率约为82％；经大分子质谱分析结果见图1，该图显示：bsa标样分子量为66592，ff-glu-bsa偶联物分子量则为72991。这说明了ff已成功和bsa偶联，且根据公式[ff-glu-bsa分子量-bsa分子量]/ff分子量可大致计算出ff与bsa摩尔比为18:1。满足了小鼠免疫的需求。[0127](2)针对氟苯尼考的人工包被抗原：经上述化学合成，共回收约8.5mg(以蛋白量计)人工抗原，回收率约为85％；满足了下面试验需求。[0128](3)氟苯尼考免疫原合格受免鼠的遴选：六只受免鼠的六免后7天后，割尾后获取的6份抗血清分别作待测一抗，以3μg/mlova-ffa包被作标准，经上述棋盘和间接竞争elisa测定：其中二份抗血清工作稀释度＞1:10000(od490＞＝1.5)，同时针对氟苯尼考标准液的半抑制浓度ic50(50％inhibitionconcentration)＜＝5ng/ml，判读为合格抗血清，对应鼠作候选鼠，间隔4周免疫冲击，取其脾后用于融合。[0129](4)针对氟苯尼考单抗杂交瘤细胞株筛选、克隆与评估：上述候选鼠脾细胞与sp2/0细胞融合后于10块96孔培养板中培养，培养10d后的各孔上清一一对应于10块elisa孔，经3ug/mlova-ffa包被的间接elisa检测：共获得10孔疑似阳性孔(od490＞＝1.5)；其后一一对应于24孔培养板孔中扩增长至对数期，各取上清作待测一抗，将96孔elisa板按每检测单元4行2列(共8孔)划分为：(1-2)x(a-d)\(3-4)x(a-d)……\(11-12)x(e-h)12个检测单元：每份上清作四种处理：上清+加等体积pbs；上清+加等体积2μg/ml氟苯尼考；10x稀释上清+加等体积pbs；10x稀释上清+加等体积2μg/ml氟苯尼考，每个待测样本一一对应加至10个检测单元中(每一处理2个复孔)，最后二个检测单元用1000x稀释抗血请作同步阳性对照.经检测：二个稀释度的对照对氟苯尼考均有一定抑制价，说明检测系统工作正常；所检测10个克隆中，6个克隆样本免疫杂交信号丢失，其余4个克隆保有免疫杂交信号，其中仅有一株针对氟苯尼考有明显竞争抑制价，判读为针对氟苯尼考单抗确证克隆，按原始座标命名为-9d4，经二轮单细胞亚克隆并经检测阳性率100％；第二轮亚克隆共获得28个单细胞克隆检测均为阳性：a1-c4均有较强免疫杂交信号；c5-8为sp2/0培养上清的阴性对照；c9-12为1:5000的抗血清阳性对照。该结果表明经二轮单细胞亚克隆，阳性克隆率已经达100％(28/28)，说明该株细胞已得到充分纯化，且分泌单抗稳定，取其中一个克隆扩大培养并冻存，同时送至中国典型培养物保藏中心保种并获保藏号：cctccno.c201945。[0130](5)针对氟苯尼考单抗腹水样本的获取与评估：上述杂交瘤细胞共注射了10只balb/c-nuke鼠，10d和11d收集到了约65ml诱生腹水；腹水经过棋盘elisa法测定获得最佳标定：腹水工作稀释度：1:40000稀释；ffa-ova包被浓度：3μg/ml，以该二种稀释度作为主要技术参数对氟苯尼考间接竞争elisa检测结果见表2和图2。[0131]表2细胞诱生腹水对ff亲和力[0132][0133][0134]从表2和图2可以得出：该系统针对氟苯尼考有效检测域：0.556-3.153ngml-1(ppb，ic20-ic80)；检测灵敏度：1.354ngml-1(ppb，ic50)，以同样参数对氯霉素、甲砜霉素免疫交叉率检测结果见下表3；[0135]表39d4-ff诱生腹水对氯霉素类药物交叉率[0136][0137]上述的结果表明，本发明已经获得一株针对氟苯尼考高滴度高亲和力的单克隆抗体，此外，该株抗体对氯霉素类中另一重要成员-甲砜霉素有极佳的免疫交叉性(免疫交叉率达69.69％)，该结果为制备同时针对氟苯尼考/甲砜霉素高亲和力免疫吸附剂提供了来源易得、成本低廉、质量稳定可控试验原料。[0138]实施例2：本发明所述针对氯霉素单克隆抗体腹水样本制备以及评估[0139]1、针对氯霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株筛选与对应细胞上清液的评估：氯霉素人工抗原制备：包括氯霉素琥珀酸与klh(匙孔血蓝蛋白)化学交联(作免疫原)，氯霉素经还原后经重氮反应与bsa(牛血清白蛋白)化学交联(作包被抗原)；balb/c鼠免疫；针对氯霉素抗血清评估以及针对氯霉素单克隆抗体分泌融合细胞克隆筛选与评估的棋盘elisa和间接竞争elisa检测方法的建立与优化；单克隆抗体目标克隆的培养细胞上清对氯霉素标样定量或半定量测定等参见文献《developmentofamonoclonalantibodybased-elisaforthedetectionofchloramphenicolinshrimp,feedandmilksamplesandvalidationbylc-ms/mscoupledwithimmunoaffinityclean-up》(anal.methods.2019.11.507-516)的方法。经评估遴选出针对氯霉素滴度高免疫亲和力强杂交瘤细胞株2d2-c1株作出发细胞株用于下面试验。[0140]2、针对氯霉素单克隆抗体大量制备与评估：大量收集杂交瘤细胞株2d2-c1的对数期生长细胞，按实施例1提及方法体内注射10只10周龄雄性balb/c–nuke鼠。获取对应诱生腹水样本后，取小样用0.1％ova/pbs稀释成1：5000、10000、20000、40000、80000五个稀释度，上述抗血清的棋盘和间接竞争elisa评估，与氟苯霉素、甲砜霉素免疫交叉试验方法与氯霉素作抑制物间接竞争elisa相同。[0141]3、结果[0142](1)2d2-c1细胞培养上清对氯霉素标样定量检测与标准抑制曲线绘制：融合细胞经筛选和二轮亚克隆获得了针对氯霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株：1b1和2d2；选取对氯霉素亲和力较高的细胞株2d2-c1,以其对数生长期的培养上清作待测一抗，经棋盘elisa标定：最佳包被为：5μg/mlbsa-cap，最佳一抗稀释度：1：400；再以该技术参数与0.01，0.03，0.09，0.27，0.81，2.43，7.29ng/ml浓度点的氯霉素分别作竞争物，再设无竞争物对照组作间接竞争elisa测定，经测定：每个浓度点(12复孔)的od490平均值记为b，对照组(12复孔)的od490平均值记为b0，每个浓度点抑制率按(b0-b)/b0*100％计算；以抑制物浓度作横坐标，抑制率作纵坐标绘制该样本对氯霉素标准液的抑制曲线，结果参考文献《developmentofamonoclonalantibodybased-elisaforthedetectionofchloramphenicolinshrimp,feedandmilksamplesandvalidationbylc-ms/mscoupledwithimmunoaffinityclean-up》(anal.methods.2019.11.507-516)。[0143](2)2d2-c1诱生腹水对氯霉素标准抑制曲线绘制以及对其同系物免疫交叉性测定：2d2-c1细胞共注射了10只balb/c-nuke鼠，11d和12d收集到了约67ml诱生腹水；棋盘elisa标定:腹水工作稀释度：1:40000稀释；cap-ova包被浓度：5μg/ml.用该参数对氯霉素标样绘制标准抑制曲线见图3，抑制曲线图显示：针对氯霉素有效检测阈：0.033-2.53ng/ml(ic20-ic80),检测灵敏度：0.51ng/ml(ic50)，与氟苯尼考和甲砜霉素免疫交叉率见表4：[0144]表42d2-c1诱生腹水对氯霉素类药物交叉率[0145][0146]由图3和表4可以的得出：[0147]第一、2d2-c1细胞株所分泌单抗对氯霉素具有极高免疫亲和力，为下一步研发针对氯霉素目标物极微含量样本具有卓越富集性能免疫吸附产品奠定了基础。[0148]第二、2d2-c1细胞株所分泌单抗对氯霉素具有极强特异性(一对一)，为下一步研发针对含氯霉素目标物基质复杂待检样本具有卓越选择性能免疫吸附产品提供了可能。[0149]第三、该株细胞诱生腹水样本与培养上清相比，对氯霉素的免疫亲和力没有下降，但其抗体滴度增加近百倍。该结果为下一步研发具有一定价格竞争优势的氯霉素固相免疫吸附剂产品提供了目标抗体含量丰富、成本低廉试验原料。[0150]实施例3：本发明所述二种单抗对应固相化免疫吸附胶的制备[0151]1、二种单抗蛋白的大量纯化：分别取上述二种单抗数8ml腹水样本，各用冰水浴预冷的0.01mpbs(ph8.0)3×稀释后备用。再分别取与上述腹水原液等体积的proteingresin(金斯瑞公司产品)装填于2只层析用小柱(30ml)中，按金斯瑞公司提供标准方法纯化上述二种单抗蛋白，分部收集二种单抗的纯化蛋白洗脱液经1/10体积1mtris-cl(ph8.5)中和后，各置于蛋白透析袋(7500-14000mwsolarbio公司产品)中，于冰水浴预冷的0.01mpbs(ph7.4)液中透析24hr(每4-6h换液一次)。分别各取小样：蛋白含量用bca试剂盒(碧云天公司产品)并按其说明书测定；蛋白纯度用sds-page电泳鉴定，其余部分分装-80℃冻存备用。[0152]2、二种单抗纯化蛋白与cnbr-activatedsepharosetm4b交联：[0153](1)交联前单克隆抗体蛋白预处理：分别取已标定蛋白含量的上述二种单抗纯化单克隆抗体蛋白液分别置于二只透析袋(7500-14000mw)中，于100-200×0.1mnahco3/0.5mnacl(ph8.3)溶液4℃透析24hr(每4-6h换液一次)，透析后蛋白用0.22μm微孔滤膜过滤，过滤后于4℃保存备用。[0154](2)蛋白液与固胶交联：二种单抗样本均按待交联纯化单抗蛋白毫克数/5/3.5的克数(注：先按小胶珠粉溶涨系数1:3.5；再按5mg纯化单抗蛋白：1ml溶涨胶计算)各称取cnbr-activatedsepharosetm4b(healthcare公司产品)干粉于2支50ml离心管(corning公司产品)中，胶溶涨-洗涤-与纯化蛋白交联-洗涤-活化基团封闭-二种不同ph值缓冲液的交替洗涤等步骤均按healthcare公司提供的方法进行，分别取交联前和交联后的蛋白液小样作含量测定并计算其交联率。[0155]3、结果[0156](1)二种单抗纯化蛋白获得与鉴定：各取8ml二种单抗腹水样本经proteingresin一步法纯化:9d4-ff株获35ml1.35mg/ml共计47.25mg纯化蛋白；2d2-c1株获28ml1.65mg/ml共计46.20mg纯化蛋白,经sds-page电泳鉴定(见图4)，结果显示二种抗体纯化物均含有50kd(抗体重链)和25kd(抗体轻链)二条明显蛋白条带，无明显其他杂蛋白带，与鼠igg分子重链和轻链标定分子量吻合，表明本发明已经获得二种高纯度单抗蛋白，可以完全满足制备实用型免疫亲和层析胶中单抗蛋白的量和纯度需求。[0157](2)二种单抗纯化蛋白与固相化载体的交联率的评估：依据healthcare公司推荐合理交联度范围：2-10mg抗体蛋白：1ml溶涨胶，针对上述二种单抗，本发明均采用交联度的中间值：5mg抗体蛋白：1ml溶涨胶，通过二种单抗纯化蛋白交联前后浓度测定并结合公式：(交联前蛋白浓度-交联后蛋白浓度)/交联前蛋白浓度*100％计算出各自的交联率,二种单抗纯化蛋白处理前后浓度测定结果直观图见图5：经固相胶交联，二种单抗纯化物的蛋白浓度分别从1.25mg/ml陡降至0.04mg/ml；1.57mg/ml陡降至0.05mg/ml，充分说明二种单抗蛋白均能与固相胶极佳的交联，由该结果得出：9d4-ff株的交联率：(1.25-0.04)/1.25*100％＝96.8％；2d2-c1株的交联率：(1.57-0.05)/1.57*100％＝96.81％；该结果表明：本发明已获得了二种单抗交联率极佳的固相免疫吸附剂，为下一步试验奠定了坚实的基础。[0158]实施例4：针对氯霉素类混合型免疫亲和层析胶的配制与结合性能测定[0159]为了确证以及精确定量分析混合型免疫亲和层析胶所处理的以及常规固相萃取小柱spe(solidphaseextractioncartridge)所处理的目标物，本实施例采用lc-ms/ms法测定。[0160]1、氯霉素类多组分lc-ms测定方法建立与优化[0161](1)试剂：[0162]氯霉素，氟苯尼考购自dr.ehrenstorfergmbh(augsburg,germany)。甲砜霉素，购自阿拉丁(中国上海，均为色谱纯)。乙酸乙酯，甲醇，正己烷，甲酸(fisherhplcgrade)，其他试剂均为分析纯。[0163](2)仪器与附件：[0164]色谱仪：安捷伦1290型高效液相色谱仪[0165]质谱仪：安捷伦6545(qtof-ms)型质谱仪[0166]色谱柱：在zorbaxstablebondc18(1.8μm,3.0×50mm)柱[0167](3)测定条件：[0168]柱温：30℃；进样：20μl；流动相：甲醇+0.1％甲酸水；流速：0.3mlmin-1；梯度洗脱程序：下表5所示；离子源：负离子esi；干燥温度:200℃；气体流速:12lmin-1；气压：35psi；鞘气温度：375℃；鞘气流速:12lmin-1；毛细管电压:4000v；喷嘴电压2000v；分段电压:110v。[0169]表5梯度洗脱程序[0170][0171][0172]a——甲醇；b——0.1％甲酸水。[0173](4)lc-ms对氯霉素类三种目标物标准混标物检测和标准检测曲线绘制：分别精确称取1mg氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考各自用甲醇配成1mg/ml并作为母液保存，分别取少许上述三种每液，等体积混合后，再用上述流动相稀释成每种目标物均含：0.1、0.5、2.5、12.5、62.5、312.5、1562.5ng/ml七个浓度点的三种目标物混合液分别作的待测液，每个浓度点检测三次，以验证lc-ms检测系统的可靠性。[0174]2、针对氯霉素类多组分混合胶配制、优化与吸附性能的测定：[0175](1)针对氯霉素类多组分混合胶配制：各取实施例3所提及二种免疫亲和层析胶等体积混合后，按100μl(胶总压积)/管分装于1.5mlep管中，用0.01mpbs(ph7.2)离心洗涤二次尽量吸干pbs备用。[0176](2)本发明混合胶(iac)对多组分目标物免疫层析条件的优化：要使混合型iac能同时吸附三种目标物且均有较高的回收率，本实施例以三种目标物浓度均为20ngml-1(最大柱容量的中间值)混合标液作模式试样，以不同的上样液(结合液)、淋洗液(洗涤液)、洗脱液以及不同免疫结合时间做四指标多水平组合试验，并以三种目标物的回收率均较高作为标准，以获得最佳免疫亲和条件。[0177]上样液选用：纯水，0.01molml-1pbs，0.01molml-1pbs+10％甲醇水溶液(1:1)三种buffer；[0178]淋洗溶液选用：纯水，0.01molml-1pbs+水，0.01molml-1pbs+10％甲醇水三种buffer；[0179]洗脱液选用：0.1％甲酸水(ph＝2.5)，100％甲醇溶液，80％甲醇水溶液，meoh:hcooh(9:1)、meoh:nh3·h20(9:1)五种buffer；[0180]有关免疫亲和时间选用：10，15，30，45min四个作用时间点。经免疫亲和层析各组洗脱液氮吹(60℃)、1ml纯水复溶、过滤上样机测。[0181](3)混合胶对三种目标物单组分吸附性能的分析：在遴选了该胶对多组分目标物免疫层析最佳条件后，以三种目标物母液用0.01mpbs(ph7.4)配制出单目标物均含1、2、4、8、16、32ng/ml六组混合液并分别作待测液，每组的1ml待测液与100μl混合胶进行免疫层析试验(每组设三次独立重复试验，n＝3)，免疫层析后各组按上述方法进行氮吹、复溶、过滤-上样机测，每个组分通过各浓度点回收率作回归曲线；再将上述三种目标物母液分别用0.01mpbs(ph7.4)配制成500ng/ml单目标物饱和液(按鼠igg与目标物(mw300d计)摩尔比1：1推算出该100μl混合胶对各组分其最大理论吸附容量约为500ng)，按1ml单目标物饱和液与100μl混合胶进行免疫吸附试验(每种目标物：六次独立重复试验，n＝6)，免疫吸附后取其上清检测，再按(500-免疫吸附后检测值)ng/ml*1ml计算出该次反应的最大吸附容量，每种目标物得6个计算值再求平均值和之间的标准方差。[0182]3、结果[0183](1)三种目标物标准品对lc-ms检测系统的验证：用安捷伦一重二级杆的液-质串联仪lc-ms配合zorbaxstablebondc18(1.8μm,3.0×50mm)色谱柱对三种目标物均为0.1、0.5、2.5、12.5、62.5、312.5、1562.5ng/ml七个浓度点的三种目标物混合液检测结果显示：[0184]每种目标物的各个浓度与对应接收信号峰面积呈典型浓度依赖性且绘制回收曲线的拟合率r2均大于0.99；[0185]混合物样本中的每种目标物均有精确出峰时间，氯霉素：4.618min；甲砜霉素：3.548min；氟苯尼考：4.059min(见下表6)，同一目标物不同浓度的保留时间误差均小于5％；[0186]经质谱分析三种目标物的母离子分子量分别为：氯霉素＞322.0123；甲砜霉素＞355.0048；氟苯尼考＞357.0005(见下表6)；与三种目标物标准品标注的分子量吻合；[0187]三种目标物质谱信号的谱型：均为峰型锐利单峰且无任何杂峰。见图6质谱峰型图(每种目标物均为20ng/ml的混合液质谱图)。[0188]表6三种目标物混标液lc-ms标定的单目标物母离子分子量和保留时间[0189][0190]注：cap:氯霉素；tap:甲砜霉素；ff:氟苯尼考[0191]上述结果表明：该检测系统对单组分0.1-1562.5ng/ml浓度域的三种目标物混标样中的单目标物均能确证以及精确定量，可以满足后续样本测定。色谱柱选择以及lc-ms各种技术参数设定适易，三种目标物混合物同时测定不产生相互干扰。每种目标物的母离子分子量明确，可作为确证测定的直接证据。[0192](2)混合型免疫亲和层析胶亲和层析条件的选择：用三种目标物浓度均为20ng/ml混标物作试样，以单目标物回收率均大于60％作金标准，三因子综合优化条件为：结合液：0.01mpbs(ph7.4)；洗涤液:0.01mpbs(ph7.4)+h2o；洗脱液:甲醇+氨水(9：1v/v)。因此选择：0.01mpbs(ph7.4)作结合液；0.01mpbs(ph7.4)+h2o作洗涤液；甲醇+氨水(9：1v/v)作洗脱液；混合胶与待测样本免疫结合时间40min作最佳免疫层析试验条件组合应用于后续试验。各组试验条件所等得到每种目标物回收率见图7。[0193](3)混合型免疫亲和层析胶对三种目标物混标液吸附性能以及对单一目标物最大吸附容量的标定：[0194]混合型免疫亲和层析胶对三种目标物混标液吸附性能的标定：选用上述最佳反应条件，三种目标物均含1、2、4、8、16、32ng/ml六组混合液经混合胶免疫吸附的洗脱样本再经lc-ms测定结果显示：每个组分1到32ng/ml的6个浓度点所获得信号响应强度-即每种目标物的特征峰面积呈典型浓度依赖性，通过6个浓度点所绘制的浓度与对应信号强度相关曲线的拟合率r2均大于0.99，三种目标物：氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考各自检测曲线分别见图8；[0195]图8结果表明：[0196]本发明所建立混合型免疫层析胶与lc-ms联合检测系统能对1-32ng/ml浓度范围内的三种目标物的混合标样能对每种目标物准确确证以及精确定量，为低甚至极低含量三种目标物混合残留的实际待测样本检测需求提供可能。[0197]针对上述浓度域的三种目标物混标样，混合胶免疫吸附效应不存在相互干扰：即针对氯霉素固相免疫吸附剂与针对氟苯尼考/甲砜霉素固相免疫吸附剂各自免疫吸附目标物不产生空间位阻干扰；针对氟苯尼考/甲砜霉素固相免疫吸附剂在其抗体吸附表位过饱和的前体下，氟苯尼考与甲砜霉素之间并不产生量效竞争效应。[0198]混合型免疫亲和层析胶针对单组分最大吸附容量的标定：证实了上述混合胶对低甚至极低含量三种目标物混合样本具有极佳富集性后，本发明又考察了该胶的另一重要技术参数-针对单一目标物的最大吸附容量:通过三种单一目标物饱和标准液(500ng/ml)分别与该胶吸附后的剩余含量的精确定量测定，再按照吸附前单一目标物含量与吸附后单一目标物含量之间差值即为该胶针对单一目标物的最大吸附容量。三种目标物单一组分分别经6次重复试验求平均值，经测定：氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考的平均吸附容量分别为：81，140，109ng；三种目标物平均吸附容量和组间的标准差见下表7；[0199]表7混合胶针对三种目标物最大吸附容量与标准试验误差[0200]captapff最大柱容量(ng)81140109rsd(％)1.64.14.7[0201]实施例5：混合胶与常规固相萃取小柱对氯霉素类多组分掺标样本净化对比试验[0202]证实了本发明所述混合胶对三种目标物的标准混合液具有极佳免疫吸附性能后，该胶的抗基质干扰能力是决定该胶是否能被引入实际应用的关键指标。更进一步地，与国标法进行平行对比试验，进而获得该胶净化效果全面优于国标法净化的处理实际数据是为该胶替代常规固相萃取小柱应用于实际待测样本的重要依据，为此本实施例选用体长约12cm青虾(购自于本地农贸市场)和天然湖水(采自于苏州大学独墅湖校区附近的独墅湖水面下50cm的水样)经苏州农产品质量与安全监测中心检测证实无氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考残留后作模式基质用于后续试验。[0203]1、混合胶对三种目标物混标物掺入虾肉试样的净化与检测：取活虾去壳和内脏后剪碎、于4℃12000r/min匀浆5min,取虾肉匀浆或直接制备掺标样本或-20℃冻存备用。分别称取四份4g虾肉匀浆于四支50ml带盖聚丙烯离心管中，依次加入0、20、40、80μl的三种目标物浓度均为1μgml-1的混合标准溶液后，将试样涡旋5min充分混匀，于4℃冰箱过夜。第二天，每支离心管涡旋5min之后加入20ml乙酸乙酯，0.5ml氨水，涡旋混匀5分钟，震荡提取10min，5000r/min室温离心10min，取15ml上清液转移到另一个离心管中，于60℃氮气吹干。加3ml纯水，涡旋30min复溶，再加2ml正己烷，涡旋混匀3分钟，并以5000r/min离心10min，各取下层水相1ml作混合胶免疫净化。样本的净化-洗脱样本检测等方法与步骤同上。该试验独立重复三次。[0204]2、混合胶对三种目标物混标物掺入天然湖水的净化与检测：取天然湖水，于4℃12000r/min离心10min,分别称取四份4ml上清于四支50ml带盖聚丙烯离心管中，依次加入0、20、40、80μl的三种目标物浓度均为1μgml-1的混合标准溶液后，后续处理同上述方法。同样独立重复三次试验。[0205]3、spe柱对三种目标物混标物掺入虾肉/天然太湖水试样的净化与检测：[0206]待测样本的预处理：三种目标物掺入虾肉/天然湖水样本的制作、目标物的乙酸乙酯提取、萃取液氮气吹干、吹干物的复溶、正己烷脱脂等步骤同上，获得待净化水相样本备用。[0207]4、spe柱对待测样本的净化与进样检测：取数只oasis@hlb(300mg6mlwaters公司产品)小柱，每只小柱分别加5ml甲醇淋洗活化和5ml水淋洗平衡后，一份5ml待净化水相样本缓慢加入一只spe小柱中，待样品溶液流干后，加入5ml的纯水与5ml的5％甲醇水溶液进行淋洗，再加入5ml的甲醇溶液进行洗脱，洗脱液于60℃水浴下，氮气吹干。1ml的纯水复溶，过滤膜后进lc-ms检测，计算回收率。[0208]5、结果[0209](1)四种处理基质的三种目标物混合外标样本检测标准曲线标定：为了修正基质对lc-ms系统对三种目标物检测所产生系统偏差。本实施例采用四种基质：即混合胶对氯霉素类抗生素空白虾肉/天然湖水净化后的复溶水相(二种)；oasis@hlb小柱对氯霉素类抗生素空白虾肉/天然湖水净化后的复溶水相(二种)各自作三种目标物均为1、2、4、8、16、32ng/ml六水平混标液为上机试样。检测后分别作同处理单目标物不同加标水平标准检测曲线并作回归方程和计算拟合率r2,四种基质的外标物检测结果见下表8、表9。从表8-9可以得出四种处理水相作稀释液的三种目标物外标混合液，各个目标物获得检测信号与其浓度均具有良好相关性，其相关系数r2均大于0.99，充分表明四种基质并不干扰lc-ms系统对上述浓度域内的三种目标物的精确定量，该结果为下一步在对等基质水平下，lc-ms系统对三种目标物基质掺标物净化样本精确定量的可靠性奠定了坚实地基础。[0210]表8天然湖水经二种模式净化后的水相外标样本中的目标物定量回归方程和相关系数[0211][0212]表9虾肉经二种模式净化后的水相外标样本中的目标物定量回归方程和相关系数[0213][0214](2)天然湖水三种目标物混标物的二种处理净化效果的对比：[0215]定性对比：为了直观展示混合胶与spe小柱对上述三种目标物混标物的净化对比效果，在混合胶处理天然湖水净化样本(blank对照)经lc-ms检测获得检测峰型图(见图9天然湖水样本)仅呈现峰幅极低的杂峰并不干扰目标物特征峰的展现后，以浓度均为20ng/ml三种目标物混标湖水的二种净化样本lc-ms检测获得的三种目标物峰型图(见图10)显示：[0216]二种处理样本均能在三种目标物特定的保留时间出现各自特征峰，且各自保留时间邻近基本无杂峰；[0217]二种处理样本三种目标物特征峰峰幅相比：混合胶处理的样本均显著高于spe处理的样本，分别为cap:0.7>0.23；tap:0.3>0.15；ff:0.3>0.12；[0218]纵贯三种目标物全程连续测定峰(流动相连续洗脱检测约12min)分析:三种目标物特征峰以外基线(本底)相比：混合胶处理的样本优于spe处理的样本.[0219]上述该结果表明：[0220]二种净化介质对混标试样中的三种目标物均有一定保留能力，以三种目标物特征峰幅作定性指标，混合胶对三种目标物保留能力均远远高于spe小柱对三种目标物保留能力；[0221]虽本发明采用天然湖水模式基质所产生基质效应对待测样本中三种目标物特征峰的展示不构成实质性干扰，但以三种特征峰所对应杂峰—基质噪音信号峰作定性指标，混合胶处理样本的噪音水平明显低于spe处理样本，充分表明混合胶对基质滤除能力优于spe小柱；[0222]综合上述二个指标：iac净化效果显著优于spe小柱的净化效果[0223]定量对比：以三种目标物浓度分别均5、10、20ng/ml三水平混标物二种处理组经检测与统计结果见下表10，表10可以看出混合胶净化样本的目标物回收率普遍高于spe净化样本目标物的回收率，以同种目标物同等加标水平二种处理差值得到中间值为代表，结果显示：cap：78％>38％、差值40％；tap：84％>67.2％、差值16.8％；ff：79.2％>45.6％、差值33.6％；由此可以得出混合胶对目标物掺入样本净化效果远远优于spe小柱的净化处理。[0224]表10天然湖水三种目标物系列浓度混标试样经二种净化处理后各组的单目标物回收率[0225][0226](3)虾肌肉三种目标物混标物的二种处理净化效果的对比：[0227]定性对比：在混合胶净化虾肌肉样本(blank对照)所获得检测峰型图(见图9虾肌肉样本)同样仅呈现峰幅极低的杂峰不干扰目标物特征峰后，以同上浓度三种目标物混标虾肌肉的二种净化样本lc-ms检测获得的三种目标物峰型图(见图11)显示：[0228]与上述天然湖水混标模式试样处理效果相比，虾肉混标模式试样经二种处理样本虽也均能在三种目标物特定的保留时间出现各自特征峰，但仅混合胶处理样本在三种目标物各自保留时间邻近能保持无杂峰干扰；而spe处理的样本三种目标物各自保留时间邻近均有不同程度杂峰干扰，以ff\tap二种目标物的杂峰更为明显。[0229]二种处理样本三种目标物特征峰峰幅相比：混合胶处理的样本同样显著高于spe处理的样本，分别为cap:1.2>0.25；tap:0.4>0.07；ff:0.7>0.08.[0230]三种目标物特征峰以外基线(本底)相比：混合胶处理的样本基本无杂峰，而spe处理样本均有大量杂峰。[0231]上述结果表明：[0232]面对基质更为复杂待净化样本，二种净化介质对混标试样中的三种目标物仍能保持一定保留性能，以特征峰幅作定性指标，混合胶对三种目标物保留能力同样均远远高于spe小柱对三种目标物保留能力。[0233]以消除基质效应对目标物特征峰干扰作定性指标，混合胶处理与spe处理相比：混合胶净化处理不仅滤除了直接干扰特征峰的基质，同时也大量去除了其他基质。极大消除了检测本低。[0234]综合上述二个指标：iac净化效果显著优于spe小柱的净化效果[0235]定量对比：以三种目标物浓度分别均5、10、20ng/g三水平混标物二种处理组经检测与统计结果见下表11，表11可以看出混合胶净化样本的目标物回收率普遍高于spe净化样本目标物的回收率，选取二种处理组内变异系数相对小(cv(％))的单目标物同等加标水平样本作二种处理一一对比，结果显示：cap：63.4％>32.6％、差值30.8％；tap：57.9％>32.3％、差值25.6％；ff：72.5％>39.5％、差值33％；由此可以同样得出混合胶对目标物掺入样本净化效果远远优于spe小柱的净化处理。[0236]表11虾肌肉三种目标物系列浓度混标试样经二种净化处理后各组的单目标物回收率[0237][0238]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
：的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3 当前第1页1 2 3
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