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您当前的位置： 病毒载体及包装细胞系的制作方法
2021-02-02 12:02:36|
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起点商标网 病毒载体及包装细胞系[0001]相关申请的交叉引用[0002]本申请要求2018年4月12日提交的美国临时专利申请号62/656,823的优先权，其公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。[0003]以电子方式提交的文本文件的说明[0004]与本申请相关的序列表以文本格式而非纸质副本形式提供，并据此以引用的方式并入本说明书。含有序列表的文本文件的名称为viti_001_01wo_seqlist_st25.txt。文本文件为94kb，创建于2019年4月11日，并且通过efs-web以电子方式提交。
技术领域：
：[0005]本公开总体涉及病毒载体、包装细胞系及相关使用方法，且具体来说用于在体内扩增免疫细胞群以治疗疾病病状的相关方法。
背景技术：
：：[0006]癌症免疫疗法是一种以治疗性诱导对肿瘤的免疫反应为基础的治疗模式。过继性t细胞疗法(act)是癌症免疫疗法的一种形式。将淋巴细胞，特别是肿瘤浸润淋巴细胞(til)，从体内分离、离体培养、扩增，然后再灌注。扩增步骤可包括til的抗原特异性扩增或基因工程改造。act于rosenberg等人，adoptivecelltransferaspersonalizedimmunotherapyforhumancancer.science.348：62-8(2015)中综述。[0007]本发明人已意识到，作为act的替代方案，在体内转导til或其他免疫细胞可增强细胞在体内而非离体的扩增。此外，本发明人已意识到，在体内转导til或其他免疫细胞将允许治疗癌症或其他疾病病状，而不会有act所需的昂贵、耗时且有风险的程序。[0008]因此，需要在体内扩增til或其他免疫细胞群的手段。具体地，需要能够在体内选择性地扩增til或其他免疫细胞的期望群体的治疗剂。本公开提供了病毒载体、包装细胞系以及用于在体内扩增til或其他免疫细胞以治疗疾病病状的相关方法。技术实现要素：[0009]本公开部分地基于以下发现：设计来表达t细胞/nk细胞活化受体(以及任选的其他效应蛋白)的慢病毒载体和包装细胞系对于t细胞的体内扩增是有用的。本公开的慢病毒载体和包装细胞系可适于肿瘤浸润淋巴细胞在体内的转导和药物介导的扩增，诸如当使用包装细胞系将慢病毒载体包装成慢病毒颗粒并将所产生的慢病毒颗粒递送至受试者的体内时。根据本公开的慢病毒颗粒的瘤内注射导致肿瘤浸润淋巴细胞的体内扩增。当t细胞/nk细胞活化受体能够被小分子激活(或失活)时，肿瘤浸润淋巴细胞的扩增可通过使用此种小分子来控制。任选地，包装细胞系表达t细胞活化或共刺激分子，从而在不存在外源性活化剂的情况下，促进来源于包装细胞系的慢病毒颗粒对t细胞的转导。任选地，慢病毒载体赋予对一种或多种免疫抑制药物的耐药性，从而促进靶细胞的选择性扩增。[0010]在一个方面，本公开提供了一种包含t细胞和/或nk细胞特异性启动子的核酸载体，所述t细胞和/或nk细胞特异性启动子可操作地连接到编码t细胞/nk细胞活化受体的核酸序列，其中t细胞/nk细胞活化受体能够被小分子激活。在一个实施方案中，核酸载体为慢病毒载体。在一个实施方案中，核酸载体包含与seqidno：6-11或其片段至少部分相同的序列。[0011]在另一方面，本公开提供了一种包含强启动子的核酸载体，所述强启动子可操作地连接到编码t细胞/nk细胞活化受体的核酸序列，其中t细胞/nk细胞活化受体能够被小分子激活。在一个实施方案中，强启动子选自seqidno：1-5。[0012]在另一方面，本公开提供了一种用于产生能够激活并有效转导t细胞的慢病毒颗粒的包装细胞系，所述包装细胞系包含能够包装慢病毒载体的培养的细胞，其中所培养的细胞被基因工程改造以表达t细胞活化或共刺激分子。[0013]在另一方面，本公开提供了一种慢病毒颗粒，所述慢病毒颗粒包含核酸载体，诸如本公开的任意核酸载体。在一个实施方案中，慢病毒颗粒包含t细胞活化或共刺激分子，例如抗cd3抗体、cd28配体或41bb配体。[0014]在另一方面，本公开提供了一种用于激活并有效转导t细胞的慢病毒颗粒，所述慢病毒颗粒通过将如权利要求19所述的核酸载体转导到经基因工程改造以表达t细胞活化或共刺激分子的培养细胞中来制备。[0015]在另一方面，本公开提供了一种用于治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用本公开的任何慢病毒颗粒，以及向受试者施用小分子(慢病毒颗粒的t细胞/nk细胞活化受体能够被小分子激活)，其中在受试者中治疗癌症。[0016]在另一方面，本公开提供了一种用于扩增能够识别并杀死有此需要的受试者中肿瘤细胞的t细胞的方法，所述方法包括向受试者施用本公开的任何慢病毒颗粒，以及向受试者施用小分子(慢病毒颗粒的t细胞/nk细胞活化受体能够被小分子激活)，其中能够识别并杀死受试者中肿瘤细胞的t细胞得到扩增。[0017]在另一方面，本公开提供了一种包含对t细胞、nk细胞、或t细胞和nk细胞有特异性的启动子的核酸，其中核酸的序列与选自由seqidno：1-4组成的组的序列至少90％相同。[0018]本公开的另外的方面和实施方案将从下面的详细描述中显而易见。附图说明[0019]图1a至图1b描绘了慢病毒颗粒。图1a是表面工程改造的慢病毒颗粒的一个实施方案的示意图，其包含图1b所示的慢病毒颗粒中不存在的表面表达的抗cd3和t细胞共刺激分子。[0020]图2描绘了用于从用编码抗cd3scfv、cd86和cd137l的慢病毒载体转导的hek-293t细胞产生hatse-293包装细胞系的实验方案。将cd86+cd137l+通过荧光活化细胞分选法分离，扩增，并冷冻以供长期储存和使用。[0021]图3a至图3k描绘了对cd46的亲代293细胞系和hatse-293包装细胞系(两种细胞系上的预期组成性表达)以及cd86+/cd137l+表达(仅在hatse-293细胞系中预期的表达)的facs分析。[0022]图3a至图3e描绘了对cd46的亲代hek-293细胞系(预期组成性表达)以及cd86/cd137l表达(预期无表达)的分析。在未染色(模拟)样品中未观察到可检测的荧光标记(图3a)。通过抗cd46抗体染色(图3a至图3b；pe抗人cd46)检测到cd46的高表达，并且分别通过cd86和cd137l的特异性染色未检测到cd86(图3e；太平洋蓝(pacificblue)抗人cd86)或cd137l(图3d；pe抗人4-1bb配体(cd137l))的表达。[0023]图3f至图3k描绘了对cd46的hatse-293细胞系(两种细胞系上的预期组成性表达)以及cd86/cd137l表达(预期的cd86+/cd137l+表达)的分析。图3f和图3g展示了未染色(模拟)样品中没有可检测的荧光标记。图3h和图3i展示了通过抗cd46抗体染色检测到的cd46(pe抗人cd46)的一致高表达。图3j和图3k展示了分别使用抗cd86(图3j)和抗cd137l(图3k)抗体检测到表达低量和高量的cd86或cd137l的两个群体。[0024]图4描绘了由对照慢病毒颗粒或由以下定义和实施例中所述的hatse细胞系产生的慢病毒颗粒所转导的t细胞的生长曲线。作为阳性对照，在刺激珠的存在下用对照慢病毒颗粒转导t细胞。“转导后天数”是指细胞暴露于颗粒(第0天)后经过的天数。[0025]图5描绘了暴露于以下各物的细胞的荧光显微照片：293t对照颗粒[293t无刺激]；293t对照颗粒和刺激珠[293t刺激]；1x分选的hatse颗粒[1x分选的hatse(无刺激)]；或2x分选的hatse颗粒[2x分选的hatse(无刺激)]。[0026]图6描绘了vivo-til104lngfr(seqidno：6)的载体图。[0027]图7描绘了vivo-til105tcp1(seqidno：7)的载体图。[0028]图8描绘了vivo-til106tcp2(seqidno：8)的载体图。[0029]图9描绘了vivo-til107tcp3(seqidno：9)的载体图。[0030]图10描绘了vivo-til108tcp4(seqidno：10)的载体图。[0031]图11描绘了vivo-til109hperfp(seqidno：11)的载体图。[0032]图12a至图12f示出了示例性小分子可控的t细胞/nk细胞活化受体(称为raccr)的结果。图12a示出了所例示的raccr分子的设计。图12a示出了用表达gfp的对照慢病毒颗粒转导的细胞。图12b示出了用表达mcherry的表面工程改造的颗粒转导的细胞。图12c示出了用表达raccr的表面工程改造的颗粒转导的细胞。[0033]图12e示出了在il-2或雷帕霉素存在下，用各种表面工程改造的慢病毒颗粒(se-lvp)，包括表达raccr的se-lvp转导的t细胞的t细胞扩增图。[0034]图12f示出了证实由raccr驱动的t细胞扩增可用雷帕霉素控制的数据。具体实施方式[0035]本发明人已意识到，作为act的替代方案，在体内转导til或其他免疫细胞可增强细胞在体内而非离体的扩增。此外，本发明人已意识到，在体内转导til或其他免疫细胞允许治疗癌症或其他疾病病状，而没有免疫细胞离体扩增的缺点。[0036]因此，本公开提供了在体内扩增til或其他免疫细胞群体的手段。具体地，本公开提供了能够在体内选择性地扩增til或其他免疫细胞的期望群体的治疗剂。本公开提供了病毒载体以及用于在体内扩增til或其他免疫细胞以治疗疾病病状的相关方法。[0037]本公开部分地基于以下发现：设计来表达t细胞/nk细胞活化受体(以及任选的其他效应蛋白)的慢病毒载体和包装细胞系对于t细胞的体内扩增是有用的。本公开的慢病毒载体和包装细胞系可适于肿瘤浸润淋巴细胞在体内的转导和药物介导的扩增，诸如当使用包装细胞系将慢病毒载体包装成慢病毒颗粒并将所产生的慢病毒颗粒递送至受试者的体内，诸如递送至患有实体肿瘤的患者时。所公开的慢病毒载体和颗粒可通过自体或同种异体t细胞或其他免疫细胞的体外转导用于act。在一些情况下，所公开的慢病毒载体和颗粒被配置为在体内使用。瘤内注射慢病毒颗粒导致肿瘤浸润淋巴细胞在体内扩增，因为慢病毒载体被配置为提供能够向体外或体内转导的靶细胞提供有丝分裂信号的t细胞/nk细胞活化受体的表达。[0038]1.1核酸载体[0039]如本文所用，术语“核酸载体”旨在表示携带、容纳或表达目标核酸的任何核酸。核酸载体可具有诸如表达、包装、假型化或转导的特有功能。如果核酸载体适合用作克隆载体或穿梭载体，则其还可具有操纵功能。载体的结构可包括制作可行且适合于特定用途的任何期望的形式。此类形式包括例如环状形式诸如质粒和噬菌粒，以及线性或分支形式。核酸载体可由例如dna或rna构成，以及含有部分或全部核苷酸衍生物、类似物和模拟物。此类核酸载体可从自然来源获得、重组产生或以化学方式合成。[0040]本公开的载体系统的非限制性实例包括逆转录病毒、慢性病、泡沫病毒和睡美人(sleepingbeauty)转座子。[0041]1.1.1慢病毒载体[0042]慢病毒是复杂的逆转录病毒，除了常见的逆转录病毒基因gag、pol和env外，其还含有其他具有调控或结构功能的基因。较高的复杂性使得病毒能够调节其生命周期，就像在潜伏感染过程中一样。慢病毒的一些实例包括人免疫缺陷病毒(hiv-1和hiv-2)和猿猴免疫缺陷病毒(siv)。慢病毒载体已通过对hiv毒力基因的多次减毒而产生，例如，基因env、vif、vpr、vpu和nef被删除，使得载体具有生物安全性。[0043]慢病毒载体为基因疗法提供了巨大的优势。除非工程改造成非整合型，否则慢病毒载体稳定地整合到靶细胞的染色体中，从而允许长期表达递送的转基因。此外，它们不转移病毒基因，因此避免了产生可被细胞毒性t细胞破坏的转导细胞的问题。此外，它们具有相对较大的克隆能力，足以满足大多数预期的临床应用。另外，与其他逆转录病毒相比，慢病毒能够转导非分裂细胞。这在诸如造血系统、脑、肝、肺和肌肉的组织的基因疗法中非常重要。例如，来源于hiv-1的载体允许高效的体内和离体递送、整合和稳定表达转基因到诸如神经元、肝细胞和心肌细胞的细胞中(blomer等人，1997；kafri等人，1997；naldini等人，1996；naldini等人，1998)。[0044]慢病毒载体是本领域中已知的，参见naldini等人(1996)science272：263-7；zufferey等人(1998)j.virol.72：9873-9880；dull等人(1998)j.virol.72：8463-8471；美国专利号6,013,516；和美国专利号5,994,136，其各自以引用的方式整体并入本文。一般来讲，这些载体被配置成携带用于选择含有载体的细胞、用于将外来核酸并入慢病毒颗粒中以及用于将核酸转移到靶细胞中的基本序列。[0045]常用的慢病毒载体系统是所谓的第三代系统。第三代慢病毒载体系统包括四种质粒。“转移质粒”编码由慢病毒载体系统递送到靶细胞中的多核苷酸序列。转移质粒通常具有一个或多个侧接有长末端重复(ltr)序列的目标转基因序列，这有助于将转移质粒序列整合到宿主基因组中。出于安全原因，转移质粒通常被设计成使所产生的载体复制不起作用。例如，转移质粒缺乏在宿主细胞中产生感染颗粒所必需的基因元件。此外，可将转移质粒设计成缺失3’ltr，从而使病毒“自身失活”(sin)。参见dull等人(1998)j.virol.72：8463-71；miyoshi等人(1998)j.virol.72：8150-57。[0046]第三代系统通常还包括两个“包装质粒”和一个“包膜质粒”。“包膜质粒”通常编码可操作地连接到启动子的env基因。在示例性第三代系统中，env基因为vsv-g，且启动子为cmv启动子。第三代系统使用两个包装质粒，一个编码gag和pol，而另一个编码rev作为进一步的安全特征，这是对所谓的第二代系统的单个包装质粒的改进。虽然更安全，但第三代系统使用起来可能更麻烦，并且由于添加另外的质粒而导致病毒滴度降低。示例性包装质粒包括但不限于pmd2.g、prsv-rev、pmdlg-prre和prrl-goi。[0047]慢病毒载体系统依赖于使用“包装细胞系”。一般来讲，包装细胞系是在将转移质粒、一个或多个包装质粒和包膜质粒导入细胞时，其细胞能够产生传染性慢病毒颗粒的细胞系。可使用将质粒导入细胞中的各种方法，包括转染或电穿孔。在一些情况下，包装细胞系适于将慢病毒载体系统高效包装成慢病毒颗粒。[0048]如本文所用，术语“慢病毒载体”旨在表示编码基因组包装所需的慢病毒顺式核酸序列的核酸。慢病毒载体还可编码有益于基因递送的其他顺式核酸序列，包括例如，逆转录、前病毒整合或基因组转录所需的顺式序列。慢病毒载体执行慢病毒载体的转导功能。因此，载体基因组的确切组成将取决于希望导入靶细胞中的遗传物质。因此，载体基因组可编码，例如，除了包装、逆转录、整合或转录所需以外的另外的多肽或功能。此类功能通常包括编码表达目标核酸所需的顺式元件。慢病毒顺式序列或元件可来源于慢病毒基因组或其他病毒或载体基因组，只要慢病毒载体基因组可通过包装细胞系包装成慢病毒颗粒并导入靶细胞中即可。[0049]慢病毒载体的非限制性实例包括seqidno：6-11，它们在图6至图11中示出。[0050]所产生的慢病毒颗粒通常包括rna基因组(来源于转移质粒)、包埋env蛋白的脂质双层包膜以及其他辅助蛋白，包括整合酶、蛋白酶和基质蛋白(参见图1b)。如本文所用，术语“慢病毒颗粒”旨在表示包括包膜、具有慢病毒的一种或多种特征并且能够侵入靶宿主细胞的病毒颗粒。此类特征包括，例如，感染非分裂宿主细胞；转导非分裂宿主细胞；感染或转导宿主免疫细胞；含有包括gag结构多肽p7、p24和p17中的一个或多个的慢病毒病毒体；含有包括env编码的糖蛋白p41、p120和p160中的一个或多个的慢病毒包膜；含有包括作用于复制、前病毒整合或转录的一个或多个慢病毒顺式作用序列的基因组；含有编码慢病毒蛋白酶、逆转录酶或整合酶的基因组；或含有编码调控活性的基因组，诸如tat或rev。转移质粒可包含cppt序列，如描述于美国专利号8,093,042中。[0051]系统的效率是载体工程改造中的重要问题。可以本领域已知的各种方式来评估慢病毒载体系统的效率，这些方式包括诸如通过定量聚合酶链反应(qpcr)来测量载体拷贝数(vcn)或载体基因组(vg)，或以感染单位/毫升(iu/ml)为单位的病毒滴度。例如，可使用对培养的肿瘤细胞系ht1080执行的功能性测定来评估滴度，如描述于humbert等人developmentofthird-generationcocalenvelopeproducercelllinesforrobustlentiviralgenetransferintohematopoieticstemcellsandt-cells.moleculartherapy24：1237-1246(2016)中。当在持续分裂的培养细胞系上评估滴度时，不需要刺激，且因此测得的滴度不受慢病毒颗粒表面工程改造的影响。用于评估慢病毒载体系统的效率的其他方法提供于gaererts等人comparisonoflentiviralvectortitrationmethods.bmcbiotechnol.6：34(2006)中。[0052]众所周知，慢病毒载体系统具有有限的效率，并且试图改变慢病毒载体系统常常将导致效率下降。本发明人惊奇地发现，慢病毒载体系统(例如，第三代系统)的包膜质粒可被修饰来除了融合糖蛋白或其功能变体之外还编码多个多肽。[0053]在一些情况下，本公开的载体和包装细胞系能够以至少约1x106iu/ml、至少约2x106iu/ml、至少约3x106iu/ml、至少约4x106iu/ml、至少约5x106iu/ml、至少约6x106iu/ml、至少约7x106iu/ml、至少约8x106iu/ml、至少约9x106iu/ml、或至少约1x107iu/ml的滴度产生表面工程改造的慢病毒颗粒。在一些情况下，本公开的多顺反子载体能够以至少约1x107iu/ml、至少约2x107iu/ml、至少约3x107iu/ml、至少约4x107iu/ml、至少约5x107iu/ml、至少约6x107iu/ml、至少约7x107iu/ml、至少约8x107iu/ml、至少约9x107iu/ml、或至少约1x108iu/ml的滴度产生表面工程改造的慢病毒颗粒。[0054]1.2t细胞/nk细胞活化受体[0055]本公开设想了编码t细胞/nk细胞活化受体的核酸载体、慢病毒载体和aav载体。如本文所用，术语“t细胞/nk细胞活化受体”是指一种或多种跨膜蛋白，所述一种或多种跨膜蛋白被配置成在转导细胞的细胞表面上表达，使得t细胞/nk细胞活化受体向转导细胞提供有丝分裂信号。使用t细胞/nk细胞活化受体是因为在大多数情况下，靶细胞为t细胞或nk细胞。通过使用在另一种细胞类型中保持活性的活化受体，本发明方法可适于与其他细胞类型一起使用。此处有用的t细胞/nk细胞活化受体可包括信号传导结构域，即细胞因子受体信号传导结构域、共刺激受体信号传导结构域、t细胞受体亚基信号传导结构域、nk细胞受体亚基信号传导结构域、生长因子受体信号传导结构域等。[0056]1.2.1t细胞/nk细胞活化受体的非限制性实例[0057]所使用的信号传导结构域可为常见的细胞因子受体γ链的信号传导结构域，也可为常见的细胞因子受体β链的信号传导结构域。信号传导结构域可包括能够在酪氨酸磷酸化时结合sh2结构域的itam或酪氨酸。在一些情况下，信号传导可通过活化受体的同源或异源二聚化触发。在一些情况下，活化受体的胞内结构域上的一个或多个酪氨酸残基的磷酸化可导致与sh2结构域的二聚化，从而启动有丝分裂信号级联。在一些情况下，本公开的信号传导结构域可能能够在酪氨酸残基上磷酸化，并且之后与另一分子上的sh2结构域结合。[0058]在一些情况下，t细胞/nk细胞活化受体是天然存在的活化受体。可替代地，从不同活化受体提取的一个或多个基因元件的复合物是本领域中已知的。在本发明中有用的工程改造的t细胞/nk细胞活化受体的实例包括但不限于组成活性il2受体或il7受体，如描述于hunter等人chimericγccytokinereceptorsconfercytokineindependentengraftmentofhumantlymphocytes.molimmunol.2013年11月；56(1-2)：1-11.；shum等人constitutivesignalingfromanengineeredil7receptorpromotesdurabletumoreliminationbytumor-redirectedtcells.cancerdiscov.2017年11月；7(11)：1238-1247中。[0059]1.2.2小分子可控的t细胞/nk细胞活化受体[0060]在一些情况下，提供一种控制身体内转导细胞的扩增的手段可为有利的。在一些情况下，这可作为防止细胞过度扩增的安全保护。在其他情况下，可控制转导细胞的扩增以用于治疗目的。因此，本公开提供了可通过使用小分子控制的t细胞/nk细胞活化受体。当慢病毒载体编码此种可控的t细胞/nk细胞活化受体时，施用小分子将允许活化受体的激活以lb、itgax、cd1lc、itgb1、cd29、itgb2、cd18、lfa-1、itgb7、nkg2d、tnfr2、trance/rankl、dnam1(cd226)、slamf4(cd244、2b4)、cd84、cd96(tactile)、ceacam1、crtam、ly9(cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、cd69、slamf6(ntb-a、ly108)、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、blame(slamf8)、selplg(cd162)、ltbr、lat、gads、slp-76、pag/cbp、cd19a，与cd83、cd27、cd28、icos、4-1bb、cd40、rank/trance-r、ox40、tgfbr1、tgfbrii、myd88、cd40和任何其他tnf受体超家族成员特异性结合的配体，及他们的组合。[0064]目标蛋白质的“同源物”，诸如fkbp或frb，包括包含氨基酸序列或由其组成的蛋白质，所述氨基酸序列与蛋白质的氨基酸序列具有至少约70％、80％、90％、95％、98％或99％的同一性。同源物还可以是由与核苷酸序列具有至少约70％、80％、90％、95％、98％或99％同一性的核酸编码的蛋白质。[0065]目标蛋白质的“功能同源物”是指具有蛋白质的至少一种生物学活性的蛋白质同源物。例如，fkpb的功能同源物是指在雷帕霉素(或相关拉帕洛)存在下与frb异源二聚化或在诸如ap1903的分子存在下同源二聚化的fkbp同源物；frb的功能同源物是指在雷帕霉素(或相关拉帕洛)存在下与fkbp异源二聚化的frb同源物。[0066]在一些实施方案中，t细胞/nk细胞活化受体包含(a)第一链，所述第一链包含以下中的一者或两者：(i)与seqidno：13共享至少95％、99％或100％序列同一性的功能性fkpb结构域，和(ii)与seqidno：14共享至少95％、99％或100％序列同一性的功能性il2rb结构域；和/或(b)第二链，所述第二链包含以下中的一者或两者：(i)与seqidno：16共享至少95％、99％或100％序列同一性的功能性frb结构域，和(ii)与seqidno：17共享至少95％、99％或100％序列同一性的功能性il2rg结构域。[0067]在一些实施方案中，t细胞/nk细胞活化受体包含(a)第一链，所述第一链包含功能性fkpb结构域和功能性il2rb结构域，其中第一链与seqidno：12共享至少95％、99％或100％序列同一性；和/或(b)第二链，所述第二链包含功能性frb结构域和功能性il2rg结构域，其中第二链与seqidno：15共享至少95％、99％或100％序列同一性。[0068]1.2.3嵌合抗原受体[0069]在一些情况下，提供一种将转导的细胞靶向特定细胞或组织的手段可为有利的。在一些情况下，慢病毒载体包含(代替或除了其他基因之外)编码嵌合抗原受体(car)的多核苷酸。可采用本领域中已知的各种car。可替代地，可使用t细胞受体(tcr)融合物。当载体编码car时，car可包含选自以下结构域或片段中的一个或多个结构域：cd28、ox-40、4-1bb/cd137、cd2、cd7、cd27、cd30、cd40、程序性死亡-1(pd-1)、诱导性t细胞共刺激分子(icos)、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1、cd1-1a/cd18)、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd3ζ、cd247、cd276(b7-h3)、light、(tnfsf14)、nkg2c、igα(cd79a)、dap-10、fcγ受体、mhc1类分子、tnf受体蛋白、免疫球蛋白、细胞因子受体、整合素、信号传导淋巴细胞活化分子(slam蛋白)、活化nk细胞受体、btla、toll配体受体、icam-1、b7-h3、cds、icam-1、gitr、baffr、light、hvem(lightr)、kirds2、slamf7、nkp80(klrf1)、nkp44、nkp30、nkp46、cd19、cd4、cd8α、cd8β、il-2rβ、il-2rγ、il-7rα、il-21rα、itga4、vla1、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cd1ld、itgae、cd103、itgal、cd1la、lfa-1、itgam、cd1lb、itgax、cd1lc、itgb1、cd29、itgb2、cd18、lfa-1、itgb7、nkg2d、tnfr2、trance/rankl、dnam1(cd226)、slamf4(cd244、2b4)、cd84、cd96(tactile)、ceacam1、crtam、ly9(cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、cd69、slamf6(ntb-a、ly108)、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、blame(slamf8)、selplg(cd162)、ltbr、lat、gads、slp-76、pag/cbp、cd19a，与cd83、cd27、cd28、icos、4-1bb、cd40、rank/trance-r、ox40、tgfbr1、tgfbrii、myd88、尚未列出的其他tnf受体超家族成员特异性结合的配体，及他们的组合。[0070]1.2.4小分子可控的嵌合抗原受体[0071]在一些情况下，提供一种控制靶向转导细胞的手段可为有利的。在一些情况下，这可作为防止细胞活性过度的安全保护。在其他情况下，可控制转导细胞的活性以用于治疗目的。因此，本公开提供了car或类似的靶向受体，例如tcr融合物，所述tcr融合物可通过使用小分子来控制。当慢病毒载体编码此种可控靶向受体时，施用小分子将允许激活靶向受体以将转导细胞靶向靶细胞，而停止施用小分子将阻止受体将转导细胞靶向靶细胞。以此方式，通过向受试者施用慢病毒颗粒而产生的体内til将仅在小分子存在于受试者中时活化。小分子可全身地或局部地提供，并在与施用慢病毒颗粒的同时或之后的期间内提供。可通过血样、活检或医学成像监测til的活性，并且如果观察到活性过度，则撤回小分子。在一些情况下，小分子的脉冲或间歇施用可用于优化治疗方案。在一些情况下，小分子将被滴定以调节til活性。在一些情况下，响应于肿瘤的缓解或复发或出于其他治疗原因，小分子可被撤回或施用。[0072]在一些情况下，靶向受体(例如car)可被配置成通过融合到蛋白质亚基中来由小分子控制，所述蛋白质亚基在小分子存着的情况下诱导二聚化，或在小分子不存在的情况下诱导二聚化，并且在去除、降解或稀释小分子时回到单体状态。设想在异源二聚靶向受体的情况下，可对t细胞/nk细胞活化受体进行修饰，使得靶向受体的一个单元的胞外结构域包含诱导二聚化的蛋白质亚基的一个单体，并且靶向受体的另一个单元的胞外结构域包含诱导二聚化的蛋白质亚基的其他单体。异源二聚靶向受体可以使用诱导二聚化的同源二聚蛋白质亚基或诱导二聚化的异源二聚蛋白质亚基的这种方式来修饰。在其他情况下，同源二聚靶向受体可以使用诱导二聚化的同源二聚蛋白质亚基或诱导二聚化的异源二聚蛋白质亚基的这种方式来修饰。如果小分子可控靶向受体是同源二聚体，则其可由单个转基因编码；如果是异源二聚体，则其可由两个转基因编码。[0073]诱导二聚化的蛋白质亚基的实例包括但不限于fk506结合蛋白(fkbp)和fkbp12-雷帕霉素结合(frb)结构域。fk506结合蛋白在他克莫司(fk506)存在下二聚化。fkbp12-雷帕霉素结合(frb)结构域在雷帕霉素存在下二聚化。因此，根据本公开的小分子可为他克莫司、雷帕霉素或拉帕洛(雷帕霉素类似物)。可控制小分子可控受体的小分子的其他实例包括但不限于雷帕霉素、拉帕洛、香豆霉素、赤霉素、脱落酸(aba)、甲氨蝶呤、环孢霉素a、fkcsa、甲氧苄啶(tmp)-fkbp的合成配体(slf)或其任何衍生物。适于作为本公开的受体中的融合蛋白的示例性结构域对包括但不限于选自以下的对：fkbp和frb、fkbp和钙调磷酸酶、fkbp和亲环蛋白、fkbp和细菌dhfr、钙调磷酸酶和亲环蛋白、pyl1和abi1、或gib1和gai、或其变体。[0074]在一些情况下，小分子可控靶向受体包含胞外结构域，所述胞外结构域包含一个或多个小分子结合结构域。小分子与一个或多个胞外结构域的结合导致受体分子的分子内相互作用(例如，同源二聚化或异源二聚化)，从而激活与靶细胞的结合和/或来自一个或多个胞内结构域的下游信号。小分子可控受体的一个或多个胞内结构域可包含选自以下结构域或片段中的一个或多个结构域：cd28、ox-40、4-1bb/cd137、cd2、cd7、cd27、cd30、cd40、程序性死亡-1(pd-1)、诱导性t细胞共刺激因子(icos)、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1、cd1-1a/cd18)、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd3ζ、cd247、cd276(b7-h3)、light、(tnfsf14)、nkg2c、igα(cd79a)、dap-10、fcγ受体、mhc1类分子、tnf受体蛋白、免疫球蛋白、细胞因子受体、整合素、信号传导淋巴细胞活化分子(slam蛋白)、活化nk细胞受体、btla、toll配体受体、icam-1、b7-h3、cds、icam-1、gitr、baffr、light、hvem(lightr)、kirds2、slamf7、nkp80(klrf1)、nkp44、nkp30、nkp46、cd19、cd4、cd8α、cd8β、il-2rβ、il-2rγ、il-7rα、il-21rα、itga4、vla1、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cd1ld、itgae、cd103、itgal、cd1la、lfa-1、itgam、cd1lb、itgax、cd1lc、itgb1、cd29、itgb2、cd18、lfa-1、itgb7、nkg2d、tnfr2、trance/rankl、dnam1(cd226)、slamf4(cd244、2b4)、cd84、cd96(tactile)、ceacam1、crtam、ly9(cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、cd69、slamf6(ntb-a、ly108)、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、blame(slamf8)、selplg(cd162)、ltbr、lat、gads、slp-76、pag/cbp、cd19a，与cd83、cd27、cd28、icos、4-1bb、cd40、rank/trance-r、ox40、tgfbr1、tgfbrii、myd88、cd40和任何其他tnf受体超家族成员特异性结合的配体，及他们的组合。其他示例性可控car是由美国专利号10,196,444提供，该专利通过引用的方式并入本文。[0075]在一些实施方案中，诱导二聚化的两个蛋白质亚基各自分别融合到包含一个或多个信号传导结构域的跨膜蛋白和结合剂(例如单链可变片段，scfv)。结合剂能够特异性结合到目标靶上。小分子诱导的二聚化重构了二聚单元，所述二聚单元经由跨膜蛋白的跨膜区从结合剂穿过二聚化蛋白质亚基到达一个或多个胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，采用两种跨膜蛋白，并且其响应于一个或两个小分子而彼此诱导二聚化并诱导二聚化为结合剂融合蛋白。在一些实施方案中，小分子可控car包含两种或更多种结合剂融合蛋白，其各自单独二聚化为包含一个或多个信号传导结构域的跨膜蛋白。[0076]1.4启动子和基因控制元件[0077]本公开还设想了慢病毒载体，所述慢病毒载体包含对t细胞、nk细胞、或t细胞和nk细胞有特异性的启动子和/或增强子。本公开提供了t细胞和/或nk细胞特异性启动子的核酸序列(seqidno：1-4)。这些核酸序列通常可通过将启动子序列插入由慢病毒载体编码的基因的5′处来可操作地连接到t细胞/nk细胞活化受体。所用的启动子可与seqidno：1-4中列出的序列相同，或与seqidno：1-4中列出的序列80％、85％、90％、95％或99％相同，只要启动子在t细胞和/或nk细胞中保持启动子活性即可。[0078]在一些情况下，其他启动子可用于控制t细胞/nk细胞活化受体的表达。本公开中有用的启动子的实例包括但不限于mnd启动子、t细胞特异性启动子、cd4t细胞特异性启动子、cd8t细胞特异性启动子、nk细胞特异性启动子、t细胞和nk细胞特异性启动子、cd4t细胞和nk细胞特异性启动子、以及cd8t细胞和nk细胞特异性启动子。[0079]在一些情况下，使用“强”启动子。应当理解，启动子的强度部分取决于该启动子在细胞中操作的该细胞的属性。在一些情况下，本公开的强启动子导致其在靶细胞(诸如til)中可操作地连接到的基因元件的高水平表达。强启动子包括但不限于巨细胞病毒(cmv)和鼠干细胞病毒(mscv)、磷酸甘油酸激酶(pgk)、由cmv增强子和部分鸡β肌动蛋白启动子和兔β珠蛋白基因(cag)构成的启动子序列、由部分sv40启动子和cd43启动子(sv40/cd43)构成的启动子序列、以及含有具有骨髓增生性肉瘤病毒增强子(mnd)的修饰的momulvltr的u3区的合成启动子。本公开的组合物和方法中有用的示例性强启动子由jones等人lentiviralvectordesignforoptimaltcellreceptorgeneexpressioninthetransductionofperipheralbloodlymphocytesandtumor-infiltratinglymphocytes.humgenether.2009年6月；20(6)：630-40提供。[0080]在一些情况下，强启动子可为合成的强启动子。示例性合成的强启动子由schlabach等人(2010)procnatlacadsciusa.10：2538-2543提供。在一些情况下，使用其他启动子。在一些情况下，使用在包装细胞系中有活性的任何启动子。在一些情况下，使用诱导型启动子，例如药物诱导型启动子。[0081]在一些情况下，本公开的载体可包含土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(wpre)或与wpre大体相同的核酸序列。参见，美国专利号6,136,597；lee等人(2005)expphysiol.90：33-7。具有减小尺寸的wpre元件的变体是本领域中已知的。wpre-o是指具有中等尺寸的wpre的变体。[0082]在一些情况下，本公开的慢病毒载体可包含编码2a肽的核苷酸序列。术语“2a肽”是指被配置成从单个开放阅读框生成两种或更多种蛋白质的自裂解肽。2a肽是在真核细胞中介导翻译期间多肽的“裂解”的18至22个残基长的病毒寡肽。“2a肽”可指代具有不同氨基酸序列的肽。在本公开中，应当理解，在慢病毒载体包含两个或更多个2a肽的情况下，2a肽可彼此相同或不同。用于设计和使用2a肽的详细方法由szymczak-workman等人(2012)coldspringharb.protoc.2012：199-204提供。在文献中，2a肽经常被称为自裂解肽，但机制研究表明，所观察到的“自裂解”实际上是核糖体跳过了在2a肽c端处形成甘氨酰脯氨酰肽键的结果。donnelly等人(2001)jgenvirol.82：1027-41。[0083]在一些情况下，本公开的慢病毒载体可包含土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(wpre)或与wpre大体相同的核酸序列。参见lee等人optimizingregulatablegeneexpressionusingadenoviralvectors.expphysiol.90(1)：33-7(2005)。在本公开的病毒载体中，wpre序列增加由所述病毒载体递送的基因的表达。[0084]1.5融合糖蛋白[0085]各种融合糖蛋白可用于假型化慢病毒载体。虽然最常用的实例是来自水泡性口炎病毒(vsvg)的包膜糖蛋白，但许多其他病毒蛋白也用于慢病毒载体的假型化。参见joglekar等人(2017)humangenetherapymethods28：291-301。本公开设想了各种融合糖蛋白的取代。值得注意的是，一些融合糖蛋白导致载体效率更高。[0086]在一些实施方案中，对融合糖蛋白或其功能变体进行假型化有助于靶向转导特定的细胞类型，包括但不限于t细胞或nk细胞。在一些实施方案中，融合糖蛋白或其功能变体是以下的一个或多个全长多肽、一个或多个功能片段、一个或多个同源物、或一个或多个功能变体：人免疫缺陷病毒(hiv)gp160、鼠白血病病毒(mlv)gp70、长臂猿白血病病毒(galv)gp70、猫白血病病毒(rd114)gp70、双嗜性逆转录病毒(ampho)gp70、10a1mlv(10a1)gp70、亲嗜性逆转录病毒(eco)gp70、狒狒猿白血病病毒(baev)gp70、麻疹病毒(mv)h和f、尼帕病毒(niv)h和f、狂犬病病毒(rabv)g、莫科拉病毒(mokv)g、埃博拉扎伊尔型病毒(eboz)g、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(lcmv)gp1和gp2、杆状病毒gp64、基孔肯雅病毒(chikv)e1和e2、罗斯河病毒(rrv)e1和e2、塞姆利基森林病毒(sfv)e1和e2、辛德毕斯病毒(sv)e1和e2、委内瑞拉马脑炎病毒(veev)e1和e2、西方马脑炎病毒(weev)e1和e2、甲型、乙型、丙型或丁型流感病毒ha、禽瘟疫病毒(fpv)ha、水泡性口炎病毒vsv-g、或金迪普拉病毒和皮里病毒cnv-g和prv-g。在一些情况下，融合糖蛋白或其功能变体是以下的g蛋白的全长多肽、功能片段、同源物或功能变体：阿拉戈斯水泡性口炎病毒(vsav)、卡拉加斯水泡性病毒(cjsv)、金迪普拉水泡性病毒(chpv)、可卡耳水泡性病毒(cocv)、印第安纳水泡性口炎病毒(vsiv)、伊斯法罕水泡性病毒(isfv)、马拉巴水泡性病毒(marav)、新泽西水泡性口炎病毒(vsnjv)、下刚果热病毒(basv)。在一些实施方案中，融合糖蛋白或其功能变体是可卡耳病毒g蛋白。[0087]1.6检查点抑制配体[0088]在一些情况下，本公开的慢病毒载体还包含编码检查点抑制配体的核酸序列。任选地，检查点抑制配体能够阻断pd-1/pd-l1检查点。任选地，检查点抑制配体能够阻断tim-3检查点。[0089]检查点抑制剂疗法是一种癌症治疗形式，其使用剂来刺激或抑制免疫检查点，从而调节免疫反应。肿瘤可使用检查点来保护自身免受受试者免疫系统或癌症免疫疗法中使用的治疗剂的影响。本公开提供了一种慢病毒载体，所述慢病毒载体包含编码检查点抑制配体的核酸序列，其中由慢病毒载体产生的慢病毒颗粒在其表面上展示检查点抑制配体，且因此，施用慢病毒颗粒导致检查点抑制配体递送到受试者的治疗使用部位处。本公开还提供了慢病毒载体，所述慢病毒载体包含编码检查点抑制配体的核酸序列，其中施用由慢病毒载体产生的慢病毒颗粒将多核苷酸序列递送到靶细胞，然后所述多核苷酸序列在治疗使用的部位处表达检查点抑制配体。[0090]本公开提供的检查点抑制剂配体的实例包括但不限于抗ctla-4抗体、抗pd-1抗体和抗pd-l1抗体或分别与ctla4、pd-1或pd-l1相互作用的任何非抗体配体(例如纳米体、darpin)。在一些情况下，检查点抑制配体能够阻断pd-1/pd-l1检查点和/或tim-3检查点和/或ctla-4检查点。检查点抑制的使用于例如，anderson等人tim-3：anemergingtargetinthecancerimmunotherapylandscape.cancerimmunolres.2014年5月；2(5)：393-8中综述。[0091]1.5对免疫抑制药物的耐药性[0092]在一些情况下，本公开的慢病毒载体还包含提供对免疫抑制药物的耐药性的核酸序列(例如，在转移质粒上)。在一些情况下，当在用于治疗受试者的任何方法或用于扩增能够识别和杀死由本公开提供的有此需要的受试者中肿瘤细胞的t细胞的任何方法期间向患者施用免疫抑制药物时，提供对免疫抑制药物的耐药性的核酸序列将促进靶细胞的选择性扩增。在一些情况下，免疫抑制药物是甲氨蝶呤、雷帕霉素、拉帕洛、他克莫司、环孢霉素或其任何组合。免疫抑制药物可与小分子相同或不同，即慢病毒载体可被设计成使得由免疫抑制药物诱导小分子可控的t细胞/nk细胞活化受体，使得每当向受试者施用免疫抑制药物时，都触发转导细胞的扩增。可替代地，设计慢病毒载体以允许在不受免疫抑制的情况下控制转导细胞的扩增可为有利的。[0093]在一些情况下，慢病毒载体有助于通过赋予转导细胞对免疫抑制药物的耐药性来选择性扩增靶细胞，有助于选择性扩增靶细胞。本公开提供了慢病毒载体，所述慢病毒载体包含赋予对本领域已知的免疫抑制药物的耐药性的任何核酸序列。免疫抑制药物的实例包括但不限于雷帕霉素或其衍生物、拉帕洛或其衍生物、他克莫司或其衍生物、环孢霉素或其衍生物、甲氨蝶呤或其衍生物、和霉酚酸酯(mmf)或其衍生物。各种耐药性基因是本领域中已知的。对雷帕霉素的耐药性可由编码蛋白结构域frb的多核苷酸序列赋予，见于mtor结构域中并且已知是fkbp-雷帕霉素复合物的靶标。对他克莫司的耐药性可由编码钙调磷酸酶突变体cna22或钙调磷酸酶突变体cnb30的多核苷酸序列赋予。对环孢霉素的耐药性可由编码钙调磷酸酶突变体cna12或钙调磷酸酶突变体cnb30的多核苷酸序列赋予。这些钙调磷酸酶突变体描述于brewin等人(2009)blood114：4792-803中。对甲氨蝶呤的耐药性可由二氢叶酸还原酶(dhfr)的多种突变体形式提供，参见volpato等人(2011)jmolrecognition24：188-198，并且对mmf的耐药性可由肌苷一磷酸脱氢酶(impdh)的多种突变体形式提供，参见yam等人(2006)molther14：236-244。[0094]通常在act之前、期间和/或之后使用免疫抑制药物。在一些情况下，使用免疫抑制药物可改善治疗效果。在一些情况下，使用免疫抑制药物可减少治疗的副作用，诸如但不限于急性移植物抗宿主病、慢性移植物抗宿主病以及移植后淋巴增生性疾病。本公开设想了将免疫抑制药物与治疗或预防本公开的疾病或病状的任何方法一起使用，所述方法包括但不限于本公开的方法，其中慢病毒载体赋予转导细胞对免疫抑制药物的耐药性。[0095]2.1包装细胞系[0096]在另一方面，本公开提供了用于产生能够激活并有效转导t细胞的慢病毒颗粒的包装细胞系，所述包装细胞系包含能够包装慢病毒载体的培养细胞，其中所培养的细胞被基因工程改造以表达t细胞活化或共刺激分子，或被诱导以经由瞬时转染瞬时表达t细胞活化或共刺激分子。本公开的包装细胞系可与任何慢病毒载体一起使用，包括但不限于先前描述的那些。在一些情况下，使用具有包含编码t细胞/nk细胞活化受体的核酸序列的慢病毒载体的包装细胞系将是有利的。在一些情况下，t细胞/nk细胞活化受体能够被小分子激活将是有利的。但是，所公开的包装细胞系也可与其他慢病毒载体一起使用。[0097]在一些情况下，包装细胞系是hek-293t细胞系。类似的结果可在其他细胞系中实现，包括但不限于被设计成缺乏b2m或其他免疫活性表面蛋白的hek-293t细胞系。可使用可在体外转染且能够产生高滴度慢病毒载体的其他细胞系-例如，包含可操作地连接到启动子上的多瘤病毒大t抗原基因序列的细胞系。[0098]在一些情况下，包装细胞系可经基因修饰以缺乏mhci类表达、mhcii类表达或抑制性检查点配体(诸如pd-l1(pd-1配体)或tim3配体)的表达。因为由包装细胞系表达抑制性配体可限制慢病毒颗粒对t细胞的活化，所以这些基因修饰在一些情况下起到消除此类抑制信号的作用，从而进一步促进慢病毒颗粒对t细胞的活化和转导。[0099]在一些情况下，包装细胞系经基因工程改造以包含适用于将慢病毒载体包装成慢病毒颗粒的一个或多个基因。在一些情况下，包装细胞系可包含编码基因gag-pol、env和rev的多核苷酸序列。在本发明的典型慢病毒载体中，一个或多个gag-pol和env蛋白编码区中的至少一部分可从慢病毒载体中移除并由包装细胞系提供。慢病毒载体可根据dull等人(1998)jvirol72：8463-71(其整体并入本文)中所提供的方法包装。示例性包装细胞系提供于retroviruses.coldspringharbourlaboratory(coffin等人，编)(1997)中。[0100]本公开还提供对包装细胞系进行基因工程改造，以便以其他方式改善本公开的慢病毒载体和颗粒的免疫属性，所述其他方式包括但不限于添加基因、删除基因及将点突变引入基因中。[0101]2.2t细胞活化或共刺激分子[0102]按照惯例，慢病毒体外转导需要另外的外源活化剂，诸如“刺激珠”，例如，dynabeadstm人t-活化因子cd3/cd28。使用本公开的包装细胞系制得的慢病毒颗粒将由包装细胞系表达的t细胞活化或共刺激分子的一个或多个拷贝并入到慢病毒颗粒中；并且将一个或多个t细胞活化或共刺激分子并入到慢病毒颗粒中将使慢病毒颗粒能够在没有外源性活化剂(即没有刺激珠或等效剂)的情况下激活并有效转导t细胞。这允许由这些包装细胞系制得的慢病毒颗粒可在外源性递送活化剂可能不切实际的情况下在体内使用。[0103]在一些情况下，t细胞活化或共刺激分子可选自由以下组成的组：抗cd3抗体、cd28配体(cd28l)和41bb配体(41bbl或cd137l)。各种t细胞活化或共刺激分子是本领域中已知的，并且包括但不限于特异性结合t细胞表达蛋白cd3、cd28、cd134(也称为ox40)或41bb(也称为4-1bb或cd137或tnfrsf9)的剂。例如，特异性结合cd3的剂可为抗cd3抗体(例如，okt3、cris-7或i2c)或抗cd3抗体的抗原结合片段。在一些方面中，特异性结合cd3的剂是抗cd3抗体的单链fv片段(scfv)。在一些情况下，本公开设想了t细胞活化或共刺激分子选自由以下组成的组：抗cd3抗体、cd28配体(cd28l)和41bb配体(41bbl或cd137l)。cd86(也称为b7-2)是cd28和ctla-4的配体。在某些情况下，cd28l可为cd86。cd80是cd28的另一个配体。在一些情况下，cd28的配体是cd80。在一些情况下，cd28的配体是融合至跨膜结构域以展示在慢病毒颗粒表面上的抗cd28抗体或抗cd28scfv。包含一个或多个t细胞活化或共刺激分子的慢病毒颗粒可通过wo2016/139463提供的方法制备。[0104]3慢病毒颗粒[0105]在另一方面，本公开还提供了慢病毒颗粒，所述慢病毒颗粒包含本公开的任意慢病毒载体。本公开的慢病毒颗粒可用本公开的包装细胞系或另一包装细胞系来制备，或通过培养细胞(例如hek-293t细胞)与慢病毒载体和辅助质粒的共转染来制备。本公开的慢病毒颗粒可通过例如将本公开的慢病毒载体转导到经基因工程改造以表达t细胞活化或共刺激分子的培养细胞中来制备。在一些情况下，由于慢病毒载体、所选择的包装细胞系或共转染的辅助质粒，慢病毒颗粒将包含t细胞活化或共刺激分子，所述分子可以是但不限于抗cd3抗体、cd28配体或41bb配体。经基因工程改造以表达t细胞活化或共刺激分子的培养细胞可为hek-293t细胞。在一些情况下，所培养的细胞经基因修饰以缺乏mhci类表达、mhcii类表达或抑制性检查点配体诸如pd-l1(pd-1配体)或tim3配体的表达。[0106]4使用方法[0107]在另一方面，本公开提供了用于治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用本公开的任何慢病毒颗粒，以及向受试者施用小分子，其中在受试者中治疗癌症。[0108]在一些实施方案中，本公开提供了一种用于疗法中的表面工程改造的慢病毒颗粒。在其他实施方案中，本公开提供了一种用于治疗癌症的方法中的表面工程改造的慢病毒颗粒。在其他实施方案中，本公开提供了一种用于制造治疗癌症的药剂的表面工程改造的慢病毒颗粒。[0109]在一些情况下，癌症是实体肿瘤，诸如黑色素瘤、非小细胞肺癌或乳腺癌。本公开的方法可包括治疗任何癌症，包括但不限于急性粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、腺癌、腺肉瘤、肾上腺癌、肾上腺皮质癌、肛门癌、间变性星形细胞瘤、血管肉瘤、阑尾癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、b细胞淋巴瘤、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨髓癌、肠癌、脑癌、脑干胶质瘤、脑瘤、乳腺癌、类癌瘤、宫颈癌、胆管癌、软骨肉瘤、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病、结肠癌、结直肠癌、颅咽管瘤、皮肤淋巴瘤、皮肤黑色素瘤、弥漫性星形细胞瘤、导管原位癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、上皮样肉瘤、食管癌、尤文式肉瘤(ewingsarcoma)、肝外胆管癌、眼癌、输卵管癌、纤维肉瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠道癌、胃肠道类癌、胃肠道间质瘤、普通生殖细胞瘤、妊娠滋养细胞疾病、多形性胶质母细胞瘤、胶质瘤、毛细胞白血病、头颈部癌、血管内皮瘤、霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、下咽癌、浸润性导管癌、浸润性小叶癌、炎性乳腺癌、肠癌、肝内胆管癌、侵袭性/浸润性乳腺癌、胰岛细胞癌、颌部癌、卡波西肉瘤(kaposisarcoma)、肾癌、喉癌、平滑肌肉瘤、软脑膜转移瘤、白血病、唇癌、脂肪肉瘤、肝癌、小叶原位癌、低度星形细胞瘤、肺癌、淋巴结癌、淋巴瘤、男性乳腺癌、髓样癌、髓母细胞瘤、黑色素瘤、脑膜瘤、默克尔细胞癌、间充质软骨肉瘤、间质瘤、间皮瘤、转移性乳腺癌、转移性黑色素瘤、转移性鳞状颈癌、混合性胶质瘤、口腔癌(mouthcancer)、粘液癌、黏膜黑色素瘤、多发性骨髓瘤、蕈样肉芽肿、骨髓增生异常综合征、鼻腔癌、鼻咽癌、颈部癌、神经母细胞瘤、神经内分泌肿瘤、非霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、燕麦细胞癌、眼癌、眼部黑色素瘤、少突胶质瘤、口癌、口腔癌(oralcavitycancer)、口咽癌、骨原性肉瘤、骨肉瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞瘤、卵巢原发性腹膜癌、卵巢性索间质瘤、佩吉特病(paget′sdisease)、胰腺癌、乳头状癌、鼻窦癌、甲状旁腺癌、盆腔癌、阴茎癌、周围神经癌、腹膜癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、毛细胞星形细胞瘤、松果体区肿瘤、松果体母细胞瘤、垂体瘤、初级中枢神经系统、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂癌、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、肉瘤、骨、肉瘤、软组织、肉瘤、子宫、鼻窦癌、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、脊椎癌、脊柱癌、脊髓癌、脊椎肿瘤、鳞状细胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、t细胞淋巴瘤、睾丸癌、喉癌、胸腺癌(thymoma/thymiccarcinoma)、甲状腺癌、舌癌、扁桃体癌、移行细胞癌、移行细胞癌、移行细胞癌、三阴性乳腺癌、输卵管癌、肾小管癌、未诊断癌、输尿管癌、输尿管癌、尿道癌、子宫腺癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌。[0110]在另一方面，本公开提供了一种用于扩增能够识别并杀死有此需要的受试者中肿瘤细胞的t细胞的方法，所述方法包括以下步骤：向受试者施用本公开的慢病毒颗粒，使得能够识别并杀死受试者中肿瘤细胞的t细胞通过慢病毒颗粒得以转导并扩增。在一些实施方案中，通过静脉内注射或通过瘤内注射施用慢病毒颗粒。[0111]在一些情况下，慢病毒颗粒包含靶向剂或编码靶向剂的核酸载体。示例性靶向剂包括抗体和嵌合抗原受体(“car”)。术语“抗体”是指任何种类的完整抗原结合免疫球蛋白或其自身特异性结合抗体靶抗原的片段，并且包括例如嵌合、人源化、全人和双特异性抗体。在一些情况下，本公开中使用的car包含对b细胞有特异性的结合结构域，例如对可见于b细胞淋巴瘤上的cd标记(诸如cd19、cd22、cd20或cd79a，优选为cd19)具有特异性。在wo2007/131092中例示经基因工程改造以表达car(例如，t细胞car)的t细胞。在一些情况下，靶向剂用于将细胞介导的免疫导向其他特定的细胞类型，诸如肿瘤细胞。[0112]在另一方面，本公开提供了用于扩增能够识别并杀死有此需要的受试者中肿瘤细胞的t细胞的方法，所述方法包括向受试者施用本公开的任何慢病毒颗粒，以及向受试者施用小分子，其中能够识别并杀死受试者中肿瘤细胞的t细胞得到扩增。[0113]在某些实施方案中，通过本文所述的方法治疗的受试者可为哺乳动物。在一些情况下，受试者是人、非人灵长类动物、猪、马、奶牛、狗、猫、兔子、小鼠或大鼠。受试者可为人类女性或人类男性。[0114]本发明还设想了组合疗法。如本文所用，组合包括同时治疗或顺序治疗。特别设想了本发明的方法与标准医学治疗(例如皮质类固醇)的组合，与新型疗法的组合也是如此。在一些情况下，可使用类固醇(例如强的松、泼尼松龙(prednisolone)、地塞米松)治疗受试者，以防止或减少对施用本文所述的慢病毒颗粒的免疫反应。在某些情况下，如果受试者表达对本文所述的慢病毒颗粒的抗体，则受试者可接受单采或另一种免疫调节剂。在一些情况下，此类免疫调节剂可能是不必要的，特别是在施用免疫抑制剂(例如他克莫司或西罗莫司)时。在一些情况下，与用慢病毒颗粒的治疗同时或顺序施用利妥昔单抗。在一些情况下，利妥昔单抗可用于阻断针对慢病毒颗粒的免疫反应。[0115]本公开的慢病毒颗粒、小分子和免疫抑制药物可通过任何途径施用，包括经口、经鼻、静脉内、动脉内、肌肉内或腹腔内途径。在一些情况下，通过静脉内注射或通过瘤内注射施用慢病毒颗粒。在一些情况下，通过静脉内注射或经口服施用来施用小分子。在一些情况下，以足以激活t细胞/nk细胞活化受体的浓度施用小分子。在一些情况下，小分子是雷帕霉素，任选地以足以维持雷帕霉素的血清浓度大于0.1nm、1nm或10nm的浓度施用。在一些情况下，小分子是拉帕洛，任选地以足以维持拉帕洛的血清浓度大于0.1nm、1nm或10nm的浓度施用。在一些情况下，小分子能够引起t细胞/nk细胞活化受体的二聚化，从而产生细胞活化信号。[0116]在一些情况下，小分子与慢病毒颗粒同时施用；或小分子在施用慢病毒颗粒之前或之后约30分钟、约1小时、约2小时、约4小时、约5小时或约10小时施用。在一些情况下，方法还包括向受试者施用免疫抑制剂。在一些情况下，免疫抑制剂是他克莫司，任选地以足以维持他克莫司的血清浓度大于0.1nm、1nm或10nm的浓度施用。在一些情况下，免疫抑制剂是环孢霉素，任选地以足以维持环孢霉素的血清浓度大于0.1nm、1nm或10nm的浓度施用。在一些情况下，免疫抑制剂是免疫抑制药物。在一些情况下，免疫抑制剂是免疫抑制药物，并且慢病毒载体包含编码提供针对所述免疫抑制药物的耐药性的蛋白质的核酸序列。[0117]适于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。在所有情况下，该形式必须是无菌的且必须具有一定的流动性，以达到易于注射的目的。该形式在制造和储存条件下必须稳定，并且必须进行防腐以防止诸如细菌和真菌的微生物的污染作用。载剂可为溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、其合适的混合物、和植物油。适当的流动性可例如，通过使用诸如卵磷脂的包衣，通过在分散液的情况下维持需要的粒度以及通过使用表面活性剂来保持。防止微生物的作用可通过各种抗细菌和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞(thimerosal)等)来达成。在许多情况下，最好包括等张剂，例如糖或氯化钠。可通过使用延迟吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶，实现可注射组合物的吸收延长。[0118]通过以下方式制备无菌可注射溶液：根据需要将raav以所要求的量与上文列举的各种其他成分一起并入适当的溶剂中。可注射溶液可以无菌制备或过滤灭菌。[0119]5定义[0120]除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。出于本发明的目的，下面定义以下术语。[0121]如本文所用，“293t对照颗粒”或“模拟(293t载体)”是指用慢病毒载体转导293t细胞产生的慢病毒颗粒。如本文所用，“刺激珠”是指在转导期间用于刺激t细胞的珠基试剂。标记“+对照(载体+刺激珠)”是指用刺激珠转导293t对照颗粒。[0122]如本文所用，术语“hatse细胞”或“hatse细胞系”或“hatse-293”是指通过用编码cd86和cd137l的一个或多个慢病毒载体转导293t细胞而产生并且关于高度表达cd86和cd137l的细胞经受荧光活化细胞分选(facs)一次或多次的包装细胞系。标记“(1x分选)hatse细胞载体”是指在对hatse细胞进行一次cd86+/cd173l+双阳性细胞的facs分选后，用慢病毒载体转导hatse细胞而产生的慢病毒颗粒。标记“(2x分选)hatse细胞载体”是指在对hatse细胞进行一次cd86+/cd173l+双阳性细胞的facs分选后，用慢病毒载体转导hatse细胞产生的慢病毒颗粒。[0123]冠词“一个/种(a/an)”和所述在本文中用来指代一个/种或多于一个/种(即，至少一个/种)的冠词的语法对象。以举例的方式，“一个/种要素”是指一个/种要素或多于一个/种要素。[0124]替代方案(例如，“或”)的使用应理解为是指替代方案中的一个、两个或其任何组合。[0125]术语“和/或”应理解为是指一种或两种替代方案。[0126]如本文所用，术语“约”或“大约”是指与参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度相比变化高达15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。在一个实施方案中，术语“约”或“大约”是指关于参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度的±15％、±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％、或±1％的数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度范围。[0127]除非另有说明，任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括所述范围内的任何整数的值，以及在适当情况下，其分数(诸如整数的十分之一和百分之一)。当紧跟在数字或数值前面时，术语“约”是指数字或数值范围的正或负10％。[0128]本说明书全文中，除非上下文另外要求，词语“包含(comprise/comprises/comprising)”将理解为意味着包含规定的步骤、或元素、或步骤或元素的组，但不排除任何其它步骤、或元素、或步骤或元素的组。在特定的实施方案中，术语“包括”、“具有”、“含有”和“包含”同义使用。[0129]“由...组成”是指包括并限于短语“由...组成”之后的任何内容。因此，短语“由...组成”指示所列的元素是必需的或强制性的，并且不可能存在其他元素。[0130]“基本上由...组成”是指包括在短语之后列出的任何元素，并且仅限于不干扰或促成本公开中针对所列元素所指定的活性或作用的其他元素。[0131]在本说明书通篇中提及“一个实施方案”、“实施方案”、“特定的实施方案”、“相关实施方案”、“某个实施方案”、“另一实施方案”或“其他实施方案”或其组合是指结合实施方案加以描述的特定特征、结构或特性包括在本发明的至少一个实施方案中。因此，本说明书通篇在各个地方出现前述短语不必要全部是指相同的实施方案。此外，特定的特征、结构或特性可以任何适合的方式组合在一个或多个实施方案中。[0132]如本文所用，术语“分离的”是指大体或基本上不含通常伴随在其自然状态下的组分的材料。在特定的实施方案中，术语“获得”或“源自”与分离同义使用。[0133]如本文所使用的“受试者”、“患者”或“个体”包括表现出可使用本文所设想的载体、组合物和方法治疗的疼痛的任何动物。合适的受试者(例如患者)包括实验动物(诸如小鼠、大鼠、兔子或豚鼠)、农场动物和家养动物或宠物(诸如猫或狗)。包括非人灵长类动物，并且任选人患者。[0134]如本文所使用的“治疗(treatment/treating)”包括与治疗相关的任何有益或期望的效果。“治疗”并不一定指示完全根除或治愈疾病或病状，或其相关症状。[0135]如本文所用，“防止(prevent)”和类似的词，诸如“防止(prevented)”、“防止(preventing)”等，指示用于防止、抑制或降低病症发生或复发的可能性的方法。如本文所用，“预防”和类似的词还包括在发病或复发之前减轻疾病或病症的强度、效果、症状和/或负担。[0136]如本文所用，病毒或慢病毒颗粒的“治疗有效量”或“有效的量”或“有效量”是指实现有益或期望的预防或治疗结果(包括临床结果)所需的病毒或慢病毒颗粒的量。[0137]“预防性有效量”是指有效实现期望的预防效果的病毒或慢病毒颗粒的量。通常但不一定，因为预防剂量在疾病之前或在疾病早期阶段用于受试者，所以预防有效量少于治疗有效量。[0138]病毒或慢病毒颗粒的“治疗有效量”可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重的因素，以及干细胞和祖细胞在个体中引起期望反应的能力而变化。治疗有效量还是其中病毒的任何毒性或有害效果都超过治疗上有益效果的量。术语“治疗有效量”包括对“治疗”受试者(例如，患者)有效的量。[0139]生理反应的“增加”或“升高”量(例如，电生理活性或细胞活性)通常是“统计上显著”的量，并且可包括1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30倍或更多倍(例如，500、1000倍)(包括介于1与大于1之间的所有整数和小数点，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)未治疗的受试者中活性水平的增加。[0140]生理反应的“降低”或“减小”量(例如，电生理活性或细胞活性)通常是“统计上显著”的量，并且可包括1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30倍或更多倍(例如，500、1000倍)(包括介于1与大于1之间的所有整数和小数点，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)未治疗的受试者中的活性水平的降低。[0141]通过“保持”、或“保留”、或“维持”、或“无变化”、或“无实质性变化”或“无实质性减少”通常是指与由媒介物或对照分子/组合物引起的反应相当的生理反应。相当的反应是参考反应无显著差异或可测量差异的反应。[0142]“受体-配体结合”、“配体结合”和“结合”在本文中可互换使用，意指受体与配体或合成配体之间的物理相互作用。配体结合可通过本领域已知的多种方法来测量(例如，检测与放射性标记配体的缔合)。[0143]如本文所用，术语“特异性结合亲和力”或“特异性结合(specificallybinds/specificallybound/specificbinding)”在说明书和权利要求书中可互换使用，并且是指发生在成对分子种类(例如受体与配体)之间的结合。当两个种类的相互作用产生非共价结合的复合物时，发生的结合通常是静电、氢键结合或亲脂性相互作用的结果。在各种实施方案中，一个或多个种类之间的特异性结合是直接的。在一个实施方案中，特异性结合的亲和力是背景结合(非特异性结合的约2倍、大背景结合的约5倍、背景结合的约10倍、背景结合的约20倍、背景结合的约50倍、背景结合的约100倍、或背景结合的约1000倍或更多倍。[0144]一般来讲，“序列同一性”或“序列同源性”分别是指两个多核苷酸或多肽序列的核苷酸与核苷酸或氨基酸与氨基酸的精确对应。通常，用于测定序列同一性的技术包括确定多核苷酸的核苷酸序列和/或确定由此编码的氨基酸序列，以及将这些序列与第二核苷酸或氨基酸序列进行比较。两个或更多个序列(多核苷酸或氨基酸)可通过测定它们的“同一性百分比”来比较。无论是核酸还是氨基酸序列，两个序列的同一性百分比，是两个比对序列之间的精确匹配数目除以较短序列的长度，再乘以100。例如，还可使用可购自美国国立卫生研究院(nationalinstitutesofhealth)的高级blast计算机程序(包括版本2.2.9)来比较序列信息，从而确定同一性百分比。blast程序基于以下比对方法：karlin和altschul，proc.natl.acad.sci.usa87：2264-2268(1990)并且讨论于altschul等人，j.mol.biol.215：403-410(1990)；karlin和altschul，proc.natl.acad.sci.usa90：5873-5877(1993)；和altschul等人，nucleicacidsres.25：3389-3402(1997)中。简而言之，blast程序将同一性定义为相同的比对符号(通常是核苷酸或氨基酸)的数目除以两个序列中较短符号的总数。程序可用于确定所比较的整个蛋白质长度上的同一性百分比。例如，在blastp程序中，提供了默认参数来用短查询序列优化搜索。程序还允许使用seg过滤器屏蔽由wootton和federhen，computersandchemistry17：149-163(1993)的seg程序确定的查询序列段。期望的序列同一性程度的范围为约80％至100％，以及介于它们之间的整数值。典型地，所公开序列与所要求保护的序列之间的同一性百分比为至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％。[0145]在本文使用的术语“外源性”是指来源于生物体外部的任何分子，包括核酸、蛋白质或肽、小分子化合物等。相比之下，术语“内源性”是指来源于生物体内部的任何分子(即生物体自然产生的)。[0146]本文使用的术语“moi”是指感染复数，也就是剂(例如病毒颗粒)与感染靶标(例如细胞)的比率。[0147]本文所有出版物和提及的专利特此以引用的方式整体并入，如同将每个单独的出版物或专利特定地和单独地指示未以引用的方式并入。在冲突的情况下，以本申请(包括本文中的任何定义)为准。然而，本文所引用的任何参考文献、文章、出版物、专利、专利出版物和专利申请，并不也不应被视为承认或任何形式的建议，它们构成有效的现有技术或形成世界上任何国家的公知常识的一部分。[0148]本文所使用的小节标题仅出于组织性目的并且不解释为限制所描述的主题。[0149]在以下实施例中进一步描述了本发明，所述实施例并不限制权利要求中所述的本发明的范围。[0150]实施例[0151]实施例1：hatse-293包装细胞系[0152]如下生成用于产生慢病毒颗粒的包装细胞系(称为hatse-293)，所述慢病毒颗粒能够激活并有效转导t细胞。构建一种慢病毒载体，所述慢病毒载体包含mnd启动子和2a肽连接的多顺反子开放阅读框，所述多顺反子开放阅读框编码单克隆抗体okt3；cd86和cd137l(抗cd3scfv-2a-cd86-2a-cd137l)的抗cd3单链fv片段(scfv)。将慢病毒载体转导到在细胞培养中生长的hek-293t细胞中，从而致使mnd启动子和多顺反子开放阅读框稳定整合到宿主细胞的基因组中。对所转导的hek-293t细胞进行荧光活化细胞分选(facs)，以筛选出高表达cd86和cd137l的细胞(图2)。由于多顺反子开放阅读框的结构，故cd86+/cd137l+细胞也必然表达抗cd3scfv+。在培养中扩增cd86+/cd137l+细胞群，以产生hatse-293包装细胞系，并将等分试样冷冻以便长期储存和使用。通过流式细胞术证实cd86和cd137的表达(图3)。[0153]用pmnd-gfp慢病毒载体和四种慢病毒包装质粒(pmd2.g、prsv-rev、pmdlg-prre和prrl-goi)共转染hatse-293细胞，并从细胞上清液中收获病毒颗粒以产生慢病毒颗粒(称为hatse颗粒)。作为对照，用pmnd-gfp慢病毒载体和四种慢病毒包装质粒(pmd2.g、prsv-rev、pmdlg-prre和prrl-goi)共转染hek-293t细胞，并从细胞上清液中收获病毒颗粒以产生慢病毒颗粒(293t对照颗粒)。[0154]在存在或不存在外源性t细胞活化刺激物(dynabeadstm人t活化剂cd3/cd28-“刺激珠″)的情况下，将人原代t细胞(2.5x105个细胞)一式两份在moi5或moi20下暴露于hatse颗粒或293t颗粒。通过自动细胞计数器(countesstmii，thermofisher)评估7天内细胞的生长(图3)。暴露于hatse颗粒的细胞的生长类似于用对照颗粒转导的珠刺激的t细胞，并且在第7天为293t对照颗粒的约略两倍大。通过荧光显微镜评估gfp表达(图4)。暴露于hatse颗粒的细胞表现出破裂并显示高gfp表达，类似于用对照颗粒转导的珠刺激的t细胞，这证实了hatse颗粒暴露的t细胞的有效转导，尽管没有暴露于异源性t细胞活化刺激物(即刺激珠)。[0155]实施例2：lenti-raccr[0156]lenti-raccr是一种慢病毒载体，所述慢病毒载体含有编码雷帕霉素激活的嵌合细胞表面受体(raccr)的转基因。具体地，此示例性raccr是由两种融合蛋白制成，这两种融合蛋白被设计成在雷帕霉素存在下二聚化，从而激活信号传导(图12a)。第一融合蛋白是将il-2受体β链(il2rb)的胞质结构域与fk506结合蛋白(fkbp)融合，使得fkbp形成融合蛋白的胞外结构域的结果。第二融合蛋白是将il-2受体γ链(il2rg)的胞质结构域与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mtor)的fkbp-雷帕霉素结合(frb)结构域融合，使得frb形成融合蛋白的胞外结构域的结果。已知胞外结构域在雷帕霉素的存在下形成三聚复合物，致使受体亚基二聚化以形成活性信号传导受体复合物。[0157]raccr-β-fkbp-il2rb融合蛋白，其中信号肽(括号内)具有2a肽(斜体)：[0158][0159]fkbp结构域具有以下序列：[0160][0161]il2rb结构域具有以下序列：[0162][0163]raccr-γ-frb-il2rg融合蛋白，其中信号肽(括号内)具有2a肽(斜体)[0164][0165]frb结构域具有以下序列：[0166][0167]il2rg结构域具有以下序列：[0168][0169]使用标准包装质粒pmd2.g将编码绿色荧光蛋白的慢病毒转移质粒包装成慢病毒颗粒，并将所得慢病毒颗粒用于转导人原代t细胞作为对照实验。只观察到低水平的转导(图12b)。[0170]使用编码t细胞活化和共刺激分子的质粒将编码mcherry的慢病毒转移质粒包装成慢病毒颗粒，从而产生表面工程改造的慢病毒颗粒(se-lvp)。作为对照实验，将所得的慢病毒颗粒(mcherry：se-lvp)用于转导人原代t细胞。只观察到低水平的转导(图12c)。[0171]使用编码t细胞活化和共刺激分子的质粒将编码raccr的慢病毒转移质粒包装成慢病毒颗粒，从而产生表面工程改造的慢病毒颗粒(se-lvp)。将所得的慢病毒颗粒(raccr：se-lvp)用于转导人原代t细胞。只观察到低水平的转导(图12d)。[0172]将用mcherry：se-lvp或raccr：se-lvp转导的人原代t细胞在il-2(“il2”)、雷帕霉素(“rapa”)或无治疗(“nt”)存在下培养。作为对照，使用标准包装质粒pmd2.g包装的mcherry构建体也用il-2测试。在存在雷帕霉素但没有外源性il-2的情况下，raccr：se-lvp介导t细胞持续扩增18天(图12e)。t细胞的扩增依赖于雷帕霉素或il-2的存在(图12f)。这构成了表面工程改造的颗粒可递送生长刺激受体有效载荷并扩增人原代t细胞的体外概念证明。转导不需要慢病毒颗粒的离心(spinoculation)或其他操作。在感染复数(moi)为10时，细胞的转导提供约20％的转导效率。[0173]本领域技术人员仅仅使用常规试验将认识到或者能够确定本文所描述的发明的具体实施方案的很多等效方案。此类等效物意图由以下权利要求涵盖。当前第1页1 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技术领域：
：[0005]本公开总体涉及病毒载体、包装细胞系及相关使用方法，且具体来说用于在体内扩增免疫细胞群以治疗疾病病状的相关方法。
背景技术：
：：[0006]癌症免疫疗法是一种以治疗性诱导对肿瘤的免疫反应为基础的治疗模式。过继性t细胞疗法(act)是癌症免疫疗法的一种形式。将淋巴细胞，特别是肿瘤浸润淋巴细胞(til)，从体内分离、离体培养、扩增，然后再灌注。扩增步骤可包括til的抗原特异性扩增或基因工程改造。act于rosenberg等人，adoptivecelltransferaspersonalizedimmunotherapyforhumancancer.science.348：62-8(2015)中综述。[0007]本发明人已意识到，作为act的替代方案，在体内转导til或其他免疫细胞可增强细胞在体内而非离体的扩增。此外，本发明人已意识到，在体内转导til或其他免疫细胞将允许治疗癌症或其他疾病病状，而不会有act所需的昂贵、耗时且有风险的程序。[0008]因此，需要在体内扩增til或其他免疫细胞群的手段。具体地，需要能够在体内选择性地扩增til或其他免疫细胞的期望群体的治疗剂。本公开提供了病毒载体、包装细胞系以及用于在体内扩增til或其他免疫细胞以治疗疾病病状的相关方法。技术实现要素：[0009]本公开部分地基于以下发现：设计来表达t细胞/nk细胞活化受体(以及任选的其他效应蛋白)的慢病毒载体和包装细胞系对于t细胞的体内扩增是有用的。本公开的慢病毒载体和包装细胞系可适于肿瘤浸润淋巴细胞在体内的转导和药物介导的扩增，诸如当使用包装细胞系将慢病毒载体包装成慢病毒颗粒并将所产生的慢病毒颗粒递送至受试者的体内时。根据本公开的慢病毒颗粒的瘤内注射导致肿瘤浸润淋巴细胞的体内扩增。当t细胞/nk细胞活化受体能够被小分子激活(或失活)时，肿瘤浸润淋巴细胞的扩增可通过使用此种小分子来控制。任选地，包装细胞系表达t细胞活化或共刺激分子，从而在不存在外源性活化剂的情况下，促进来源于包装细胞系的慢病毒颗粒对t细胞的转导。任选地，慢病毒载体赋予对一种或多种免疫抑制药物的耐药性，从而促进靶细胞的选择性扩增。[0010]在一个方面，本公开提供了一种包含t细胞和/或nk细胞特异性启动子的核酸载体，所述t细胞和/或nk细胞特异性启动子可操作地连接到编码t细胞/nk细胞活化受体的核酸序列，其中t细胞/nk细胞活化受体能够被小分子激活。在一个实施方案中，核酸载体为慢病毒载体。在一个实施方案中，核酸载体包含与seqidno：6-11或其片段至少部分相同的序列。[0011]在另一方面，本公开提供了一种包含强启动子的核酸载体，所述强启动子可操作地连接到编码t细胞/nk细胞活化受体的核酸序列，其中t细胞/nk细胞活化受体能够被小分子激活。在一个实施方案中，强启动子选自seqidno：1-5。[0012]在另一方面，本公开提供了一种用于产生能够激活并有效转导t细胞的慢病毒颗粒的包装细胞系，所述包装细胞系包含能够包装慢病毒载体的培养的细胞，其中所培养的细胞被基因工程改造以表达t细胞活化或共刺激分子。[0013]在另一方面，本公开提供了一种慢病毒颗粒，所述慢病毒颗粒包含核酸载体，诸如本公开的任意核酸载体。在一个实施方案中，慢病毒颗粒包含t细胞活化或共刺激分子，例如抗cd3抗体、cd28配体或41bb配体。[0014]在另一方面，本公开提供了一种用于激活并有效转导t细胞的慢病毒颗粒，所述慢病毒颗粒通过将如权利要求19所述的核酸载体转导到经基因工程改造以表达t细胞活化或共刺激分子的培养细胞中来制备。[0015]在另一方面，本公开提供了一种用于治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用本公开的任何慢病毒颗粒，以及向受试者施用小分子(慢病毒颗粒的t细胞/nk细胞活化受体能够被小分子激活)，其中在受试者中治疗癌症。[0016]在另一方面，本公开提供了一种用于扩增能够识别并杀死有此需要的受试者中肿瘤细胞的t细胞的方法，所述方法包括向受试者施用本公开的任何慢病毒颗粒，以及向受试者施用小分子(慢病毒颗粒的t细胞/nk细胞活化受体能够被小分子激活)，其中能够识别并杀死受试者中肿瘤细胞的t细胞得到扩增。[0017]在另一方面，本公开提供了一种包含对t细胞、nk细胞、或t细胞和nk细胞有特异性的启动子的核酸，其中核酸的序列与选自由seqidno：1-4组成的组的序列至少90％相同。[0018]本公开的另外的方面和实施方案将从下面的详细描述中显而易见。附图说明[0019]图1a至图1b描绘了慢病毒颗粒。图1a是表面工程改造的慢病毒颗粒的一个实施方案的示意图，其包含图1b所示的慢病毒颗粒中不存在的表面表达的抗cd3和t细胞共刺激分子。[0020]图2描绘了用于从用编码抗cd3scfv、cd86和cd137l的慢病毒载体转导的hek-293t细胞产生hatse-293包装细胞系的实验方案。将cd86+cd137l+通过荧光活化细胞分选法分离，扩增，并冷冻以供长期储存和使用。[0021]图3a至图3k描绘了对cd46的亲代293细胞系和hatse-293包装细胞系(两种细胞系上的预期组成性表达)以及cd86+/cd137l+表达(仅在hatse-293细胞系中预期的表达)的facs分析。[0022]图3a至图3e描绘了对cd46的亲代hek-293细胞系(预期组成性表达)以及cd86/cd137l表达(预期无表达)的分析。在未染色(模拟)样品中未观察到可检测的荧光标记(图3a)。通过抗cd46抗体染色(图3a至图3b；pe抗人cd46)检测到cd46的高表达，并且分别通过cd86和cd137l的特异性染色未检测到cd86(图3e；太平洋蓝(pacificblue)抗人cd86)或cd137l(图3d；pe抗人4-1bb配体(cd137l))的表达。[0023]图3f至图3k描绘了对cd46的hatse-293细胞系(两种细胞系上的预期组成性表达)以及cd86/cd137l表达(预期的cd86+/cd137l+表达)的分析。图3f和图3g展示了未染色(模拟)样品中没有可检测的荧光标记。图3h和图3i展示了通过抗cd46抗体染色检测到的cd46(pe抗人cd46)的一致高表达。图3j和图3k展示了分别使用抗cd86(图3j)和抗cd137l(图3k)抗体检测到表达低量和高量的cd86或cd137l的两个群体。[0024]图4描绘了由对照慢病毒颗粒或由以下定义和实施例中所述的hatse细胞系产生的慢病毒颗粒所转导的t细胞的生长曲线。作为阳性对照，在刺激珠的存在下用对照慢病毒颗粒转导t细胞。“转导后天数”是指细胞暴露于颗粒(第0天)后经过的天数。[0025]图5描绘了暴露于以下各物的细胞的荧光显微照片：293t对照颗粒[293t无刺激]；293t对照颗粒和刺激珠[293t刺激]；1x分选的hatse颗粒[1x分选的hatse(无刺激)]；或2x分选的hatse颗粒[2x分选的hatse(无刺激)]。[0026]图6描绘了vivo-til104lngfr(seqidno：6)的载体图。[0027]图7描绘了vivo-til105tcp1(seqidno：7)的载体图。[0028]图8描绘了vivo-til106tcp2(seqidno：8)的载体图。[0029]图9描绘了vivo-til107tcp3(seqidno：9)的载体图。[0030]图10描绘了vivo-til108tcp4(seqidno：10)的载体图。[0031]图11描绘了vivo-til109hperfp(seqidno：11)的载体图。[0032]图12a至图12f示出了示例性小分子可控的t细胞/nk细胞活化受体(称为raccr)的结果。图12a示出了所例示的raccr分子的设计。图12a示出了用表达gfp的对照慢病毒颗粒转导的细胞。图12b示出了用表达mcherry的表面工程改造的颗粒转导的细胞。图12c示出了用表达raccr的表面工程改造的颗粒转导的细胞。[0033]图12e示出了在il-2或雷帕霉素存在下，用各种表面工程改造的慢病毒颗粒(se-lvp)，包括表达raccr的se-lvp转导的t细胞的t细胞扩增图。[0034]图12f示出了证实由raccr驱动的t细胞扩增可用雷帕霉素控制的数据。具体实施方式[0035]本发明人已意识到，作为act的替代方案，在体内转导til或其他免疫细胞可增强细胞在体内而非离体的扩增。此外，本发明人已意识到，在体内转导til或其他免疫细胞允许治疗癌症或其他疾病病状，而没有免疫细胞离体扩增的缺点。[0036]因此，本公开提供了在体内扩增til或其他免疫细胞群体的手段。具体地，本公开提供了能够在体内选择性地扩增til或其他免疫细胞的期望群体的治疗剂。本公开提供了病毒载体以及用于在体内扩增til或其他免疫细胞以治疗疾病病状的相关方法。[0037]本公开部分地基于以下发现：设计来表达t细胞/nk细胞活化受体(以及任选的其他效应蛋白)的慢病毒载体和包装细胞系对于t细胞的体内扩增是有用的。本公开的慢病毒载体和包装细胞系可适于肿瘤浸润淋巴细胞在体内的转导和药物介导的扩增，诸如当使用包装细胞系将慢病毒载体包装成慢病毒颗粒并将所产生的慢病毒颗粒递送至受试者的体内，诸如递送至患有实体肿瘤的患者时。所公开的慢病毒载体和颗粒可通过自体或同种异体t细胞或其他免疫细胞的体外转导用于act。在一些情况下，所公开的慢病毒载体和颗粒被配置为在体内使用。瘤内注射慢病毒颗粒导致肿瘤浸润淋巴细胞在体内扩增，因为慢病毒载体被配置为提供能够向体外或体内转导的靶细胞提供有丝分裂信号的t细胞/nk细胞活化受体的表达。[0038]1.1核酸载体[0039]如本文所用，术语“核酸载体”旨在表示携带、容纳或表达目标核酸的任何核酸。核酸载体可具有诸如表达、包装、假型化或转导的特有功能。如果核酸载体适合用作克隆载体或穿梭载体，则其还可具有操纵功能。载体的结构可包括制作可行且适合于特定用途的任何期望的形式。此类形式包括例如环状形式诸如质粒和噬菌粒，以及线性或分支形式。核酸载体可由例如dna或rna构成，以及含有部分或全部核苷酸衍生物、类似物和模拟物。此类核酸载体可从自然来源获得、重组产生或以化学方式合成。[0040]本公开的载体系统的非限制性实例包括逆转录病毒、慢性病、泡沫病毒和睡美人(sleepingbeauty)转座子。[0041]1.1.1慢病毒载体[0042]慢病毒是复杂的逆转录病毒，除了常见的逆转录病毒基因gag、pol和env外，其还含有其他具有调控或结构功能的基因。较高的复杂性使得病毒能够调节其生命周期，就像在潜伏感染过程中一样。慢病毒的一些实例包括人免疫缺陷病毒(hiv-1和hiv-2)和猿猴免疫缺陷病毒(siv)。慢病毒载体已通过对hiv毒力基因的多次减毒而产生，例如，基因env、vif、vpr、vpu和nef被删除，使得载体具有生物安全性。[0043]慢病毒载体为基因疗法提供了巨大的优势。除非工程改造成非整合型，否则慢病毒载体稳定地整合到靶细胞的染色体中，从而允许长期表达递送的转基因。此外，它们不转移病毒基因，因此避免了产生可被细胞毒性t细胞破坏的转导细胞的问题。此外，它们具有相对较大的克隆能力，足以满足大多数预期的临床应用。另外，与其他逆转录病毒相比，慢病毒能够转导非分裂细胞。这在诸如造血系统、脑、肝、肺和肌肉的组织的基因疗法中非常重要。例如，来源于hiv-1的载体允许高效的体内和离体递送、整合和稳定表达转基因到诸如神经元、肝细胞和心肌细胞的细胞中(blomer等人，1997；kafri等人，1997；naldini等人，1996；naldini等人，1998)。[0044]慢病毒载体是本领域中已知的，参见naldini等人(1996)science272：263-7；zufferey等人(1998)j.virol.72：9873-9880；dull等人(1998)j.virol.72：8463-8471；美国专利号6,013,516；和美国专利号5,994,136，其各自以引用的方式整体并入本文。一般来讲，这些载体被配置成携带用于选择含有载体的细胞、用于将外来核酸并入慢病毒颗粒中以及用于将核酸转移到靶细胞中的基本序列。[0045]常用的慢病毒载体系统是所谓的第三代系统。第三代慢病毒载体系统包括四种质粒。“转移质粒”编码由慢病毒载体系统递送到靶细胞中的多核苷酸序列。转移质粒通常具有一个或多个侧接有长末端重复(ltr)序列的目标转基因序列，这有助于将转移质粒序列整合到宿主基因组中。出于安全原因，转移质粒通常被设计成使所产生的载体复制不起作用。例如，转移质粒缺乏在宿主细胞中产生感染颗粒所必需的基因元件。此外，可将转移质粒设计成缺失3’ltr，从而使病毒“自身失活”(sin)。参见dull等人(1998)j.virol.72：8463-71；miyoshi等人(1998)j.virol.72：8150-57。[0046]第三代系统通常还包括两个“包装质粒”和一个“包膜质粒”。“包膜质粒”通常编码可操作地连接到启动子的env基因。在示例性第三代系统中，env基因为vsv-g，且启动子为cmv启动子。第三代系统使用两个包装质粒，一个编码gag和pol，而另一个编码rev作为进一步的安全特征，这是对所谓的第二代系统的单个包装质粒的改进。虽然更安全，但第三代系统使用起来可能更麻烦，并且由于添加另外的质粒而导致病毒滴度降低。示例性包装质粒包括但不限于pmd2.g、prsv-rev、pmdlg-prre和prrl-goi。[0047]慢病毒载体系统依赖于使用“包装细胞系”。一般来讲，包装细胞系是在将转移质粒、一个或多个包装质粒和包膜质粒导入细胞时，其细胞能够产生传染性慢病毒颗粒的细胞系。可使用将质粒导入细胞中的各种方法，包括转染或电穿孔。在一些情况下，包装细胞系适于将慢病毒载体系统高效包装成慢病毒颗粒。[0048]如本文所用，术语“慢病毒载体”旨在表示编码基因组包装所需的慢病毒顺式核酸序列的核酸。慢病毒载体还可编码有益于基因递送的其他顺式核酸序列，包括例如，逆转录、前病毒整合或基因组转录所需的顺式序列。慢病毒载体执行慢病毒载体的转导功能。因此，载体基因组的确切组成将取决于希望导入靶细胞中的遗传物质。因此，载体基因组可编码，例如，除了包装、逆转录、整合或转录所需以外的另外的多肽或功能。此类功能通常包括编码表达目标核酸所需的顺式元件。慢病毒顺式序列或元件可来源于慢病毒基因组或其他病毒或载体基因组，只要慢病毒载体基因组可通过包装细胞系包装成慢病毒颗粒并导入靶细胞中即可。[0049]慢病毒载体的非限制性实例包括seqidno：6-11，它们在图6至图11中示出。[0050]所产生的慢病毒颗粒通常包括rna基因组(来源于转移质粒)、包埋env蛋白的脂质双层包膜以及其他辅助蛋白，包括整合酶、蛋白酶和基质蛋白(参见图1b)。如本文所用，术语“慢病毒颗粒”旨在表示包括包膜、具有慢病毒的一种或多种特征并且能够侵入靶宿主细胞的病毒颗粒。此类特征包括，例如，感染非分裂宿主细胞；转导非分裂宿主细胞；感染或转导宿主免疫细胞；含有包括gag结构多肽p7、p24和p17中的一个或多个的慢病毒病毒体；含有包括env编码的糖蛋白p41、p120和p160中的一个或多个的慢病毒包膜；含有包括作用于复制、前病毒整合或转录的一个或多个慢病毒顺式作用序列的基因组；含有编码慢病毒蛋白酶、逆转录酶或整合酶的基因组；或含有编码调控活性的基因组，诸如tat或rev。转移质粒可包含cppt序列，如描述于美国专利号8,093,042中。[0051]系统的效率是载体工程改造中的重要问题。可以本领域已知的各种方式来评估慢病毒载体系统的效率，这些方式包括诸如通过定量聚合酶链反应(qpcr)来测量载体拷贝数(vcn)或载体基因组(vg)，或以感染单位/毫升(iu/ml)为单位的病毒滴度。例如，可使用对培养的肿瘤细胞系ht1080执行的功能性测定来评估滴度，如描述于humbert等人developmentofthird-generationcocalenvelopeproducercelllinesforrobustlentiviralgenetransferintohematopoieticstemcellsandt-cells.moleculartherapy24：1237-1246(2016)中。当在持续分裂的培养细胞系上评估滴度时，不需要刺激，且因此测得的滴度不受慢病毒颗粒表面工程改造的影响。用于评估慢病毒载体系统的效率的其他方法提供于gaererts等人comparisonoflentiviralvectortitrationmethods.bmcbiotechnol.6：34(2006)中。[0052]众所周知，慢病毒载体系统具有有限的效率，并且试图改变慢病毒载体系统常常将导致效率下降。本发明人惊奇地发现，慢病毒载体系统(例如，第三代系统)的包膜质粒可被修饰来除了融合糖蛋白或其功能变体之外还编码多个多肽。[0053]在一些情况下，本公开的载体和包装细胞系能够以至少约1x106iu/ml、至少约2x106iu/ml、至少约3x106iu/ml、至少约4x106iu/ml、至少约5x106iu/ml、至少约6x106iu/ml、至少约7x106iu/ml、至少约8x106iu/ml、至少约9x106iu/ml、或至少约1x107iu/ml的滴度产生表面工程改造的慢病毒颗粒。在一些情况下，本公开的多顺反子载体能够以至少约1x107iu/ml、至少约2x107iu/ml、至少约3x107iu/ml、至少约4x107iu/ml、至少约5x107iu/ml、至少约6x107iu/ml、至少约7x107iu/ml、至少约8x107iu/ml、至少约9x107iu/ml、或至少约1x108iu/ml的滴度产生表面工程改造的慢病毒颗粒。[0054]1.2t细胞/nk细胞活化受体[0055]本公开设想了编码t细胞/nk细胞活化受体的核酸载体、慢病毒载体和aav载体。如本文所用，术语“t细胞/nk细胞活化受体”是指一种或多种跨膜蛋白，所述一种或多种跨膜蛋白被配置成在转导细胞的细胞表面上表达，使得t细胞/nk细胞活化受体向转导细胞提供有丝分裂信号。使用t细胞/nk细胞活化受体是因为在大多数情况下，靶细胞为t细胞或nk细胞。通过使用在另一种细胞类型中保持活性的活化受体，本发明方法可适于与其他细胞类型一起使用。此处有用的t细胞/nk细胞活化受体可包括信号传导结构域，即细胞因子受体信号传导结构域、共刺激受体信号传导结构域、t细胞受体亚基信号传导结构域、nk细胞受体亚基信号传导结构域、生长因子受体信号传导结构域等。[0056]1.2.1t细胞/nk细胞活化受体的非限制性实例[0057]所使用的信号传导结构域可为常见的细胞因子受体γ链的信号传导结构域，也可为常见的细胞因子受体β链的信号传导结构域。信号传导结构域可包括能够在酪氨酸磷酸化时结合sh2结构域的itam或酪氨酸。在一些情况下，信号传导可通过活化受体的同源或异源二聚化触发。在一些情况下，活化受体的胞内结构域上的一个或多个酪氨酸残基的磷酸化可导致与sh2结构域的二聚化，从而启动有丝分裂信号级联。在一些情况下，本公开的信号传导结构域可能能够在酪氨酸残基上磷酸化，并且之后与另一分子上的sh2结构域结合。[0058]在一些情况下，t细胞/nk细胞活化受体是天然存在的活化受体。可替代地，从不同活化受体提取的一个或多个基因元件的复合物是本领域中已知的。在本发明中有用的工程改造的t细胞/nk细胞活化受体的实例包括但不限于组成活性il2受体或il7受体，如描述于hunter等人chimericγccytokinereceptorsconfercytokineindependentengraftmentofhumantlymphocytes.molimmunol.2013年11月；56(1-2)：1-11.；shum等人constitutivesignalingfromanengineeredil7receptorpromotesdurabletumoreliminationbytumor-redirectedtcells.cancerdiscov.2017年11月；7(11)：1238-1247中。[0059]1.2.2小分子可控的t细胞/nk细胞活化受体[0060]在一些情况下，提供一种控制身体内转导细胞的扩增的手段可为有利的。在一些情况下，这可作为防止细胞过度扩增的安全保护。在其他情况下，可控制转导细胞的扩增以用于治疗目的。因此，本公开提供了可通过使用小分子控制的t细胞/nk细胞活化受体。当慢病毒载体编码此种可控的t细胞/nk细胞活化受体时，施用小分子将允许活化受体的激活以lb、itgax、cd1lc、itgb1、cd29、itgb2、cd18、lfa-1、itgb7、nkg2d、tnfr2、trance/rankl、dnam1(cd226)、slamf4(cd244、2b4)、cd84、cd96(tactile)、ceacam1、crtam、ly9(cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、cd69、slamf6(ntb-a、ly108)、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、blame(slamf8)、selplg(cd162)、ltbr、lat、gads、slp-76、pag/cbp、cd19a，与cd83、cd27、cd28、icos、4-1bb、cd40、rank/trance-r、ox40、tgfbr1、tgfbrii、myd88、cd40和任何其他tnf受体超家族成员特异性结合的配体，及他们的组合。[0064]目标蛋白质的“同源物”，诸如fkbp或frb，包括包含氨基酸序列或由其组成的蛋白质，所述氨基酸序列与蛋白质的氨基酸序列具有至少约70％、80％、90％、95％、98％或99％的同一性。同源物还可以是由与核苷酸序列具有至少约70％、80％、90％、95％、98％或99％同一性的核酸编码的蛋白质。[0065]目标蛋白质的“功能同源物”是指具有蛋白质的至少一种生物学活性的蛋白质同源物。例如，fkpb的功能同源物是指在雷帕霉素(或相关拉帕洛)存在下与frb异源二聚化或在诸如ap1903的分子存在下同源二聚化的fkbp同源物；frb的功能同源物是指在雷帕霉素(或相关拉帕洛)存在下与fkbp异源二聚化的frb同源物。[0066]在一些实施方案中，t细胞/nk细胞活化受体包含(a)第一链，所述第一链包含以下中的一者或两者：(i)与seqidno：13共享至少95％、99％或100％序列同一性的功能性fkpb结构域，和(ii)与seqidno：14共享至少95％、99％或100％序列同一性的功能性il2rb结构域；和/或(b)第二链，所述第二链包含以下中的一者或两者：(i)与seqidno：16共享至少95％、99％或100％序列同一性的功能性frb结构域，和(ii)与seqidno：17共享至少95％、99％或100％序列同一性的功能性il2rg结构域。[0067]在一些实施方案中，t细胞/nk细胞活化受体包含(a)第一链，所述第一链包含功能性fkpb结构域和功能性il2rb结构域，其中第一链与seqidno：12共享至少95％、99％或100％序列同一性；和/或(b)第二链，所述第二链包含功能性frb结构域和功能性il2rg结构域，其中第二链与seqidno：15共享至少95％、99％或100％序列同一性。[0068]1.2.3嵌合抗原受体[0069]在一些情况下，提供一种将转导的细胞靶向特定细胞或组织的手段可为有利的。在一些情况下，慢病毒载体包含(代替或除了其他基因之外)编码嵌合抗原受体(car)的多核苷酸。可采用本领域中已知的各种car。可替代地，可使用t细胞受体(tcr)融合物。当载体编码car时，car可包含选自以下结构域或片段中的一个或多个结构域：cd28、ox-40、4-1bb/cd137、cd2、cd7、cd27、cd30、cd40、程序性死亡-1(pd-1)、诱导性t细胞共刺激分子(icos)、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1、cd1-1a/cd18)、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd3ζ、cd247、cd276(b7-h3)、light、(tnfsf14)、nkg2c、igα(cd79a)、dap-10、fcγ受体、mhc1类分子、tnf受体蛋白、免疫球蛋白、细胞因子受体、整合素、信号传导淋巴细胞活化分子(slam蛋白)、活化nk细胞受体、btla、toll配体受体、icam-1、b7-h3、cds、icam-1、gitr、baffr、light、hvem(lightr)、kirds2、slamf7、nkp80(klrf1)、nkp44、nkp30、nkp46、cd19、cd4、cd8α、cd8β、il-2rβ、il-2rγ、il-7rα、il-21rα、itga4、vla1、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cd1ld、itgae、cd103、itgal、cd1la、lfa-1、itgam、cd1lb、itgax、cd1lc、itgb1、cd29、itgb2、cd18、lfa-1、itgb7、nkg2d、tnfr2、trance/rankl、dnam1(cd226)、slamf4(cd244、2b4)、cd84、cd96(tactile)、ceacam1、crtam、ly9(cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、cd69、slamf6(ntb-a、ly108)、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、blame(slamf8)、selplg(cd162)、ltbr、lat、gads、slp-76、pag/cbp、cd19a，与cd83、cd27、cd28、icos、4-1bb、cd40、rank/trance-r、ox40、tgfbr1、tgfbrii、myd88、尚未列出的其他tnf受体超家族成员特异性结合的配体，及他们的组合。[0070]1.2.4小分子可控的嵌合抗原受体[0071]在一些情况下，提供一种控制靶向转导细胞的手段可为有利的。在一些情况下，这可作为防止细胞活性过度的安全保护。在其他情况下，可控制转导细胞的活性以用于治疗目的。因此，本公开提供了car或类似的靶向受体，例如tcr融合物，所述tcr融合物可通过使用小分子来控制。当慢病毒载体编码此种可控靶向受体时，施用小分子将允许激活靶向受体以将转导细胞靶向靶细胞，而停止施用小分子将阻止受体将转导细胞靶向靶细胞。以此方式，通过向受试者施用慢病毒颗粒而产生的体内til将仅在小分子存在于受试者中时活化。小分子可全身地或局部地提供，并在与施用慢病毒颗粒的同时或之后的期间内提供。可通过血样、活检或医学成像监测til的活性，并且如果观察到活性过度，则撤回小分子。在一些情况下，小分子的脉冲或间歇施用可用于优化治疗方案。在一些情况下，小分子将被滴定以调节til活性。在一些情况下，响应于肿瘤的缓解或复发或出于其他治疗原因，小分子可被撤回或施用。[0072]在一些情况下，靶向受体(例如car)可被配置成通过融合到蛋白质亚基中来由小分子控制，所述蛋白质亚基在小分子存着的情况下诱导二聚化，或在小分子不存在的情况下诱导二聚化，并且在去除、降解或稀释小分子时回到单体状态。设想在异源二聚靶向受体的情况下，可对t细胞/nk细胞活化受体进行修饰，使得靶向受体的一个单元的胞外结构域包含诱导二聚化的蛋白质亚基的一个单体，并且靶向受体的另一个单元的胞外结构域包含诱导二聚化的蛋白质亚基的其他单体。异源二聚靶向受体可以使用诱导二聚化的同源二聚蛋白质亚基或诱导二聚化的异源二聚蛋白质亚基的这种方式来修饰。在其他情况下，同源二聚靶向受体可以使用诱导二聚化的同源二聚蛋白质亚基或诱导二聚化的异源二聚蛋白质亚基的这种方式来修饰。如果小分子可控靶向受体是同源二聚体，则其可由单个转基因编码；如果是异源二聚体，则其可由两个转基因编码。[0073]诱导二聚化的蛋白质亚基的实例包括但不限于fk506结合蛋白(fkbp)和fkbp12-雷帕霉素结合(frb)结构域。fk506结合蛋白在他克莫司(fk506)存在下二聚化。fkbp12-雷帕霉素结合(frb)结构域在雷帕霉素存在下二聚化。因此，根据本公开的小分子可为他克莫司、雷帕霉素或拉帕洛(雷帕霉素类似物)。可控制小分子可控受体的小分子的其他实例包括但不限于雷帕霉素、拉帕洛、香豆霉素、赤霉素、脱落酸(aba)、甲氨蝶呤、环孢霉素a、fkcsa、甲氧苄啶(tmp)-fkbp的合成配体(slf)或其任何衍生物。适于作为本公开的受体中的融合蛋白的示例性结构域对包括但不限于选自以下的对：fkbp和frb、fkbp和钙调磷酸酶、fkbp和亲环蛋白、fkbp和细菌dhfr、钙调磷酸酶和亲环蛋白、pyl1和abi1、或gib1和gai、或其变体。[0074]在一些情况下，小分子可控靶向受体包含胞外结构域，所述胞外结构域包含一个或多个小分子结合结构域。小分子与一个或多个胞外结构域的结合导致受体分子的分子内相互作用(例如，同源二聚化或异源二聚化)，从而激活与靶细胞的结合和/或来自一个或多个胞内结构域的下游信号。小分子可控受体的一个或多个胞内结构域可包含选自以下结构域或片段中的一个或多个结构域：cd28、ox-40、4-1bb/cd137、cd2、cd7、cd27、cd30、cd40、程序性死亡-1(pd-1)、诱导性t细胞共刺激因子(icos)、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1、cd1-1a/cd18)、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd3ζ、cd247、cd276(b7-h3)、light、(tnfsf14)、nkg2c、igα(cd79a)、dap-10、fcγ受体、mhc1类分子、tnf受体蛋白、免疫球蛋白、细胞因子受体、整合素、信号传导淋巴细胞活化分子(slam蛋白)、活化nk细胞受体、btla、toll配体受体、icam-1、b7-h3、cds、icam-1、gitr、baffr、light、hvem(lightr)、kirds2、slamf7、nkp80(klrf1)、nkp44、nkp30、nkp46、cd19、cd4、cd8α、cd8β、il-2rβ、il-2rγ、il-7rα、il-21rα、itga4、vla1、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cd1ld、itgae、cd103、itgal、cd1la、lfa-1、itgam、cd1lb、itgax、cd1lc、itgb1、cd29、itgb2、cd18、lfa-1、itgb7、nkg2d、tnfr2、trance/rankl、dnam1(cd226)、slamf4(cd244、2b4)、cd84、cd96(tactile)、ceacam1、crtam、ly9(cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、cd69、slamf6(ntb-a、ly108)、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、blame(slamf8)、selplg(cd162)、ltbr、lat、gads、slp-76、pag/cbp、cd19a，与cd83、cd27、cd28、icos、4-1bb、cd40、rank/trance-r、ox40、tgfbr1、tgfbrii、myd88、cd40和任何其他tnf受体超家族成员特异性结合的配体，及他们的组合。其他示例性可控car是由美国专利号10,196,444提供，该专利通过引用的方式并入本文。[0075]在一些实施方案中，诱导二聚化的两个蛋白质亚基各自分别融合到包含一个或多个信号传导结构域的跨膜蛋白和结合剂(例如单链可变片段，scfv)。结合剂能够特异性结合到目标靶上。小分子诱导的二聚化重构了二聚单元，所述二聚单元经由跨膜蛋白的跨膜区从结合剂穿过二聚化蛋白质亚基到达一个或多个胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，采用两种跨膜蛋白，并且其响应于一个或两个小分子而彼此诱导二聚化并诱导二聚化为结合剂融合蛋白。在一些实施方案中，小分子可控car包含两种或更多种结合剂融合蛋白，其各自单独二聚化为包含一个或多个信号传导结构域的跨膜蛋白。[0076]1.4启动子和基因控制元件[0077]本公开还设想了慢病毒载体，所述慢病毒载体包含对t细胞、nk细胞、或t细胞和nk细胞有特异性的启动子和/或增强子。本公开提供了t细胞和/或nk细胞特异性启动子的核酸序列(seqidno：1-4)。这些核酸序列通常可通过将启动子序列插入由慢病毒载体编码的基因的5′处来可操作地连接到t细胞/nk细胞活化受体。所用的启动子可与seqidno：1-4中列出的序列相同，或与seqidno：1-4中列出的序列80％、85％、90％、95％或99％相同，只要启动子在t细胞和/或nk细胞中保持启动子活性即可。[0078]在一些情况下，其他启动子可用于控制t细胞/nk细胞活化受体的表达。本公开中有用的启动子的实例包括但不限于mnd启动子、t细胞特异性启动子、cd4t细胞特异性启动子、cd8t细胞特异性启动子、nk细胞特异性启动子、t细胞和nk细胞特异性启动子、cd4t细胞和nk细胞特异性启动子、以及cd8t细胞和nk细胞特异性启动子。[0079]在一些情况下，使用“强”启动子。应当理解，启动子的强度部分取决于该启动子在细胞中操作的该细胞的属性。在一些情况下，本公开的强启动子导致其在靶细胞(诸如til)中可操作地连接到的基因元件的高水平表达。强启动子包括但不限于巨细胞病毒(cmv)和鼠干细胞病毒(mscv)、磷酸甘油酸激酶(pgk)、由cmv增强子和部分鸡β肌动蛋白启动子和兔β珠蛋白基因(cag)构成的启动子序列、由部分sv40启动子和cd43启动子(sv40/cd43)构成的启动子序列、以及含有具有骨髓增生性肉瘤病毒增强子(mnd)的修饰的momulvltr的u3区的合成启动子。本公开的组合物和方法中有用的示例性强启动子由jones等人lentiviralvectordesignforoptimaltcellreceptorgeneexpressioninthetransductionofperipheralbloodlymphocytesandtumor-infiltratinglymphocytes.humgenether.2009年6月；20(6)：630-40提供。[0080]在一些情况下，强启动子可为合成的强启动子。示例性合成的强启动子由schlabach等人(2010)procnatlacadsciusa.10：2538-2543提供。在一些情况下，使用其他启动子。在一些情况下，使用在包装细胞系中有活性的任何启动子。在一些情况下，使用诱导型启动子，例如药物诱导型启动子。[0081]在一些情况下，本公开的载体可包含土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(wpre)或与wpre大体相同的核酸序列。参见，美国专利号6,136,597；lee等人(2005)expphysiol.90：33-7。具有减小尺寸的wpre元件的变体是本领域中已知的。wpre-o是指具有中等尺寸的wpre的变体。[0082]在一些情况下，本公开的慢病毒载体可包含编码2a肽的核苷酸序列。术语“2a肽”是指被配置成从单个开放阅读框生成两种或更多种蛋白质的自裂解肽。2a肽是在真核细胞中介导翻译期间多肽的“裂解”的18至22个残基长的病毒寡肽。“2a肽”可指代具有不同氨基酸序列的肽。在本公开中，应当理解，在慢病毒载体包含两个或更多个2a肽的情况下，2a肽可彼此相同或不同。用于设计和使用2a肽的详细方法由szymczak-workman等人(2012)coldspringharb.protoc.2012：199-204提供。在文献中，2a肽经常被称为自裂解肽，但机制研究表明，所观察到的“自裂解”实际上是核糖体跳过了在2a肽c端处形成甘氨酰脯氨酰肽键的结果。donnelly等人(2001)jgenvirol.82：1027-41。[0083]在一些情况下，本公开的慢病毒载体可包含土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(wpre)或与wpre大体相同的核酸序列。参见lee等人optimizingregulatablegeneexpressionusingadenoviralvectors.expphysiol.90(1)：33-7(2005)。在本公开的病毒载体中，wpre序列增加由所述病毒载体递送的基因的表达。[0084]1.5融合糖蛋白[0085]各种融合糖蛋白可用于假型化慢病毒载体。虽然最常用的实例是来自水泡性口炎病毒(vsvg)的包膜糖蛋白，但许多其他病毒蛋白也用于慢病毒载体的假型化。参见joglekar等人(2017)humangenetherapymethods28：291-301。本公开设想了各种融合糖蛋白的取代。值得注意的是，一些融合糖蛋白导致载体效率更高。[0086]在一些实施方案中，对融合糖蛋白或其功能变体进行假型化有助于靶向转导特定的细胞类型，包括但不限于t细胞或nk细胞。在一些实施方案中，融合糖蛋白或其功能变体是以下的一个或多个全长多肽、一个或多个功能片段、一个或多个同源物、或一个或多个功能变体：人免疫缺陷病毒(hiv)gp160、鼠白血病病毒(mlv)gp70、长臂猿白血病病毒(galv)gp70、猫白血病病毒(rd114)gp70、双嗜性逆转录病毒(ampho)gp70、10a1mlv(10a1)gp70、亲嗜性逆转录病毒(eco)gp70、狒狒猿白血病病毒(baev)gp70、麻疹病毒(mv)h和f、尼帕病毒(niv)h和f、狂犬病病毒(rabv)g、莫科拉病毒(mokv)g、埃博拉扎伊尔型病毒(eboz)g、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(lcmv)gp1和gp2、杆状病毒gp64、基孔肯雅病毒(chikv)e1和e2、罗斯河病毒(rrv)e1和e2、塞姆利基森林病毒(sfv)e1和e2、辛德毕斯病毒(sv)e1和e2、委内瑞拉马脑炎病毒(veev)e1和e2、西方马脑炎病毒(weev)e1和e2、甲型、乙型、丙型或丁型流感病毒ha、禽瘟疫病毒(fpv)ha、水泡性口炎病毒vsv-g、或金迪普拉病毒和皮里病毒cnv-g和prv-g。在一些情况下，融合糖蛋白或其功能变体是以下的g蛋白的全长多肽、功能片段、同源物或功能变体：阿拉戈斯水泡性口炎病毒(vsav)、卡拉加斯水泡性病毒(cjsv)、金迪普拉水泡性病毒(chpv)、可卡耳水泡性病毒(cocv)、印第安纳水泡性口炎病毒(vsiv)、伊斯法罕水泡性病毒(isfv)、马拉巴水泡性病毒(marav)、新泽西水泡性口炎病毒(vsnjv)、下刚果热病毒(basv)。在一些实施方案中，融合糖蛋白或其功能变体是可卡耳病毒g蛋白。[0087]1.6检查点抑制配体[0088]在一些情况下，本公开的慢病毒载体还包含编码检查点抑制配体的核酸序列。任选地，检查点抑制配体能够阻断pd-1/pd-l1检查点。任选地，检查点抑制配体能够阻断tim-3检查点。[0089]检查点抑制剂疗法是一种癌症治疗形式，其使用剂来刺激或抑制免疫检查点，从而调节免疫反应。肿瘤可使用检查点来保护自身免受受试者免疫系统或癌症免疫疗法中使用的治疗剂的影响。本公开提供了一种慢病毒载体，所述慢病毒载体包含编码检查点抑制配体的核酸序列，其中由慢病毒载体产生的慢病毒颗粒在其表面上展示检查点抑制配体，且因此，施用慢病毒颗粒导致检查点抑制配体递送到受试者的治疗使用部位处。本公开还提供了慢病毒载体，所述慢病毒载体包含编码检查点抑制配体的核酸序列，其中施用由慢病毒载体产生的慢病毒颗粒将多核苷酸序列递送到靶细胞，然后所述多核苷酸序列在治疗使用的部位处表达检查点抑制配体。[0090]本公开提供的检查点抑制剂配体的实例包括但不限于抗ctla-4抗体、抗pd-1抗体和抗pd-l1抗体或分别与ctla4、pd-1或pd-l1相互作用的任何非抗体配体(例如纳米体、darpin)。在一些情况下，检查点抑制配体能够阻断pd-1/pd-l1检查点和/或tim-3检查点和/或ctla-4检查点。检查点抑制的使用于例如，anderson等人tim-3：anemergingtargetinthecancerimmunotherapylandscape.cancerimmunolres.2014年5月；2(5)：393-8中综述。[0091]1.5对免疫抑制药物的耐药性[0092]在一些情况下，本公开的慢病毒载体还包含提供对免疫抑制药物的耐药性的核酸序列(例如，在转移质粒上)。在一些情况下，当在用于治疗受试者的任何方法或用于扩增能够识别和杀死由本公开提供的有此需要的受试者中肿瘤细胞的t细胞的任何方法期间向患者施用免疫抑制药物时，提供对免疫抑制药物的耐药性的核酸序列将促进靶细胞的选择性扩增。在一些情况下，免疫抑制药物是甲氨蝶呤、雷帕霉素、拉帕洛、他克莫司、环孢霉素或其任何组合。免疫抑制药物可与小分子相同或不同，即慢病毒载体可被设计成使得由免疫抑制药物诱导小分子可控的t细胞/nk细胞活化受体，使得每当向受试者施用免疫抑制药物时，都触发转导细胞的扩增。可替代地，设计慢病毒载体以允许在不受免疫抑制的情况下控制转导细胞的扩增可为有利的。[0093]在一些情况下，慢病毒载体有助于通过赋予转导细胞对免疫抑制药物的耐药性来选择性扩增靶细胞，有助于选择性扩增靶细胞。本公开提供了慢病毒载体，所述慢病毒载体包含赋予对本领域已知的免疫抑制药物的耐药性的任何核酸序列。免疫抑制药物的实例包括但不限于雷帕霉素或其衍生物、拉帕洛或其衍生物、他克莫司或其衍生物、环孢霉素或其衍生物、甲氨蝶呤或其衍生物、和霉酚酸酯(mmf)或其衍生物。各种耐药性基因是本领域中已知的。对雷帕霉素的耐药性可由编码蛋白结构域frb的多核苷酸序列赋予，见于mtor结构域中并且已知是fkbp-雷帕霉素复合物的靶标。对他克莫司的耐药性可由编码钙调磷酸酶突变体cna22或钙调磷酸酶突变体cnb30的多核苷酸序列赋予。对环孢霉素的耐药性可由编码钙调磷酸酶突变体cna12或钙调磷酸酶突变体cnb30的多核苷酸序列赋予。这些钙调磷酸酶突变体描述于brewin等人(2009)blood114：4792-803中。对甲氨蝶呤的耐药性可由二氢叶酸还原酶(dhfr)的多种突变体形式提供，参见volpato等人(2011)jmolrecognition24：188-198，并且对mmf的耐药性可由肌苷一磷酸脱氢酶(impdh)的多种突变体形式提供，参见yam等人(2006)molther14：236-244。[0094]通常在act之前、期间和/或之后使用免疫抑制药物。在一些情况下，使用免疫抑制药物可改善治疗效果。在一些情况下，使用免疫抑制药物可减少治疗的副作用，诸如但不限于急性移植物抗宿主病、慢性移植物抗宿主病以及移植后淋巴增生性疾病。本公开设想了将免疫抑制药物与治疗或预防本公开的疾病或病状的任何方法一起使用，所述方法包括但不限于本公开的方法，其中慢病毒载体赋予转导细胞对免疫抑制药物的耐药性。[0095]2.1包装细胞系[0096]在另一方面，本公开提供了用于产生能够激活并有效转导t细胞的慢病毒颗粒的包装细胞系，所述包装细胞系包含能够包装慢病毒载体的培养细胞，其中所培养的细胞被基因工程改造以表达t细胞活化或共刺激分子，或被诱导以经由瞬时转染瞬时表达t细胞活化或共刺激分子。本公开的包装细胞系可与任何慢病毒载体一起使用，包括但不限于先前描述的那些。在一些情况下，使用具有包含编码t细胞/nk细胞活化受体的核酸序列的慢病毒载体的包装细胞系将是有利的。在一些情况下，t细胞/nk细胞活化受体能够被小分子激活将是有利的。但是，所公开的包装细胞系也可与其他慢病毒载体一起使用。[0097]在一些情况下，包装细胞系是hek-293t细胞系。类似的结果可在其他细胞系中实现，包括但不限于被设计成缺乏b2m或其他免疫活性表面蛋白的hek-293t细胞系。可使用可在体外转染且能够产生高滴度慢病毒载体的其他细胞系-例如，包含可操作地连接到启动子上的多瘤病毒大t抗原基因序列的细胞系。[0098]在一些情况下，包装细胞系可经基因修饰以缺乏mhci类表达、mhcii类表达或抑制性检查点配体(诸如pd-l1(pd-1配体)或tim3配体)的表达。因为由包装细胞系表达抑制性配体可限制慢病毒颗粒对t细胞的活化，所以这些基因修饰在一些情况下起到消除此类抑制信号的作用，从而进一步促进慢病毒颗粒对t细胞的活化和转导。[0099]在一些情况下，包装细胞系经基因工程改造以包含适用于将慢病毒载体包装成慢病毒颗粒的一个或多个基因。在一些情况下，包装细胞系可包含编码基因gag-pol、env和rev的多核苷酸序列。在本发明的典型慢病毒载体中，一个或多个gag-pol和env蛋白编码区中的至少一部分可从慢病毒载体中移除并由包装细胞系提供。慢病毒载体可根据dull等人(1998)jvirol72：8463-71(其整体并入本文)中所提供的方法包装。示例性包装细胞系提供于retroviruses.coldspringharbourlaboratory(coffin等人，编)(1997)中。[0100]本公开还提供对包装细胞系进行基因工程改造，以便以其他方式改善本公开的慢病毒载体和颗粒的免疫属性，所述其他方式包括但不限于添加基因、删除基因及将点突变引入基因中。[0101]2.2t细胞活化或共刺激分子[0102]按照惯例，慢病毒体外转导需要另外的外源活化剂，诸如“刺激珠”，例如，dynabeadstm人t-活化因子cd3/cd28。使用本公开的包装细胞系制得的慢病毒颗粒将由包装细胞系表达的t细胞活化或共刺激分子的一个或多个拷贝并入到慢病毒颗粒中；并且将一个或多个t细胞活化或共刺激分子并入到慢病毒颗粒中将使慢病毒颗粒能够在没有外源性活化剂(即没有刺激珠或等效剂)的情况下激活并有效转导t细胞。这允许由这些包装细胞系制得的慢病毒颗粒可在外源性递送活化剂可能不切实际的情况下在体内使用。[0103]在一些情况下，t细胞活化或共刺激分子可选自由以下组成的组：抗cd3抗体、cd28配体(cd28l)和41bb配体(41bbl或cd137l)。各种t细胞活化或共刺激分子是本领域中已知的，并且包括但不限于特异性结合t细胞表达蛋白cd3、cd28、cd134(也称为ox40)或41bb(也称为4-1bb或cd137或tnfrsf9)的剂。例如，特异性结合cd3的剂可为抗cd3抗体(例如，okt3、cris-7或i2c)或抗cd3抗体的抗原结合片段。在一些方面中，特异性结合cd3的剂是抗cd3抗体的单链fv片段(scfv)。在一些情况下，本公开设想了t细胞活化或共刺激分子选自由以下组成的组：抗cd3抗体、cd28配体(cd28l)和41bb配体(41bbl或cd137l)。cd86(也称为b7-2)是cd28和ctla-4的配体。在某些情况下，cd28l可为cd86。cd80是cd28的另一个配体。在一些情况下，cd28的配体是cd80。在一些情况下，cd28的配体是融合至跨膜结构域以展示在慢病毒颗粒表面上的抗cd28抗体或抗cd28scfv。包含一个或多个t细胞活化或共刺激分子的慢病毒颗粒可通过wo2016/139463提供的方法制备。[0104]3慢病毒颗粒[0105]在另一方面，本公开还提供了慢病毒颗粒，所述慢病毒颗粒包含本公开的任意慢病毒载体。本公开的慢病毒颗粒可用本公开的包装细胞系或另一包装细胞系来制备，或通过培养细胞(例如hek-293t细胞)与慢病毒载体和辅助质粒的共转染来制备。本公开的慢病毒颗粒可通过例如将本公开的慢病毒载体转导到经基因工程改造以表达t细胞活化或共刺激分子的培养细胞中来制备。在一些情况下，由于慢病毒载体、所选择的包装细胞系或共转染的辅助质粒，慢病毒颗粒将包含t细胞活化或共刺激分子，所述分子可以是但不限于抗cd3抗体、cd28配体或41bb配体。经基因工程改造以表达t细胞活化或共刺激分子的培养细胞可为hek-293t细胞。在一些情况下，所培养的细胞经基因修饰以缺乏mhci类表达、mhcii类表达或抑制性检查点配体诸如pd-l1(pd-1配体)或tim3配体的表达。[0106]4使用方法[0107]在另一方面，本公开提供了用于治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用本公开的任何慢病毒颗粒，以及向受试者施用小分子，其中在受试者中治疗癌症。[0108]在一些实施方案中，本公开提供了一种用于疗法中的表面工程改造的慢病毒颗粒。在其他实施方案中，本公开提供了一种用于治疗癌症的方法中的表面工程改造的慢病毒颗粒。在其他实施方案中，本公开提供了一种用于制造治疗癌症的药剂的表面工程改造的慢病毒颗粒。[0109]在一些情况下，癌症是实体肿瘤，诸如黑色素瘤、非小细胞肺癌或乳腺癌。本公开的方法可包括治疗任何癌症，包括但不限于急性粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、腺癌、腺肉瘤、肾上腺癌、肾上腺皮质癌、肛门癌、间变性星形细胞瘤、血管肉瘤、阑尾癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、b细胞淋巴瘤、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨髓癌、肠癌、脑癌、脑干胶质瘤、脑瘤、乳腺癌、类癌瘤、宫颈癌、胆管癌、软骨肉瘤、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病、结肠癌、结直肠癌、颅咽管瘤、皮肤淋巴瘤、皮肤黑色素瘤、弥漫性星形细胞瘤、导管原位癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、上皮样肉瘤、食管癌、尤文式肉瘤(ewingsarcoma)、肝外胆管癌、眼癌、输卵管癌、纤维肉瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠道癌、胃肠道类癌、胃肠道间质瘤、普通生殖细胞瘤、妊娠滋养细胞疾病、多形性胶质母细胞瘤、胶质瘤、毛细胞白血病、头颈部癌、血管内皮瘤、霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、下咽癌、浸润性导管癌、浸润性小叶癌、炎性乳腺癌、肠癌、肝内胆管癌、侵袭性/浸润性乳腺癌、胰岛细胞癌、颌部癌、卡波西肉瘤(kaposisarcoma)、肾癌、喉癌、平滑肌肉瘤、软脑膜转移瘤、白血病、唇癌、脂肪肉瘤、肝癌、小叶原位癌、低度星形细胞瘤、肺癌、淋巴结癌、淋巴瘤、男性乳腺癌、髓样癌、髓母细胞瘤、黑色素瘤、脑膜瘤、默克尔细胞癌、间充质软骨肉瘤、间质瘤、间皮瘤、转移性乳腺癌、转移性黑色素瘤、转移性鳞状颈癌、混合性胶质瘤、口腔癌(mouthcancer)、粘液癌、黏膜黑色素瘤、多发性骨髓瘤、蕈样肉芽肿、骨髓增生异常综合征、鼻腔癌、鼻咽癌、颈部癌、神经母细胞瘤、神经内分泌肿瘤、非霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、燕麦细胞癌、眼癌、眼部黑色素瘤、少突胶质瘤、口癌、口腔癌(oralcavitycancer)、口咽癌、骨原性肉瘤、骨肉瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞瘤、卵巢原发性腹膜癌、卵巢性索间质瘤、佩吉特病(paget′sdisease)、胰腺癌、乳头状癌、鼻窦癌、甲状旁腺癌、盆腔癌、阴茎癌、周围神经癌、腹膜癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、毛细胞星形细胞瘤、松果体区肿瘤、松果体母细胞瘤、垂体瘤、初级中枢神经系统、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂癌、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、肉瘤、骨、肉瘤、软组织、肉瘤、子宫、鼻窦癌、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、脊椎癌、脊柱癌、脊髓癌、脊椎肿瘤、鳞状细胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、t细胞淋巴瘤、睾丸癌、喉癌、胸腺癌(thymoma/thymiccarcinoma)、甲状腺癌、舌癌、扁桃体癌、移行细胞癌、移行细胞癌、移行细胞癌、三阴性乳腺癌、输卵管癌、肾小管癌、未诊断癌、输尿管癌、输尿管癌、尿道癌、子宫腺癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌。[0110]在另一方面，本公开提供了一种用于扩增能够识别并杀死有此需要的受试者中肿瘤细胞的t细胞的方法，所述方法包括以下步骤：向受试者施用本公开的慢病毒颗粒，使得能够识别并杀死受试者中肿瘤细胞的t细胞通过慢病毒颗粒得以转导并扩增。在一些实施方案中，通过静脉内注射或通过瘤内注射施用慢病毒颗粒。[0111]在一些情况下，慢病毒颗粒包含靶向剂或编码靶向剂的核酸载体。示例性靶向剂包括抗体和嵌合抗原受体(“car”)。术语“抗体”是指任何种类的完整抗原结合免疫球蛋白或其自身特异性结合抗体靶抗原的片段，并且包括例如嵌合、人源化、全人和双特异性抗体。在一些情况下，本公开中使用的car包含对b细胞有特异性的结合结构域，例如对可见于b细胞淋巴瘤上的cd标记(诸如cd19、cd22、cd20或cd79a，优选为cd19)具有特异性。在wo2007/131092中例示经基因工程改造以表达car(例如，t细胞car)的t细胞。在一些情况下，靶向剂用于将细胞介导的免疫导向其他特定的细胞类型，诸如肿瘤细胞。[0112]在另一方面，本公开提供了用于扩增能够识别并杀死有此需要的受试者中肿瘤细胞的t细胞的方法，所述方法包括向受试者施用本公开的任何慢病毒颗粒，以及向受试者施用小分子，其中能够识别并杀死受试者中肿瘤细胞的t细胞得到扩增。[0113]在某些实施方案中，通过本文所述的方法治疗的受试者可为哺乳动物。在一些情况下，受试者是人、非人灵长类动物、猪、马、奶牛、狗、猫、兔子、小鼠或大鼠。受试者可为人类女性或人类男性。[0114]本发明还设想了组合疗法。如本文所用，组合包括同时治疗或顺序治疗。特别设想了本发明的方法与标准医学治疗(例如皮质类固醇)的组合，与新型疗法的组合也是如此。在一些情况下，可使用类固醇(例如强的松、泼尼松龙(prednisolone)、地塞米松)治疗受试者，以防止或减少对施用本文所述的慢病毒颗粒的免疫反应。在某些情况下，如果受试者表达对本文所述的慢病毒颗粒的抗体，则受试者可接受单采或另一种免疫调节剂。在一些情况下，此类免疫调节剂可能是不必要的，特别是在施用免疫抑制剂(例如他克莫司或西罗莫司)时。在一些情况下，与用慢病毒颗粒的治疗同时或顺序施用利妥昔单抗。在一些情况下，利妥昔单抗可用于阻断针对慢病毒颗粒的免疫反应。[0115]本公开的慢病毒颗粒、小分子和免疫抑制药物可通过任何途径施用，包括经口、经鼻、静脉内、动脉内、肌肉内或腹腔内途径。在一些情况下，通过静脉内注射或通过瘤内注射施用慢病毒颗粒。在一些情况下，通过静脉内注射或经口服施用来施用小分子。在一些情况下，以足以激活t细胞/nk细胞活化受体的浓度施用小分子。在一些情况下，小分子是雷帕霉素，任选地以足以维持雷帕霉素的血清浓度大于0.1nm、1nm或10nm的浓度施用。在一些情况下，小分子是拉帕洛，任选地以足以维持拉帕洛的血清浓度大于0.1nm、1nm或10nm的浓度施用。在一些情况下，小分子能够引起t细胞/nk细胞活化受体的二聚化，从而产生细胞活化信号。[0116]在一些情况下，小分子与慢病毒颗粒同时施用；或小分子在施用慢病毒颗粒之前或之后约30分钟、约1小时、约2小时、约4小时、约5小时或约10小时施用。在一些情况下，方法还包括向受试者施用免疫抑制剂。在一些情况下，免疫抑制剂是他克莫司，任选地以足以维持他克莫司的血清浓度大于0.1nm、1nm或10nm的浓度施用。在一些情况下，免疫抑制剂是环孢霉素，任选地以足以维持环孢霉素的血清浓度大于0.1nm、1nm或10nm的浓度施用。在一些情况下，免疫抑制剂是免疫抑制药物。在一些情况下，免疫抑制剂是免疫抑制药物，并且慢病毒载体包含编码提供针对所述免疫抑制药物的耐药性的蛋白质的核酸序列。[0117]适于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。在所有情况下，该形式必须是无菌的且必须具有一定的流动性，以达到易于注射的目的。该形式在制造和储存条件下必须稳定，并且必须进行防腐以防止诸如细菌和真菌的微生物的污染作用。载剂可为溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、其合适的混合物、和植物油。适当的流动性可例如，通过使用诸如卵磷脂的包衣，通过在分散液的情况下维持需要的粒度以及通过使用表面活性剂来保持。防止微生物的作用可通过各种抗细菌和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞(thimerosal)等)来达成。在许多情况下，最好包括等张剂，例如糖或氯化钠。可通过使用延迟吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶，实现可注射组合物的吸收延长。[0118]通过以下方式制备无菌可注射溶液：根据需要将raav以所要求的量与上文列举的各种其他成分一起并入适当的溶剂中。可注射溶液可以无菌制备或过滤灭菌。[0119]5定义[0120]除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。出于本发明的目的，下面定义以下术语。[0121]如本文所用，“293t对照颗粒”或“模拟(293t载体)”是指用慢病毒载体转导293t细胞产生的慢病毒颗粒。如本文所用，“刺激珠”是指在转导期间用于刺激t细胞的珠基试剂。标记“+对照(载体+刺激珠)”是指用刺激珠转导293t对照颗粒。[0122]如本文所用，术语“hatse细胞”或“hatse细胞系”或“hatse-293”是指通过用编码cd86和cd137l的一个或多个慢病毒载体转导293t细胞而产生并且关于高度表达cd86和cd137l的细胞经受荧光活化细胞分选(facs)一次或多次的包装细胞系。标记“(1x分选)hatse细胞载体”是指在对hatse细胞进行一次cd86+/cd173l+双阳性细胞的facs分选后，用慢病毒载体转导hatse细胞而产生的慢病毒颗粒。标记“(2x分选)hatse细胞载体”是指在对hatse细胞进行一次cd86+/cd173l+双阳性细胞的facs分选后，用慢病毒载体转导hatse细胞产生的慢病毒颗粒。[0123]冠词“一个/种(a/an)”和所述在本文中用来指代一个/种或多于一个/种(即，至少一个/种)的冠词的语法对象。以举例的方式，“一个/种要素”是指一个/种要素或多于一个/种要素。[0124]替代方案(例如，“或”)的使用应理解为是指替代方案中的一个、两个或其任何组合。[0125]术语“和/或”应理解为是指一种或两种替代方案。[0126]如本文所用，术语“约”或“大约”是指与参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度相比变化高达15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。在一个实施方案中，术语“约”或“大约”是指关于参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度的±15％、±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％、或±1％的数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度范围。[0127]除非另有说明，任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括所述范围内的任何整数的值，以及在适当情况下，其分数(诸如整数的十分之一和百分之一)。当紧跟在数字或数值前面时，术语“约”是指数字或数值范围的正或负10％。[0128]本说明书全文中，除非上下文另外要求，词语“包含(comprise/comprises/comprising)”将理解为意味着包含规定的步骤、或元素、或步骤或元素的组，但不排除任何其它步骤、或元素、或步骤或元素的组。在特定的实施方案中，术语“包括”、“具有”、“含有”和“包含”同义使用。[0129]“由...组成”是指包括并限于短语“由...组成”之后的任何内容。因此，短语“由...组成”指示所列的元素是必需的或强制性的，并且不可能存在其他元素。[0130]“基本上由...组成”是指包括在短语之后列出的任何元素，并且仅限于不干扰或促成本公开中针对所列元素所指定的活性或作用的其他元素。[0131]在本说明书通篇中提及“一个实施方案”、“实施方案”、“特定的实施方案”、“相关实施方案”、“某个实施方案”、“另一实施方案”或“其他实施方案”或其组合是指结合实施方案加以描述的特定特征、结构或特性包括在本发明的至少一个实施方案中。因此，本说明书通篇在各个地方出现前述短语不必要全部是指相同的实施方案。此外，特定的特征、结构或特性可以任何适合的方式组合在一个或多个实施方案中。[0132]如本文所用，术语“分离的”是指大体或基本上不含通常伴随在其自然状态下的组分的材料。在特定的实施方案中，术语“获得”或“源自”与分离同义使用。[0133]如本文所使用的“受试者”、“患者”或“个体”包括表现出可使用本文所设想的载体、组合物和方法治疗的疼痛的任何动物。合适的受试者(例如患者)包括实验动物(诸如小鼠、大鼠、兔子或豚鼠)、农场动物和家养动物或宠物(诸如猫或狗)。包括非人灵长类动物，并且任选人患者。[0134]如本文所使用的“治疗(treatment/treating)”包括与治疗相关的任何有益或期望的效果。“治疗”并不一定指示完全根除或治愈疾病或病状，或其相关症状。[0135]如本文所用，“防止(prevent)”和类似的词，诸如“防止(prevented)”、“防止(preventing)”等，指示用于防止、抑制或降低病症发生或复发的可能性的方法。如本文所用，“预防”和类似的词还包括在发病或复发之前减轻疾病或病症的强度、效果、症状和/或负担。[0136]如本文所用，病毒或慢病毒颗粒的“治疗有效量”或“有效的量”或“有效量”是指实现有益或期望的预防或治疗结果(包括临床结果)所需的病毒或慢病毒颗粒的量。[0137]“预防性有效量”是指有效实现期望的预防效果的病毒或慢病毒颗粒的量。通常但不一定，因为预防剂量在疾病之前或在疾病早期阶段用于受试者，所以预防有效量少于治疗有效量。[0138]病毒或慢病毒颗粒的“治疗有效量”可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重的因素，以及干细胞和祖细胞在个体中引起期望反应的能力而变化。治疗有效量还是其中病毒的任何毒性或有害效果都超过治疗上有益效果的量。术语“治疗有效量”包括对“治疗”受试者(例如，患者)有效的量。[0139]生理反应的“增加”或“升高”量(例如，电生理活性或细胞活性)通常是“统计上显著”的量，并且可包括1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30倍或更多倍(例如，500、1000倍)(包括介于1与大于1之间的所有整数和小数点，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)未治疗的受试者中活性水平的增加。[0140]生理反应的“降低”或“减小”量(例如，电生理活性或细胞活性)通常是“统计上显著”的量，并且可包括1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30倍或更多倍(例如，500、1000倍)(包括介于1与大于1之间的所有整数和小数点，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)未治疗的受试者中的活性水平的降低。[0141]通过“保持”、或“保留”、或“维持”、或“无变化”、或“无实质性变化”或“无实质性减少”通常是指与由媒介物或对照分子/组合物引起的反应相当的生理反应。相当的反应是参考反应无显著差异或可测量差异的反应。[0142]“受体-配体结合”、“配体结合”和“结合”在本文中可互换使用，意指受体与配体或合成配体之间的物理相互作用。配体结合可通过本领域已知的多种方法来测量(例如，检测与放射性标记配体的缔合)。[0143]如本文所用，术语“特异性结合亲和力”或“特异性结合(specificallybinds/specificallybound/specificbinding)”在说明书和权利要求书中可互换使用，并且是指发生在成对分子种类(例如受体与配体)之间的结合。当两个种类的相互作用产生非共价结合的复合物时，发生的结合通常是静电、氢键结合或亲脂性相互作用的结果。在各种实施方案中，一个或多个种类之间的特异性结合是直接的。在一个实施方案中，特异性结合的亲和力是背景结合(非特异性结合的约2倍、大背景结合的约5倍、背景结合的约10倍、背景结合的约20倍、背景结合的约50倍、背景结合的约100倍、或背景结合的约1000倍或更多倍。[0144]一般来讲，“序列同一性”或“序列同源性”分别是指两个多核苷酸或多肽序列的核苷酸与核苷酸或氨基酸与氨基酸的精确对应。通常，用于测定序列同一性的技术包括确定多核苷酸的核苷酸序列和/或确定由此编码的氨基酸序列，以及将这些序列与第二核苷酸或氨基酸序列进行比较。两个或更多个序列(多核苷酸或氨基酸)可通过测定它们的“同一性百分比”来比较。无论是核酸还是氨基酸序列，两个序列的同一性百分比，是两个比对序列之间的精确匹配数目除以较短序列的长度，再乘以100。例如，还可使用可购自美国国立卫生研究院(nationalinstitutesofhealth)的高级blast计算机程序(包括版本2.2.9)来比较序列信息，从而确定同一性百分比。blast程序基于以下比对方法：karlin和altschul，proc.natl.acad.sci.usa87：2264-2268(1990)并且讨论于altschul等人，j.mol.biol.215：403-410(1990)；karlin和altschul，proc.natl.acad.sci.usa90：5873-5877(1993)；和altschul等人，nucleicacidsres.25：3389-3402(1997)中。简而言之，blast程序将同一性定义为相同的比对符号(通常是核苷酸或氨基酸)的数目除以两个序列中较短符号的总数。程序可用于确定所比较的整个蛋白质长度上的同一性百分比。例如，在blastp程序中，提供了默认参数来用短查询序列优化搜索。程序还允许使用seg过滤器屏蔽由wootton和federhen，computersandchemistry17：149-163(1993)的seg程序确定的查询序列段。期望的序列同一性程度的范围为约80％至100％，以及介于它们之间的整数值。典型地，所公开序列与所要求保护的序列之间的同一性百分比为至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％。[0145]在本文使用的术语“外源性”是指来源于生物体外部的任何分子，包括核酸、蛋白质或肽、小分子化合物等。相比之下，术语“内源性”是指来源于生物体内部的任何分子(即生物体自然产生的)。[0146]本文使用的术语“moi”是指感染复数，也就是剂(例如病毒颗粒)与感染靶标(例如细胞)的比率。[0147]本文所有出版物和提及的专利特此以引用的方式整体并入，如同将每个单独的出版物或专利特定地和单独地指示未以引用的方式并入。在冲突的情况下，以本申请(包括本文中的任何定义)为准。然而，本文所引用的任何参考文献、文章、出版物、专利、专利出版物和专利申请，并不也不应被视为承认或任何形式的建议，它们构成有效的现有技术或形成世界上任何国家的公知常识的一部分。[0148]本文所使用的小节标题仅出于组织性目的并且不解释为限制所描述的主题。[0149]在以下实施例中进一步描述了本发明，所述实施例并不限制权利要求中所述的本发明的范围。[0150]实施例[0151]实施例1：hatse-293包装细胞系[0152]如下生成用于产生慢病毒颗粒的包装细胞系(称为hatse-293)，所述慢病毒颗粒能够激活并有效转导t细胞。构建一种慢病毒载体，所述慢病毒载体包含mnd启动子和2a肽连接的多顺反子开放阅读框，所述多顺反子开放阅读框编码单克隆抗体okt3；cd86和cd137l(抗cd3scfv-2a-cd86-2a-cd137l)的抗cd3单链fv片段(scfv)。将慢病毒载体转导到在细胞培养中生长的hek-293t细胞中，从而致使mnd启动子和多顺反子开放阅读框稳定整合到宿主细胞的基因组中。对所转导的hek-293t细胞进行荧光活化细胞分选(facs)，以筛选出高表达cd86和cd137l的细胞(图2)。由于多顺反子开放阅读框的结构，故cd86+/cd137l+细胞也必然表达抗cd3scfv+。在培养中扩增cd86+/cd137l+细胞群，以产生hatse-293包装细胞系，并将等分试样冷冻以便长期储存和使用。通过流式细胞术证实cd86和cd137的表达(图3)。[0153]用pmnd-gfp慢病毒载体和四种慢病毒包装质粒(pmd2.g、prsv-rev、pmdlg-prre和prrl-goi)共转染hatse-293细胞，并从细胞上清液中收获病毒颗粒以产生慢病毒颗粒(称为hatse颗粒)。作为对照，用pmnd-gfp慢病毒载体和四种慢病毒包装质粒(pmd2.g、prsv-rev、pmdlg-prre和prrl-goi)共转染hek-293t细胞，并从细胞上清液中收获病毒颗粒以产生慢病毒颗粒(293t对照颗粒)。[0154]在存在或不存在外源性t细胞活化刺激物(dynabeadstm人t活化剂cd3/cd28-“刺激珠″)的情况下，将人原代t细胞(2.5x105个细胞)一式两份在moi5或moi20下暴露于hatse颗粒或293t颗粒。通过自动细胞计数器(countesstmii，thermofisher)评估7天内细胞的生长(图3)。暴露于hatse颗粒的细胞的生长类似于用对照颗粒转导的珠刺激的t细胞，并且在第7天为293t对照颗粒的约略两倍大。通过荧光显微镜评估gfp表达(图4)。暴露于hatse颗粒的细胞表现出破裂并显示高gfp表达，类似于用对照颗粒转导的珠刺激的t细胞，这证实了hatse颗粒暴露的t细胞的有效转导，尽管没有暴露于异源性t细胞活化刺激物(即刺激珠)。[0155]实施例2：lenti-raccr[0156]lenti-raccr是一种慢病毒载体，所述慢病毒载体含有编码雷帕霉素激活的嵌合细胞表面受体(raccr)的转基因。具体地，此示例性raccr是由两种融合蛋白制成，这两种融合蛋白被设计成在雷帕霉素存在下二聚化，从而激活信号传导(图12a)。第一融合蛋白是将il-2受体β链(il2rb)的胞质结构域与fk506结合蛋白(fkbp)融合，使得fkbp形成融合蛋白的胞外结构域的结果。第二融合蛋白是将il-2受体γ链(il2rg)的胞质结构域与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mtor)的fkbp-雷帕霉素结合(frb)结构域融合，使得frb形成融合蛋白的胞外结构域的结果。已知胞外结构域在雷帕霉素的存在下形成三聚复合物，致使受体亚基二聚化以形成活性信号传导受体复合物。[0157]raccr-β-fkbp-il2rb融合蛋白，其中信号肽(括号内)具有2a肽(斜体)：[0158][0159]fkbp结构域具有以下序列：[0160][0161]il2rb结构域具有以下序列：[0162][0163]raccr-γ-frb-il2rg融合蛋白，其中信号肽(括号内)具有2a肽(斜体)[0164][0165]frb结构域具有以下序列：[0166][0167]il2rg结构域具有以下序列：[0168][0169]使用标准包装质粒pmd2.g将编码绿色荧光蛋白的慢病毒转移质粒包装成慢病毒颗粒，并将所得慢病毒颗粒用于转导人原代t细胞作为对照实验。只观察到低水平的转导(图12b)。[0170]使用编码t细胞活化和共刺激分子的质粒将编码mcherry的慢病毒转移质粒包装成慢病毒颗粒，从而产生表面工程改造的慢病毒颗粒(se-lvp)。作为对照实验，将所得的慢病毒颗粒(mcherry：se-lvp)用于转导人原代t细胞。只观察到低水平的转导(图12c)。[0171]使用编码t细胞活化和共刺激分子的质粒将编码raccr的慢病毒转移质粒包装成慢病毒颗粒，从而产生表面工程改造的慢病毒颗粒(se-lvp)。将所得的慢病毒颗粒(raccr：se-lvp)用于转导人原代t细胞。只观察到低水平的转导(图12d)。[0172]将用mcherry：se-lvp或raccr：se-lvp转导的人原代t细胞在il-2(“il2”)、雷帕霉素(“rapa”)或无治疗(“nt”)存在下培养。作为对照，使用标准包装质粒pmd2.g包装的mcherry构建体也用il-2测试。在存在雷帕霉素但没有外源性il-2的情况下，raccr：se-lvp介导t细胞持续扩增18天(图12e)。t细胞的扩增依赖于雷帕霉素或il-2的存在(图12f)。这构成了表面工程改造的颗粒可递送生长刺激受体有效载荷并扩增人原代t细胞的体外概念证明。转导不需要慢病毒颗粒的离心(spinoculation)或其他操作。在感染复数(moi)为10时，细胞的转导提供约20％的转导效率。[0173]本领域技术人员仅仅使用常规试验将认识到或者能够确定本文所描述的发明的具体实施方案的很多等效方案。此类等效物意图由以下权利要求涵盖。当前第1页1 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