一种能够促进牙髓干细胞成骨转化的干扰RNA及其应用的制作方法

一种能够促进牙髓干细胞成骨转化的干扰rna及其应用
技术领域
[0001]
本发明涉及牙髓干细胞技术领域，尤其涉及一种能够促进牙髓干细胞成骨转化的干扰rna及其应用。


背景技术：

[0002]
临床上由于牙髓的创伤或者感染引起的牙髓炎或者根尖周炎的传统治疗方法通常采用根管治疗的方法来治疗。然而传统的根管治疗方法存在一定的不足。因此，研究人员基于组织工程原料，提出了牙髓再生治疗。但是作为牙髓再生种子细胞的牙髓干细胞具有多种不同的转化方向，如何促进牙髓干细胞的成骨转化去进一步生产牙齿是急需解决的问题。
[0003]
哺乳动物基因组中，超过90%的基因均转录为非编码rna，在最开始的研究中，研究人员将非编码rna认定为垃圾rna。然而，随着大规模基因组测序的完成，研究人员发现非编码rna在生理过程中发挥关键性作用。长链非编码rna是非编码rna家族中的重要成员，其占人体内全部非编码rna的大部分，lncrna的核苷酸序列长度超过200个核苷酸。lncrna在人体组织内的表达非常广泛，具有较强的特异性。尽管lncrna不能编码蛋白质，但是lncrna几乎参与基因表达调控的每一个层面，涉及转录调控，染色质重塑，细胞内物质运输等多种生物学进程。
[0004]
目前，长链非编码rna loc107985830在牙髓干细胞中的作用尚未见报道。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的在于提供一种能够有效的促进牙髓干细胞成骨转化的促进剂。
[0006]
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：本发明提供了loc107985830功能性表达的抑制剂在制备用于促进牙髓干细胞成骨转化的促进剂中的用途。
[0007]
优选地，所述loc107985830的转录本序列为xr_001739224.1。
[0008]
优选地，所述抑制剂选自loc107985830的shrna或sirna。
[0009]
优选地，所述抑制剂为loc107985830的sirna，所述sirna的正义链为seq id no.4所示，所述sirna的反义链为seq id no.5所述。
[0010]
此外，本发明提供了一种促进牙髓干细胞成骨转化的促进剂，所述促进剂为抑制loc107985830功能性表达的抑制剂，所述抑制剂为sirna，所述sirna的正义链为seq id no.4所示,所述sirna的反义链为seq id no.5所示.此外，本发明提供了一种loc107985830的基因抑制剂，所述抑制剂为loc107985830的sirna，所述sirna的正义链为seq id no.4所示,所示sirna的反义链为seq id no.5所示，所述sirna能够促进牙髓干细胞成骨。
[0011]
此外，本发明提供了一种长链非编码rna，其特征在于，所述长链非编码rna为loc107985830，所述loc107985830的转录本序列为xr_001739224.1，所述loc107985830的
抑制剂能够促进牙髓干细胞成骨。
[0012]
本发明的有益效果在于：本发明首次证明了通过sirna抑制loc107985830能够有效的促进牙髓干细胞的alp活性，细胞钙化以及成骨转化相关基因runx2和ocn的蛋白表达，因此，loc107985830的sirna能够有效的牙髓干细胞的成骨转化，从而为进一步使牙髓干细胞通过成骨转化分化为牙本质去修复牙齿提供基础。
附图说明
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图1 siloc107985830-1，siloc107985830-2，siloc107985830-3对于loc107985830的干扰效果。
[0014]
图2 抑制loc107985830对于alp活性的影响。
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图3 抑制loc107985830对于细胞钙化的影响。
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图4 抑制loc107985830对于成骨转化相关蛋白runx2和ocn的影响。
具体实施方式
[0017]
实施例1（1）将本院收集的8-12岁的牙面形态完整且无龋的牙齿浸入到加有双抗的无菌pbs中进行冲洗，同时将牙根部和颈部所附着的牙周膜等软组织全部去除；（2）沿着牙齿长轴将牙齿纵行劈开，并且在无菌条件下，使用无菌镊子将牙髓组织取出，置于无菌ep管中；（3）使用pbs洗涤3次后，加入500μl pbs并用剪刀将牙髓组织剪碎，将ep管放入离心机中，1500rpm/min离心3分钟，保留沉淀，去除上清；（4）加入i型胶原酶，置于细胞恒温培养箱中，37℃消化60min；（5）加入适量的含10% fbs的完全培养基终止消化，1500rpm/min离心3min，弃去上清，将组织块均匀铺在培养瓶底部，加入含有10%fbs的完全培养基，放于细胞恒温培养箱中，每2-3天更换一次培养基，流式细胞仪鉴定得到牙髓干细胞。
[0018]
实施例21.转染sirna（1）设计loc107985830的sirna表1 sirna序列设计表
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名称序列（5
’-
3
’
）siloc107985830-1ccuacuauguacucaauaagu（seqidno.2） uuauugaguacauaguaggug（seqidno.3）siloc107985830-2caguggaagugauuacuaaga（seqidno.4） uuaguaaucacuuccacugga（seqidno.5）siloc107985830-3gcaccuacuauguacucaaua（seqidno.6） uugaguacauaguaggugcca（seqidno.7）（2）将牙髓干细胞接种于6孔板中，培养过夜后，弃去培养基进行转染，转染分组为空白对照组，si-nc组，siloc107985830-1组，siloc107985830-2组和siloc107985830-3组，每组
设置3个重复。
[0019]
（3）转染48h后，提取rna。
[0020]
2.提取rna（1）在每组细胞中加入1ml trizol，使用移液器吹打细胞并且收集细胞至2ml ep管中，冰上放置10min；（2）将ep管置于离心机中，12000rpm离心5min，将上清转移至新的ep管中；（3）加入200ul氯仿，混匀后，冰上放置15min，置于离心机中，12000rpm离心5min；（4）小心的吸取上清至新的ep管中，加入等体积的预冷异丙醇，冰上放置10min；（5）置于离心机中，12000转离心10min，弃去上清，加入1ml 75%乙醇（depc水配置）溶解沉淀，置于离心机中7500转，4℃，离心5min，去除上清，室温干燥，加入depc水溶解沉淀。
[0021]
3.逆转录获取cdna反应体系：总rna 0.5ug，primescript tm rt mastermix 2ul，ddh2o up to 10ul。
[0022]
反应条件：37℃ 15min；85℃ 5s；4℃ 保存。
[0023]
4.荧光定量pcr（1）引物序列基因名称引物序列产物大小loc107985830agaaccacagacaagggcac（seqidno.8）128 atctccctgttcatgcctgc（seqidno.9） gapdhtctctgctcctcctgttcga（seqidno.10）122 gcgcccaatacgaccaaatc（seqidno.11） （2）反应体系： sybr premix ex taq 5ul； pcr forward primer 0.5ul；pcr reverse primer 0.5ul；cdna 1ul；ddh2o 3ul。
[0024]
（3）反应条件，95℃ 5min；95℃ 10s，60℃ 30s， 40个循环。
[0025]
实验结果如图1所示，从图中可以看出，sinc组的相对表达量为0.975
±
0.020（p=0.5326，差异无统计学意义），si loc10798583-1组的相对表达量为0.241
±
0.061（p=0.0004，差异具有统计学意义），si loc10798583-2组的相对表达量为0.145
±
0.034（p<0.0001，差异具有统计学意义），si loc10798583-3组的相对表达量为0.173
±
0.031（p<0.0001，差异具有统计学意义）。综合上述结果可以看出，si loc10798583-2的抑制效果最优，因此，下文所述si loc10798583均指si loc10798583-2。
[0026]
实施例2（1）将牙髓干细胞接种于96孔板中，每孔2000个细胞，分别转染sinc和si loc10798583，每组设置3个重复；（2）72h后，使用cck-8试剂检测牙髓干细胞的od值。
[0027]
实验结果表明，sinc组的od值为0.568
±
0.008，si loc10798583组的od值为0.637
±
0.053（p值为0.2657，差异不具有统计学意义），因此，si loc10798583对于牙髓干细胞的增殖没有显著的影响。
[0028]
实施例3 alp染色（1）将牙髓干细胞接种于6孔板中，分别转染sinc和siloc107985830，转染后进行成骨诱导；
（2）成骨诱导14天后弃去培养基，使用pbs漂洗3次，每次3min；（3）加入多聚甲醛进行固定，30min后，弃去固定液，加入pbs漂洗3次，每次3min；（4）按照alp染色试剂盒说明书配置染色液，避光染色30min，弃去染色液，pbs漂洗去除剩余染色液，倒置显微镜下观察染色情况。
[0029]
实验结果如图2所示，从图中可以看出，相较于sinc组，si loc107985830组的alp活性显著升高，说明抑制loc107985830能够促进牙髓干细胞alp活性。
[0030]
实施例4 茜素红染色（1）将牙髓干细胞接种于6孔板中，分别转染sinc和siloc10798583,转染后进行成骨诱导；（2）成骨诱导21天后，弃去培养基，使用pbs漂洗3次，每次3min；（3）加入多聚甲醛进行固定，30min，弃去固定液，加入pbs漂洗3次，每次3min；（4）加入茜素红染色10min，弃去染色液，pbs漂洗去除剩余染色液，倒置显微镜下观察染色情况。
[0031]
实验结果如图3所示，从图中可以看出，相较于sinc组，si loc107985830组的钙化水平明显升高，说明抑制loc107985830能够促进牙髓干细胞钙化。
[0032]
实施例5western blot检测蛋白的表达水平1.蛋白样品制备（1）将牙髓干细胞接种于6孔板中，分为sinc和siloc107985830组进行转染，每组设置3个重复；（2）成骨转化14天后，弃去细胞培养基，pbs洗涤3次，每孔加入150ul细胞裂解液，冰上裂解30min；（3）将细胞刮下并转移至1.5ml ep管中，使用超声波细胞破碎仪破碎细胞。
[0033]
（4）4℃，12000rpm条件下，离心20min，取上清至新的ep管中；（5）根据试剂盒说明书，使用bca法检测蛋白浓度，加入5
×
蛋白上样缓冲液使各组蛋白样品的浓度保持一致。
[0034]
2.sds-page蛋白电泳和电转（1）配置10%下层胶和5%上层胶，组装好电泳装置，开始电泳，上层浓缩胶恒压60v，30min，下层分离胶恒压120v，60min，当溴酚蓝条带移至距离分离胶底部约1cm时停止电泳；（2）将胶置于转膜夹中，按照“三明治”模型制作转膜夹，过程中需要排除所有的气泡；（3）安装好转膜装置，并置于冰盒内，倒入转膜液，恒流250ma，90min完成转膜；（4）电转结束后，将pvdf膜取出置于5%的脱脂奶粉中，置于摇床上封闭1h；（5）根据相应的蛋白大小，裁剪pvdf膜，并孵育runx2,ocn和β-actin一抗，4℃摇床孵育过夜；（6）吸取一抗，pbs洗膜三次，每次5min，孵育二抗，室温1.5h；（7）弃去二抗，pbs洗膜三次，每次5min，进行显影曝光。
[0035]
实验结果如图4所示，从图中可以看出，相较于对照组，siloc107985830组runx2和ocn的蛋白表达明显升高，说明抑制loc107985830能够促进牙髓干细胞中runx2和ocn的表达。
[0036]
综上所述，loc107985830基因抑制剂能够促进牙髓干细胞的alp活性，细胞钙化和runx2和ocn蛋白表达，说明loc107985830基因抑制剂能够促进牙髓干细胞的成骨转化。

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